Summary
Vi beskriver her tre forskellige protokoller for in vitro undersøgelse af konjugation, transduktion, og naturlig transformation i Staphylococcus aureus.
Abstract
Et vigtigt træk ved den større opportunistisk humant patogen Staphylococcus aureus er sin ekstraordinære evne til hurtigt udvikler resistens over for antibiotika. Genomiske undersøgelser viser, at S. aureus bærer mange virulens og resistensgener beliggende i mobile genetiske elementer, hvilket antyder, at horisontal genoverførsel (HGT) spiller en kritisk rolle i S. aureus evolution. Men en fuld og detaljeret beskrivelse af metoden til at studere HGT i S. aureus stadig mangler, især med hensyn til naturlig transformation, som for nylig er blevet rapporteret i denne bakterie. Dette arbejde beskriver tre protokoller, som er nyttige til in vitro undersøgelse af HGT i S. aureus konjugation, phag transduktion, og naturlig transformation. Til dette formål, det cfr genet (chloramphenicol / florfenicol modstand), som giver de phenicoler, Lincosamider, Oxazolidinoner, pleuromutiliner, og streptogramin A (PhLOPSA) -resistance fænotype, blev anvendt. Forståelse af de mekanismer, hvorigennem S. aureus overfører genetisk materiale til andre stammer er afgørende for at forstå den hurtige overtagelse af resistens og hjælper med at afklare former for formidling rapporteret i overvågningsprogrammer eller yderligere forudsige spredningen tilstand i fremtiden.
Introduction
Staphylococcus aureus er en kommensal grampositiv bakterie, der naturligt bebor huden og næsehulen af mennesker og dyr. Denne bakterielle arter er den førende årsag til nosokomielle infektioner på hospitaler og sundhedsmiljøerne. Desuden har evnen til at udvikle resistens over for forskellige antimikrobielle forbindelser gjort forvaltningen af infektioner forårsaget af denne bakterie til en global bekymring.
To vigtige veje er involveret i spredningen af resistens fænotyper er kendt: den klonale udbredelse af resistente genotyper og udbredelsen af genetiske determinanter blandt den bakterielle pool. I tilfælde af S. aureus, forskellige antibiotiske resistensgener (samt virulensdeterminanter) har vist sig at være forbundet med mobile genetiske elementer (MGEs) 1. Tilstedeværelsen af disse elementer i genomet af S. aureus viser, at erhvervelse og overdragelse af genietisk materiale inden den bakterielle population kunne spille en vigtig rolle for S. aureus tilpasning og evolution.
Genetisk materiale kan udveksles gennem tre kendte mekanismer HGT i Gram-positive bakterier: transformation, konjugation og fag transduktion. Transformation indebærer optagelse af frit DNA. At erhverve fremmed DNA, bakterieceller nødt til at udvikle en særlig fysiologisk fase: kompetence scenen. Når denne fase nås, kompetente celler er i stand til at transportere DNA ind i cytoplasmaet, erhverve nye genetiske determinanter. I tilfælde af S. aureus, har eksistensen af naturlig transformation nylig blevet demonstreret 2. I tråd med dette har vores gruppe belyse relevansen af ekspressionen af suk faktor (en kryptisk sekundær transskription sigma faktor) i kompetence udviklingstrin og på hvordan dens konstitutiv ekspression gør S. aureus i stand til reaching kompetence scenen, som giver mulighed for erhvervelse af resistente fænotyper ved naturlig transformation 2.
Konjugation er en proces, der involverer overførsel af DNA fra en levende celle (donor) til en anden (recipient). Begge celler skal være i direkte kontakt, således at DNA, der skal udveksles samtidig være beskyttet af særlige strukturer, såsom rør eller porer. Overførsel af DNA ved denne fremgangsmåde kræver konjugative maskiner. I S. aureus, prototypen konjugative plasmid er PGO1, der huser den konjugative operon Traa 3.
Phag transduktion indebærer overførsel af DNA fra celle til celle gennem bakteriofaginfektion og indebærer pakning af bakterie-DNA, i stedet for virus-DNA, ind i fag-capsidet. De fleste af S. aureus isolater lysogeniseret af bakteriofager 1. Ved stressbetingelser, kan profager udskæres fra det bakterielle genome og skift til den lytiske cyklus.
Det er de tre velkendte mekanismer til DNA transmission i S. aureus. Der er nogle ekstra transfer mekanismer, såsom "pseudo-transformation" 2 og fag-lignende systemer i overførslen af sygdomsfremkaldende evne øer 4. For nylig, en gruppe rapporterede, at "nanorør" er involveret i overførslen af cellulære materialer (herunder plasmid-DNA) mellem naboceller 5, 6, men en opfølgende undersøgelse ikke er mødt fra andre grupper hidtil.
Dette arbejde giver den nødvendige metodik til at studere HGT i S. aureus ved at behandle de tre vigtigste transfer veje konjugation, transduktion, og naturlig transformation. De opnåede med disse metoder resultater blev anvendt til at undersøge transmissionen af den cfr gen (chloramphenicol / florfenicol modstand) blandtS. aureus-stammerne 7. Disse tre teknikker er alsidige værktøjer til undersøgelse af MGE transmission i S. aureus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: stammer og materialer, der anvendes i dette arbejde er anført i tabel 1 og tabel Materialer hhv. I transmissions- eksperimenter blev N315 og COL cfr -positive derivater brugt som donorer af den cfr gen (N315-45 og COL-45). Disse stammer blev tidligere opnået ved konjugation, idet der som donor af en klinisk cfr -positiv Staphyloccocus epidermidis-stamme (ST2), efter standarden konjugation protokollen (se nedenfor). Denne stamme nærede den cfr gen på en pSCFS7-lignende plasmid 7.
1. Konjugation Brug af Filter-parring Method
BEMÆRK: En S. aureus N315 stamme, som bærer cfr genet (N315-45) 7 (Cm R) blev anvendt som donor. COL 8 eller Mu50 9 stammer (Tet R, Cm S) blev anvendt som recipienter. Dobbelt-resistente kolonier (Tet R, Cm R) i stand til at vokse i nærvær af 32 mg / l chloramphenicol plus 8 mg / l tetracyclin blev betragtet som formodede transkonjuganter og blev analyseret for at bestemme tilstedeværelsen af cfr ved koloni-PCR og at bestemme modtager følsomhed profil.
- Udfør konjugation efter en tidligere beskrevet protokol 10 med et par ændringer:
- Forbered 5 ml overnatskultur af donoren og modtageren i tryptisk soja-bouillon (TSB) medium (med og uden 32 mg / l chloramphenicol, henholdsvis), under omrystning ved 37 ° C.
- Justér den optiske densitet (OD 600) af de overnatskulturer til 1 (OD 600 = 1,0) ved hjælp af frisk TSB medium. Bland 0,5 ml af donor kultur (N315-45) med 0,5 ml af recipienten kultur (COL eller Mu50). Der tilsættes 1 ml PBS til blandingen.
- Overfør blandingen af bakterier på et 0,45 um filter membran USIng en vakuumpumpe system.
- Læg filteret membraner på et får blod-agarplade. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 dag.
BEMÆRK: I dette trin er nødvendigt beriget medium for at tillade vækst af dobbelt-resistente celler. - Tag filteret membran fra pladen og den suspenderes i 10 ml phosphatpufret saltvand (PBS). Vortex godt at indsamle alle de bakterier, der er knyttet på membranen.
- Lav en seriel 10 ganges fortynding af den bakterielle suspension ved hjælp af frisk TSB. Plate 100 pi af 0-10 -4 fortyndede prøver på TSB agar (TSA)-plader suppleret med 32 mg / l chloramphenicol og 8 mg / l tetracyclin for udvælgelsen af transkonjuganter. Plate 100 pi af den fortyndede suspension (10 -5 -10 -6) på TSA-plader med 8 mg / l tetracyclin alene at tælle det samlede antal modtagere. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 18-24 timer.
- Analyser dobbelt-resistente kolonier (formodede transkonjuganter) for tilstedeværelsen af cfr-gen ved hjælp af koloni-PCR 7 og deres modtagelighed profiler (antibiogram).
- Bestem antibiogram ved at måle de minimale inhibitoriske koncentrationer (MIC) af passende antibiotika ifølge standarden mikrofortynding metode eller disk diffusion metode 11. Følsomheden profil transkonjuganterne skal være identiske med modtageren, bortset fra chloramphenicol (og andre forbindelser, der berøres af cfr genet). Denne bestemmelse er afgørende for at udelukke tetracyclin resistens udviklet af donor stamme.
2. Fag Transduktion
BEMÆRK: bakteriofag MR83a tilhører Siphoviridae familien (laboratorium stamopløsning) blev anvendt i transduktionseksperimenter. N315-45 blev brugt som cfr donor for fag-infektion. N315, COL, eller Mu50 stammer blev anvendt som recipienter. Købet af cfr blev bestemt af ability af modtagerstammen at vokse i nærvær af 32 mg / l chloramphenicol. Kolonier vokser under denne betingelse blev analyseret for at bestemme tilstedeværelsen af cfr (ved koloni-PCR) og til at bestemme modtageligheden profil for at udelukke potentiel forurening.
- Fag forstærkning på donor
- Forbered en overnatskultur af N315-45 i 5 ml næringsvæske suppleret med 3,6 mM Ca2 + (NBCaCl 2) ved 37 ° C under omrystning (180 rpm).
BEMÆRK: Calcium er påkrævet for faginfektion. Se Materialer tabel. Næringsstof bouillon fra andre virksomheder kan have problemer, såsom calcium nedbør. - Forbered subkulturer ved fortynding af natten over kultur 1: 1.000 i et slutvolumen på 10 ml NBCaCl 2 i 50 ml reagensglas, kolber eller hætteglas. Grow bakterierne i 1 time ved 37 ° C under omrystning (180 rpm).
- Forbered en række fortyndet fag MR83a i NBCaCl 2 medium (10 -2, 10 -3, 10 -4, 10 -5 og 10 -6). Tilsæt 20 pi af den fortyndede fag i det bakterielle kultur. Ligeledes udarbejder en kontrolkultur uden faginfektion, der tjener som den positive kontrol for bakterievækst celle og kan anvendes til at bestemme fag-titer den næste dag.
- Grow kulturerne ved 37 ° C med forsigtig rystning (100 opm) natten over.
BEMÆRK: Cellerne vil vokse til en vis grad, når den inficerende fager ikke er i overskud; Derefter vil de gå ind lysis fase på grund af fag-amplifikation gennem den lytiske cyklus. Kulturen uden fag vil vise fuld vækst, mens kulturer med fag vil vise forskellige satser for gennemsigtighed. - Vælg en eller to ryddet kultur hætteglas med den højeste fortynding af den ekstra fag.
- Overfør kulturerne i 15 ml centrifugerør. Tilføj 250 pi chloroform og bland grundigt ved at vende rørene.
- Centrifuger rørene ved 5000
- Overfør supernatanterne til friske rør og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
BEMÆRK: Fagen er stabil i mindst et par måneder, men opbevaring af fagpræparat for længe reducerer titeren og transduktionseffektivitet. - Overfør supernatanterne til friske rør og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
- Forbered en overnatskultur af N315-45 i 5 ml næringsvæske suppleret med 3,6 mM Ca2 + (NBCaCl 2) ved 37 ° C under omrystning (180 rpm).
- Måling fagtiteren (fag plaque assay)
- Forbered næringsmedium agar (1,5% agar) medium; holde det varme i et vandbad ved 55 ° C. Tilføj autoklaveret 0,5 M CaCl2-opløsning til mediet til en slutkoncentration på 3,6 mM. Hæld det i 90 mm petriskåle (NBCaCl 2 plader).
- Forbered en overnatning kultur af N315 i 5 ml NBCaCl 2 ved 37 ° C med omrystning; dette kan være substitueret med kontrolkulturen ovenfor beskrevet (trin 2.1.3).
- Tilsæt 10 pi af overnatskulturen i 200 pi NBCaCl 2 og jævnt fordelt det på NBCaCl 2 plade. Stop spredning, når overfladen afpladen er dækket med væske. Lad pladen tørre.
- Foretag en seriel 1:10 fortynding (fra 10 -5 -10 -10) af tidligere fremstillet fag (trin 2.1.8) under anvendelse NBCaCl 2 medium.
- Spot 3 pi af hver fag fortynding på pladen dækket med bakterier.
- Inkubér pladen natten over ved 30 ° C.
- Tæl plak numre og beregne fagtiteren ved følgende formel: Plaque forming unit (pfu) / ml = antal plaques x fortyndingsfaktor / plettet volumen (3 x 10 -3 ml)
- Fag transduktion
BEMÆRK: Fagen pool fremstillet i det foregående trin (2.1.8) anvendes til at teste transduktionen af FR-genet i S. aureus-stammer. I dette forsøg stammerne N315, COL, eller Mu50 anvendes som modtagerne.- Forbered overnatskultur af N315, COL, eller Mu50 i 5 ml NBCaCl 2 ved 37 ° C under omrystning (180 rpm).
- Fortynd than fagen i NBCaCl 2 til ~ 10 9 pfu / ml.
- I en 50 ml glasbeholder, bland 500 pi overnatskultur, 500 pi frisk NBCaCl 2, og 1 ml fag (~ 10 9 pfu / ml); den forventede multiplicitet af infektion (MOI) må ikke overstige 1. inkuberes blandingen ved 37 ° C med forsigtig rystning (100 rpm) i 30 min.
BEMÆRK: Varmebehandling af recipientceller lige før tilsætningen af fag (52 ° C i 2 min for at inaktivere endogene restriktionsenzymer) kan øge effektiviteten 12. - Tilsæt 50 pi 20% Na 3 -Citrate. Fortsæt forsigtig omrystning i 30 minutter ved 37 ° C.
BEMÆRK: Na 3 -Citrate fungerer som en moderat chelator af calcium. - Forbered smeltet hjerne-hjerte-infusion (BHI) agar (1,5% agar) medium og holde det i et vandbad ved 55 ° C.
- Overfør bakterien-fag blandingen til en 100 ml kolbe, der tilsættes 50 ml varmt BHI agar suppleret med 32 mg / l chloramphenicol, og bland godt. Hæld blandingen i 90 mm petriskåle.
BEMÆRK: Denne metode muliggør påvisning af et lille antal voksende kolonier (formodede transduktanter). - Inkubér pladen ved 37 ° C i 24-48 timer.
- Yderligere teste de genererede kolonier (transduktanter) til modstand ved at overføre kolonierne på nye BHI agarplader suppleret med 32 mg / l chloramphenicol. Bekræfte tilstedeværelsen af den cfr gen ved koloni-PCR 7.
3. Naturlig Transformation
BEMÆRK: Den naturlige transformationsassay i S. aureus blev udført ifølge metoden beskrevet i vores tidligere undersøgelse 2 metode. The N315 derivat, N2-2.1 2, 7, blev anvendt som recipient. I denne stamme blev suk locus duplikeret, så udtrykker konstitutivt Sigh 2. For thefattedes procedurer om hvordan du isolerer suk udtrykker varianter kompetencekrav henvises en tidligere beskrivelse 2. Hvis modstanden markør, der skal overføres, er ikke chloramphenicol, kan pRIT-suk (Cm R) anvendes til at udtrykke suk, som tidligere 2 beskrevne. Oprenset plasmid eller hele DNA ekstrakt fra cfr -acquired S. aureus COL-45 7 anvendes som donor-DNA til transformation.
- Fremstilling af donor-DNA
- Dyrk COL-45 natten over med omrystning ved 37 ° C i en 300 ml kolbe indeholdende 50 ml TSB suppleret med 32 mg / l chloramphenicol. Kultur E. coli HST04 transporterer pHY300 plasmid (TetR) at ekstrahere plasmid til kontroleksperimentet.
BEMÆRK: HST04 (dæmning - / DCM -) mangler den DNA methylase gener 13. Andre traditionelle stammer med DNA methylaser kan også være brugd til fremstilling af DNA-donor, fordi DNA methylering tilstand ikke påvirker transformationseffektiviteten. Alternativt kan pT181 plasmid oprenset fra S. aureus COL-stamme også anvendes som en positiv kontrol for transformationsassay 2. - Opsaml cellerne ved centrifugering (8.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C).
- Uddrag plasmiderne under anvendelse af en plasmid-DNA-ekstraktion kit eller en konventionel DNA rensningsmetode til oprensning hele DNA.
- Kvantificere det oprensede DNA ved spektrometer og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse.
BEMÆRK: Brug en ny DNA-præparat til transformationen assay, sædvanligvis mindre end en uge gamle. Old DNA præparationer reducere effektiviteten af transformation.
- Dyrk COL-45 natten over med omrystning ved 37 ° C i en 300 ml kolbe indeholdende 50 ml TSB suppleret med 32 mg / l chloramphenicol. Kultur E. coli HST04 transporterer pHY300 plasmid (TetR) at ekstrahere plasmid til kontroleksperimentet.
- transformationsassay
- Kultur recipientcellen (N2-2.1) natten over i 5 ml TSB ved 37 ° C under omrystning.
- Overfør 0,5 ml af natten over kultur i et 1,5 ml rør. Precipitate cellerne ved centrifugering (10.000 x g i 1 min ved 4 ° C).
- Suspendere cellerne med 10 ml CS2 medium i et 50 ml rør.
BEMÆRK: CS2 medium er en komplet syntetisk medium, der inducerer kompetence for naturlig transformation i S. aureus 2 (se mediet sammensætning i Material tabel). Andre standard laboratorie medier, såsom TSB eller BHI, er ikke egnede til transformation 2, 13. - Grow bakterierne ved 37 ° C under omrystning (180 rpm), indtil den sene eksponentielle fase (ca. 8 timer).
- Cellerne høstes ved centrifugering (5.000 x g i 5 min ved 4 ° C).
- Resuspender cellerne i 10 ml frisk CS2 medium.
- Tilsæt 10 ug oprenset plasmid eller genom-DNA (trin 3.1.4) til cellesuspensionen. Ryste ved 37 ° C og 180 rpm i 2,5 timer.
BEMÆRK: Kortere inkubationstider med DNA (<2,5 timer) resulterer i lavere transfsninger frekvenser. - Indsamle cellerne ved centrifugering (5000 x g i 5 min ved 4 ° C).
- Resuspender cellerne i 10 ml BHI-medium. Bland cellesuspensionen med 90 ml smeltet BHI-agar (55 ° C) supplere med 32 mg / l chloramphenicol (eller 5 mg / l tetracyklin i kontroleksperimentet). Hæld blandingen i 90 mm petriskåle. Hurtigt afkøles og lad agaren størkner.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 2 dage.
- Gentagne genererede kolonier (transformanter) ved at overføre kolonierne (med tandstikkere) til nye BHI agarplader indeholdende de passende antibiotika til at bekræfte deres resistens egenskaber. Bekræft erhvervet resistens genet (cfr eller tetM) ved koloni-PCR 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne repræsenteret her er tidligere blevet offentliggjort (tilpasset fra henvisning 7 med udgiverens tilladelse). Vi studerede de potentielle overføringsveje af CFR-genet, som forårsager lavt niveau linezolid modstand og ekspressionen af PhLOPSA-resistens fænotype 14, 15 i S. aureus-stammer, ved at undersøge tre mekanismer HGT.
Figur 1 viser resultaterne opnået i konjugering assays. Konjugeringen protokol er nyttig til mellem arterne transmission (A) såvel som inden for samme art transmission (B), der giver lignende resultater under anvendelse af samme konjugative vektor i forskellige konjugative donorer. Effektiviteten af konjugation opgøres som Nº af transkonjuganter (kolonidannende enheder, eller CFU / ml) / Antal af modtagende celler (CFU / ml). De opnåede frekvenser varierede fra 1 x 10 -6 til 1 x 10 -5, med lignende værdier ved hjælp S. epidermidis eller S. aureus som donoren.
Resultaterne er opsummeret i tabel 2. cfr -acquired S. aureus var i stand til yderligere at overføre cfr gen til andre S. aureus-stammer ved konjugation samt ved fag-transduktion. Men resultaterne tyder fraværet af naturlige transformation til cfr transmission, selvom det blev opdaget for en anden modstand markør (tetM genet på pHY300 plasmid).
Figur 1: Repræsentation af modtager- og transkonjugantkolonier CFU'er opnået i konjugering analyser. De klare søjler repræsenterer de samlede recipientstammer isoleret efter18-24 timer af kultur i selektive medier for modtagerlandene stammer. De fyldte søjler repræsenterer de totale dobbelt-resistente stammer opnået efter 18-24 timer af kulturen i selektive medier for transkonjugantkolonier stammer. (A) Inter-arter konjugerende assay. Staphylococcus epidermidis (SE45) blev anvendt som cfr donor, og Staphylococcus aureus N315-stamme blev anvendt som recipient. Den N315-45 transkonjugant stammen nærede CFR gen indsat i et pSCFS7-lignende plasmid. Denne stamme blev anvendt som kilden til cfr i MRSA-til-MRSA transmission assays. (B) MRSA-til-MRSA konjugering eksperimenter. Den tidligere opnåede N315-45 blev anvendt som donor, og COL eller Mu50 stammer blev anvendt som recipienter. De gennemsnitlige værdier af to uafhængige eksperimenter er vist med standardafvigelsen (SD). Klik her for at se et størreversion af denne figur.
| Strain navn | Beskrivelse | referencekilde |
| bakteriestammer | ||
| SE45 | Kliniske isolatated S. epidermidis | 7 |
| N315 | præ-MRSA, KmR, Ermr | 9 |
| KOL | MRSA, der bærer tetracyclinresistensgenet på pT181 plasmid | 8 |
| Mu50 | MRSA, VISA | 9 |
| N315-45 | derivat af N315, transporterer cfr genet på en pSCFS7-lignende plasmid opnået fra S. epidermidis ved konjugation | 7 |
| COL-45 | derivative af KOL, der bærer cfr genet på en pSCFS7-lignende plasmid opnået fra S. epidermidis ved konjugation | 7 |
| RN4220-45 | derivat af RN4220, transporterer cfr genet på en pSCFS7-lignende plasmid opnået fra S. epidermidis ved konjugation | 7 |
| N2-2.1 | Sukke aktive celle afledt af N315, så celle naturlig kompetence til transformation | 7 |
| E. coli HST04 skader / dcm- pHY300 | E. coli HST04 beska- / dcm- (Takara), der bærer tetracyclinresistens pHY300 plasmid | 11 |
| bakteriofager | ||
| MR83a | Siphoviridae familie | Laboratorium lager |
| MR83-45 | fag MR83a pakning en pSCFS7-lignende plasmid, der bærer cfr gen efter inficereion i N315-45 | denne undersøgelse |
Tabel 1: Liste over stammer anvendt i dette arbejde.
| HTG | Donor | Modtager | Frekvens |
| konjugation | N315-45 | KOL | 1,00 x 10 -6 |
| N315-45 | MU50 | 1,29 x 10 -5 | |
| Transduktion | N315-45 | KOL | 1,00 x 10 -11 |
| N315-45 | MU50 | 3,68 x 10 -10 | |
| N315-45 | N315 | 6,88 x 10 -10 | |
| Transformation | Plasmider (COL-45) | N2-2.1 | ULD |
| Hele DNA (COL-45) | N2-2.1 | ULD | |
| pHY300 (kontrol) | N2-2.1 | 6,52 x 10 -10 |
Tabel 2: HTG frekvenser af cfr gen transmission opnået i MRSA-til-MRSA eksperimenter. Konjugerende transmission blev evalueret ved brug af N315 cfr -positiv derivat (N315-45) som donoren. Hyppigheden af transmission i disse forsøg udtrykkes som Antal af transkonjuganter / recipientceller. Transduktion blev evalueret ved brug af transducerende phag MR83a, amplificeret fra N315-45 stamme. Den transduktion frekvens blev beregnet som Nº af transduktanter / pfu. transformatitions- assays blev udført ved anvendelse af oprenset DNA (plasmid eller hel celle-DNA) som donorer. Transformationsfrekvensen blev beregnet som antallet af transformanter / recipientceller. ULD: under detektionsgrænsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver de tre store metoder til at studere HGT af genetiske determinanter i S. aureus. Selvom transduktion og konjugation er blevet studeret i årtier, blev eksistensen af naturlige transformation først for nylig anerkendt 2. Således er S. aureus udstyret med alle de tre store former for HGT, og teste dem alle er forpligtet til at klarlægge de mulige formidling veje for genetiske determinanter. Målet med dette arbejde er at udarbejde komplette protokoller og til at give praktiske oplysninger om de metoder, der anvendes i en tidligere offentliggjorte arbejde 7. Selvom konjugeringspartnere og transduktion protokoller er tilgængelige, er dette den første papir, hvor en detaljeret transformation protokol er beskrevet.
Konjugation medfølgende filter-parring metode er en simpel teknik og kan anvendes til studiet af konjugativ overførsel i forskellige bakteriearter= "xref"> 7, 10. Ved hjælp af den standardiserede podestoffer, recipient tæller efter 18-24 timer når en værdi af ~ 10 9 CFU / mL. Transkonjugantkolonier tællinger er variable, og værdier viser stærk stamme-til-stamme afhængighed, men typisk blev en transkonjugant fra 10 2 til 10 5 opnået, når konjugeringen resultaterne var positive. Brug protokollen tilvejebragt her, detektionsgrænsen opnåede var <10 transkonjuganter / mL. Denne grænse kan optimeres ved at koncentrere filteret suspension.
Den naturlige transformation beskrives her protokol blev etableret i S. aureus N315-afledte stammer. Brugen af CS2 medium er kritisk for transformation, eftersom transformationen kan ikke påvises i andre standard laboratorie medier, såsom TSB og BHI 13.
Brugen af langsigtede gemte plasmider (f.eks pT181 og pHY300) som donoren resulterede i omkring en 10- til 50-fold mindre hyppig (data ikke vist), hvilket antyder, at DNA-kvalitet kunne påvirke transformationsfrekvensen. Det er kendt, at nicked plasmider er ikke egnet til naturlig transformation i B. subtilis 16.
DNA opnået fra både S. aureus og E. coli, kan anvendes som donor i naturlige transformation assays, hvilket antyder, at en begrænsning barriere ikke hæmmer den naturlige transformation. Vi observerede også den samme transformation frekvens mellem DNA fremstillet fra E. coli HST04 (dæmning - / DCM -) mangler DNA methylase gener og fra JM109, støtter tanken om, at status for methylering ikke påvirker transformationsfrekvensen.
Det skal bemærkes, at transformationen frekvens detekteres ved hjælp af denne protokol var lav (~ 10 -9 -10 -10), og de transformerbare stammer er begrænset til N315 derivaterclass = "xref"> 2. Det er sandsynligt, at transformationseffektiviteten i S. aureus kan være stamme-specifik, som det også er blevet rapporteret i andre transformerbare bakterier 15, 16, 17. Yderligere undersøgelser er i gang for at forbedre omdannelsen effektivitet; Dette vil blive beskrevet andetsteds.
Phag transduktion synes at være den mest udbredte HGT mekanisme i S. aureus, fordi de fleste S. aureus isolater lysogeniseret af bakteriofager 18. Infektionen evne transducerende fag afhænger vært modtagelighed og skal kontrolleres ved plaque assay. En anden begrænsning af fag transduktion er størrelsen af DNA'et. Lille DNA kan overføres effektivt, men DNA-fragmenter større end 45 kb kan ikke pakkes i stafylokok faghovedet 19. Men en hidtil ukendt gigantisk stafylokok fag har for nylig Been isoleret fra miljøet, og itcould tænkes kunne overføre større DNA-fragmenter 20.
Plaque assay beskrevet i dette arbejde er lettere end den konventionelle protokol, hvor der anvendes top-agar. den foreliggende fremgangsmåde kræver imidlertid, at bakteriecellerne er jævnt fordelt for at detektere små plaques genereret på overfladen. For at opnå den helt jævn spredning, anbefaler vi at sprede nok volumen af bakteriesuspension på agaroverfladen, stopper når væsken jævnt dækker agaroverfladen. Derefter tørres pladerne i luftstrømmen i en ren bænk. Hvis det er nødvendigt at undgå lysogenization af transducerende phag, er en lav infektionsmultiplicitet anbefalet (MOI bør ikke overstige 1). Lysogeniseret celler kan skelnes ved deres formindskede følsomhed over for fag i plaque-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O'Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
