Summary
Les évaluations d'insecticides sont souvent ciblés contre les insectes adultes, plutôt que les stades immatures. Ici, nous présentons un protocole d'évaluation des insecticides contre lit les œufs de bugs avec une comparaison à la première étape de la punaise de lit nymphal. Ces protocoles pourraient être ajustés pour d'autres insectes pour évaluer l'efficacité des insecticides dans les stades de la vie non-adultes.
Abstract
évaluations de toxicité standard d'insecticides contre les insectes ravageurs sont menées principalement sur les insectes adultes. Les évaluations sont basées sur une relation dose-réponse ou d'une courbe de concentration-réponse, où l'augmentation de la mortalité de la dose ou à la concentration d'un insecticide est augmentée. Concentration standard létale (CL 50) et la dose létale (DL 50) Tests qui se traduisent par une mortalité de 50% d'une population d'essai peut être difficile pour évaluer la toxicité des insecticides contre la non-adultes stades de vie des insectes, tels que les œufs et du premier stade ou stades larvaires . Toutefois, cette information est essentielle pour comprendre l'efficacité des insecticides à tous les stades de la vie de punaises de lit, ce qui affecte les efforts de contrôle et de traitement. Ce protocole utilise un bioessai de trempage standard modifié pour les oeufs de punaises de lit et un essai insecticide de contact pour traiter larvaires premiers stades. Ces essais produisent une courbe de concentration-réponse afin de mieux quantifier CL 50 pour les évaluations d'insecticide.
Introduction
Les punaises de lit sont un ravageur urbain important qui peut causer la perte de sang, irritations de la peau, l' insomnie, la dépression et l' anxiété chez leurs hôtes humains 1, 2, 3, 4, 5, 6. Les coûts d'élimination et de contrôle des punaises de lit sont élevés et souvent nécessitent plusieurs visites dans une maison par une entreprise de lutte antiparasitaire 7. Plusieurs visites sont habituellement nécessaires en raison du comportement cryptique des punaises de lit et les difficultés associées à les tuer. En particulier, les œufs de punaises de lit sont difficiles à contrôler en raison de leur petite taille et de la protection de l'embryon par la coquille.
À l'heure actuelle, une pratique courante pour de nombreuses entreprises de lutte antiparasitaire à travers les États-Unis est de traiter une maison pour les punaises de lit à l'aide d'un insecticide chimique. C'est bien connuque les oeufs sont difficiles à contrôler, tant d'entreprises ont mis en place un délai de deux semaines pour re-traitements 8. Cela permet à des oeufs de punaises de lit suffisamment de temps pour éclore, de sorte que le premier stade larvaire émergera et prétendument plus facile de tuer avec des insecticides. Cependant, il y a une pénurie dans les études évaluant l'efficacité des insecticides liquides contre lit oeufs de bugs et premiers stades.
Les œufs d'insectes ont été documentés pour être l'étape la plus difficile de la vie à contrôler dans les insectes nuisibles urbains, autres que les punaises de lit, en plus de nombreux ravageurs agricoles. La plupart de ces difficultés ont été attribués à la coquille, tandis que quelques études ont rapporté la résistance aux insecticides. Résistance dans le stade de l' œuf a été documentée dans Triatoma infestans 9, Pediculus humanus capitis 10, Plutella xylostella 11, Rhyzopertha dominica 12,
Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour déterminer l'efficacité des insecticides dans le stade de punaises de lit commun œuf et premier stade larvaire, Cimex lectularius. Ces deux protocoles sont des tests de concentration-réponse pour permettre la quantification des valeurs de CL 50. dosages concentration-réponse sont couramment utilisés pour les études toxicologiques, mais ce protocole a été adapté pour traiter facilement des groupes de lit oeufs de bugs et premiers stades. Ces essais peuvent être adaptéspour les œufs d'espèces différentes d'insectes et les stades immatures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Ce protocole comprend deux essais d'insecticide pour traiter séparément les oeufs de punaises de lit et les premiers stades. Les deux protocoles ont été réalisés en utilisant les mêmes insecticides, cependant, les protocoles devaient être adaptés pour assurer une exposition aux insecticides et de manipuler facilement les spécimens.
1. Egg Tremper Insecticide Assay
- Tirez accouplées, bien nourris femelles adultes punaises de lit à partir d'une colonie et placer les femelles (5-10) dans une boîte de Pétri avec du papier filtre. Avoir au moins dix répétitions pour assurer qu'il y aura suffisamment d'oeufs pour le dosage de l'insecticide. Vérifiez si les femelles ont pondu des oeufs chaque jour.
- Une fois qu'ils pondent des œufs, prendre les femelles de la boîte de Pétri (6 cm x 5 cm) et les mettre dans de nouvelles boîtes de Pétri avec un nouveau papier filtre tous les jours et enregistrer la date sur les anciens et les nouveaux boîtes de Pétri.
- Laisser les œufs à l'âge de 4 à 5 jours avant de commencer le test. Susceptibilité aux insecticides changements au cours du développement embryonnaire, so il est important de contrôler l'âge de l'oeuf. Maintenez toutes les étapes de la vie à 12h12 L: D photopériode, 60% d'humidité relative et 27 ° C.
- Une fois les oeufs ont vieilli de manière appropriée, retirer les oeufs de punaises de lit doucement de papiers filtres en utilisant une pince souple à pointe. racler délicatement le fond de l'œuf attaché au papier filtre à l'aide de la pince, puis saisir en douceur, sans appliquer beaucoup de pression sur l'œuf pour limiter lit lancer des œufs d'insectes.
- Placez les oeufs de punaises des lits supprimés dans leurs groupes respectifs à l'intérieur de boîtes en plastique de Pétri. Limitez l'électricité statique de jeter des oeufs de punaises de lit en frottant le fond de chaque boîte de Pétri à l'extérieur avec une feuille d'assouplissant textile. Traiter les groupes d'œufs de punaises de lit (5-10 œufs par groupe) à la fois. Considérons un groupe une réplique et d'utiliser au moins cinq (ou plus) répétitions pour cet essai.
- Préparer des dilutions en série d'insecticides pour obtenir une gamme de 5 différentes concentrations (0,21 à 21 ul / ml pour l'imidaclopride (0,1%) / β-cyfluthrine (0,5%) et un contrôlesolution avec un solvant (eau du robinet) seulement. Faire 20 ml de chaque concentration d'avoir un volume suffisant pour l'essai de trempage.
- tubes Cut de centrifugeuse (50 ml) à la ligne de 35 mL médiale en utilisant un outil rotatif avec un accessoire de meule de tronçonnage puis découper un trou dans le bouchon du tube de centrifugeuse (diamètre = 2,54 cm) en utilisant le même outil rotatif avec un aluminium oxyde de broyage accessoire de pierre. Laisser 5 cm sur le bord de la capsule lors de la coupe, de sorte que le capuchon solidement visser dans le tube (Figure 1).
- Couper maille fine en carrés assez grands pour entrer dans le capuchon (~ 5 2 cm). Vissez le maillage serré, ce qui élimine les bosses, dans les tubes de centrifugation en utilisant le bouchon du tube de centrifugeuse.
- Placez un groupe de lit oeufs de bugs (une répétition) à l'aide d'un pinceau sur le maillage à l'intérieur du tube de centrifugeuse. Trempez le groupe de punaises de lit à l'intérieur du tube de centrifugeuse coupée dans une concentration insecticide pendant 5 secondes.
- Retirez le tube de centrifugation sur thsolution insecticide e. Sécher le maillage avec les œufs à l'intérieur en plaçant le tube de centrifugeuse directement sur un tissu de laboratoire.
- Retirez le groupe d'œufs hors du tube de centrifugeuse en utilisant une petite, fine poils pinceau et placez-les dans une boîte de Pétri propre avec un papier filtre propre.
- la mortalité des oeufs d'enregistrement (échec à éclore) pendant 14 jours pour que tous les oeufs ont eu suffisamment de temps pour éclore.
- Correct pour la mortalité dans le traitement de contrôle en utilisant la formule d'Abbott (mortalité% test - contrôle de la mortalité% / 100 - mortalité des témoins x 100).
- Insérez la mortalité enregistrée avec les concentrations correspondantes dans le logiciel d'analyse 15 pour calculer LC 50 valeurs.
2. Tout d'abord Instar Insecticide Assay
- Séparer un groupe de punaises de lit bien nourris (5 mâles adultes et 5 femelles adultes), de préférence introduit 1 jour avant, et les placer dans une boîte de Pétri (6 cm x 5 cm) avec du papier filtre prévu mating et la ponte. Laisser les punaises de lit adulte pour s'accoupler et pondent des œufs pendant environ 7-9 jours. Pour l' alimentation, utiliser un système d'alimentation artificielle qui fait circuler l' eau chaude dans des tubes de verre de sang 16 environnantes. Pour cette étude, utiliser du sang de lapin defibronated.
- Retirez les adultes des boîtes de Pétri (6 cm x 5 cm) et laisser les œufs éclosent en larves du premier stade dans les boîtes de Pétri. Il faut environ 7-9 jours pour les oeufs de punaises de lit éclosent à la température ambiante.
- Recueillir les vésiculés premiers stades du même âge à l'aide d'un pinceau. L'âge peut être déterminée en retirant les premiers stades d'enregistrement par jour et le jour où ils ont éclos. Placez-les dans de nouveaux plats propres Pétri jusqu'à ce que le dosage de l'insecticide. Les nymphes du premier stade ne sont pas très déshydratant résistant, de sorte que le dosage de l'insecticide devrait être achevée le plus tôt possible.
- Pour le dosage, préparer des dilutions en série de l'imidaclopride / β-cyfluthrine pour obtenir une gamme de 5 concentrations différentes et un contrôle solution avec un solvant seulement. Formulé produits étiquetés pour le contrôle des punaises de lit dans les Etats-Unis ont été utilisées pour ces études, donc le solvant est de l'eau (selon l'étiquette).
- Des aliquotes de pipette 150 ul de chaque concentration en insecticide et de l'eau pour le groupe témoin sur des papiers filtrants individuels (# 1; 4,2 cm de diamètre). Distribuer l'insecticide sur le papier filtre entier à l'aide de la pipette en appliquant des gouttelettes autour de tout le bord et le centre du papier filtre.
- Placez les papiers filtres traités individuellement au - dessus des panneaux rigides individuels (7 cm 2).
- groupes de sortie de premiers stades (5 à 10 par groupe) sur les papiers filtres individuels tout en humide avec un insecticide et couvrir les premiers stades avec un fond inversé d'une boîte de Pétri.
- Placez un poids sur le dessus de la boîte de Pétri pour empêcher les premiers punaises de lit larvaires de fuir la surface traitée.
- mortalité record de premières punaises de lit larvaire après 24 h d'exposition à tousconcentrations d'insecticides.
- Correct pour la mortalité dans le traitement de contrôle en utilisant la formule d'Abbott (mortalité% test - contrôle de la mortalité% / 100 - mortalité des témoins x 100).
- Insérez la mortalité et les concentrations enregistrées dans le logiciel d'analyse 15 pour calculer LC 50 valeurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les oeufs ont été plongés dans 5 différentes concentrations d'imidaclopride / β-cyfluthrine (ul / ml). Les premiers stades ont été placées sur les surfaces traitées des cinq concentrations différentes de l' imidaclopride / β-cyfluthrine (figure 2).
Nous avons utilisé trois populations différentes de C. lectularius: Harlan, Richmond, et Epic Center (tableau 1). La souche Harlan est sensible aux insecticides pyréthrinoïdes et a été acquis en 2005 par le Dr Harold Harlan. Les souches de Richmond et Epic Centre sont à la fois résistants à la deltaméthrine. La souche Richmond a été recueillie à partir d'un foyer de groupe de personnes âgées à Richmond, VA en 2008. La souche Epic Centre a été recueilli en 2008 à Cincinnati, OH.
LC supérieur 50 valeurs indiquent qu'une concentration plus élevée est nécessaire pour tuer 50% de laessai population oeufs à partir de souches de Richmond et Epic Center. Comme pour les oeufs, les premiers stades de la population de Richmond et Epic Centre requis des concentrations plus élevées d'insecticide pour tuer 50% de la population d'essai. Les valeurs de CL 50 suivies par des lettres différentes sont significativement différentes.
Figure 1. Photographie du tube de centrifugeuse modifié. Un trou a été coupé dans le bouchon, de sorte qu'un morceau carré de maille peut être vissé dans le bouchon. Les morceaux de filet peuvent être jetés et remplacés par l'utilisation de différents insecticides. Les oeufs de punaises de lit sont placés directement sur le maillage en utilisant un pinceau, puis immergés dans les solutions d'insecticide pour le dosage de trempage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentation d'un graphe dose-réponse. La réponse de pour cent (de mortalité) de la souche Harlan oeufs de punaises de lit à l'imidaclopride / β-cyfluthrine est tracée sur l'axe des ordonnées et la concentration du journal que les punaises de lit ont été exposés à est représenté sur l'axe des x. La mortalité des oeufs augmente lorsque la dose a augmenté et la mortalité atteint 100% à la plus forte concentration testée.
| Etape Vie / Strain | n | CL 50 (95% CI) | Pente ± SE | X 2 (df) | |
| Des œufs | |||||
| Harlan | 250 | 0.41a ( 0,276 à 0,548) | 1,86 ± 0,24 | 33,42 (23) | |
| Richmond | 320 | 1.23b (de 0,59 à 2,10) | 1,13 ± 0,14 | 82,57 (30) | |
| Epic Centre | 400 | 2.10b (1,049 à 4,587) | 0,95 ± 0,10 | 149,91 (38) | |
| Les premiers stades | |||||
| Harlan | 150 | 0.04a (0,030 à 0,063) | 2,16 ± 0,34 | 38,17 (28) | |
| Richmond | 195 | 4.81b (1,94 à 10,26) | 0,66 ± 0,12 | 45.87 (37) | |
| Epic Centre | 190 | 19.72b (8,18 à 184,48) | 0,75 ± 0,17 | 45,39 (36) | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Molly Stedfast pour la dilution et de pesticides assistance formulation. Nous remercions également Troy Anderson pour l'analyse probit orientation et Zachary Adelman pour l'assistance à la conception expérimentale. Cette recherche a été en partie soutenue par un prix de la Fondation entomologique et par des fonds de bourses d'études Virginia lutte antiparasitaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | Plastic |
| Filter paper | Whatman | 1001-042 | |
| Featherweight forceps | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC (imidacloprid/bifenthrin) | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP (acetamiprid/bifenthrin) | FMC Corp. | ||
| Centrifuge tube | 06-443-18 | 50 mL; flat-top threaded | |
| Fine mesh | 7250C | ||
| KimWipe | 06-666A | 11 cm x 21 cm | |
| Small paint brush | Any small paint brush | ||
| Hardboard panels | Composite wood or tile would be sufficient from a home improvement store | ||
| Metal weights | Any type of metal screw that will hold the weight of the Petri dish down onto a surface |
References
- Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
- Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
- Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
- Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
- Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
- Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
- Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
- Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
- Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
- Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
- Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
- Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
- Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
- Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
- Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
- Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
- Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
- Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
- Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).
