Summary
炎症性腸疾患（IBD）の現在の治療は、疾患の症状の緩和を目指すが、重篤な副作用を引き起こす可能性があります。したがって、代替戦略は、動物大腸炎モデルにおいて研究されています。ここでは、臨床的なIBDの兆候にダイエットサプリメントの有益な効果は、このような大腸炎モデルで分析されている方法について説明します。
Abstract
クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（IBD）は、腸の慢性再発性障害です。これらは、罹患した個体で腹部痙攣、出血性下痢、体重減少、などの深刻な問題を引き起こします。残念ながら、治療法はまだありません、そして治療は、唯一の症状を緩和することを目指しています。現在の治療は、重篤な副作用を引き起こす可能性の抗炎症および免疫抑制剤が挙げられます。これは、副作用を引き起こさないような栄養補助食品などの代替治療選択肢、検索を保証します。臨床研究への応用の前に、このような化合物は、厳密に、動物モデルでの有効性と安全のためにテストする必要があります。信頼できる実験モデルは、ヒトにおける潰瘍性大腸炎の臨床徴候の多くを再現したマウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）大腸炎モデルです。我々は最近含む栄養補助食品の有益な効果をテストするためにこのモデルを適用しましたビタミンCおよびE、L-アルギニン、及びω3多価不飽和脂肪酸（PUFA）。我々は、様々な病気のパラメータを分析し、このサプリメントは、疾患活動指数の全体的な改善につながる、浮腫形成、組織損傷、白血球浸潤、酸化ストレス、およびプロ炎症性サイトカインの産生を改善することができることを見出しました。この記事では、我々はそのような組織学、酸化ストレス、および炎症などの疾患パラメータが評価される方法をC57BL / 6マウスにおけるDSS大腸炎モデルを用いて詳細に栄養補助食品の正しいアプリケーションを説明するだけでなく、。別ダイエットサプリメントの有益な効果を分析して、その後、最終的IBDの症状を軽減および/またはそれは重篤な副作用を引き起こすことなく、寛解の位相を延長代替治療戦略の開発のための新しい道を開くことができます。
Introduction
大腸炎は、下痢や腹痛を引き起こす可能性があり、大腸の炎症状態です。大腸炎は、感染症またはストレスに応答して、急性ことができ、またはそのような炎症性腸疾患（IBD）のグループに属している潰瘍性大腸炎（UC）のように、慢性疾患として発症することができます。 UCの臨床徴候は、十分に記載されているが、病因は依然として不十分1と理解されます。 UCが大きな役割2をプレイする遺伝子変異や異常な免疫応答と、多因子疾患であることが専門家の間で受け入れられています。しかし、このような生活と栄養のスタイルなどの環境要因は、また、疾患の発症と進行3に貢献しています。
残念ながら、IBDは、硬化性ではなく、臨床症状を軽減することを目指し、多くの治療の選択肢があります。現在の治療は、スルファサラジンおよびコルチコステロイドなどの抗炎症薬を含みます。このようなazathioなどの免疫抑制剤、prine;過剰な白血球動員を減少させるために、例えば、インテグリンなどの腫瘍壊死因子α（TNF-α）、またはブロック接着分子などの炎症性サイトカインを、捕捉モノクローナル抗体。そして、このようなヤヌスキナーゼ（JAK）4のようなプロ炎症経路を、トリガキナーゼを標的とする阻害剤。ていないすべての患者は、全ての治療に応答するため、治療戦略が5を個別に判断しなければなりません。さらに、これらの治療薬のほとんどは、多くの場合、重篤な副作用を引き起こす代謝および免疫応答を妨害します。この理由のために、代替の治療選択肢が検討されています。
代替治療は、プロバイオティクスと成功6,7の様々なレベルで、動物モデルおよび臨床試験に適用されている栄養補助食品が含まれます。我々は最近発見したような抗酸化ビタミンやω3-多価不飽和脂肪酸のような異なる単一の栄養補助食品の適用（PUFAS）、大腸炎および心血管疾患の症状8,9を緩和するようなサプリメントの組み合わせのアプリケーションに劣っています。これらの研究はマウスにおいて行われたため、臨床試験は、これらの知見は、ヒトに適用するかどうかを決定するためにヒトで行われなければなりません。臨床試験が開始される前に、新たな治療の選択肢の有効性と安全性は、動物モデルで評価されなければなりません。
IBDのために、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）モデルは、広く、疾患の発生のメカニズムと薬物および栄養補助食品6,10の有益な効果を研究するために使用されてきました。ほとんどの研究では、7日の期間にわたってのみ急性疾患が誘発されます。それにもかかわらず、これらの動物で観察された臨床症状は密接にIBDの患者で観察されるものに似ている（ すなわち、血性下痢、体重減少、上皮性機能不全、および免疫細胞浸潤）10。 DSSは、粘膜にびらんを誘発しますバリア機能不全と増加し、腸上皮透過性11が生じます。正確なメカニズムは不明のまま。しかし、研究は、DSSの上皮細胞に侵入すると、炎症性シグナル伝達経路12を誘導することができるナノlipocomplexesを形成するために、中鎖長の脂肪酸と相互作用することを示唆しています。この記事では、我々はマウスにおいて誘導され、分析される大腸炎方法を詳細に説明し、どのように栄養補助食品は、各動物において一定の投与量を確保するために、胃管栄養法によって適用され、どのように様々な大腸炎の症状に対するそのようなサプリメントの効果を調べています。
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Protocol
全ての動物実験はCinvestavの施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
1. DSSの飲料水の製造及び大腸炎の誘導
- オートクレーブ処理飲料水で3.5％のw / vのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）溶液を調製します。 DSSは、容易に溶解して、最終溶液を濾過する必要はありません。
注記：DSS処置の7日は、重度の大腸炎を誘発します。軽度の大腸炎を誘発した場合、3 - 治療の4日間をお勧めします。限りDSSを飲料水が透明に留まるように、水を変更する必要はありません。それが濁る場合は、それを交換する必要があります。 - 雄マウスのベースライン重量を記録します。 25グラムの体重 - 年齢の21の範囲内で12週間 - 彼らは8であることを確認してください。
注：適切なDSSの濃度は、各研究室に最適化されなければなりません。結果は非常に収容条件に応じて、変えることができます。 2.5の間の濃度 - 5％は、通常、強力なCを誘導することが報告されていますC57BL / 6J WTマウス10でolitis。結果はまた、DSSの異なるソースによって変化し得るように、異なる企業や異なるロットからのDSSは、テストする必要があります。 - 水を自由に提供し、必要に応じて新鮮な3.5％DSS水と交換してください。
強制経口栄養補助食品の適用に関する事項
- 適切な溶媒中の所望の栄養補助食品の「搬送可能」ソリューションを準備します。この研究のために、我々は200ミリグラム/ kgのL-アルギニン、83ミリグラム/キログラムビタミンC、46ミリグラム/ kgのビタミンE、77ミリグラム/ kgのエイコサペンタエン酸（EPA）、および115ミリグラム/キログラムドコサヘキサエン酸を含有する混合物（DHAを使用しました水やベニバナ油：1溶液）1インチ
- 栄養補助食品混合物で（15 Gが50ミリメートルをX）強制経口投与針に接続された1-mLシリンジを埋めます。外針の任意の化合物を除去するために、適切な用量の適用を確保するために強制経口投与針の外側を拭いてください。
- と尾の付け根をつかんでマウスを拘束一方、しっかりと他の手の親指と人差し指で首の後ろで皮膚のひだを把持することもできます。薬指と首を保持している同じ手の親指の付け根の間に尾を置きます。
- 直立位置でマウスを維持しながら、動物の口の左側に針を挿入し、慎重に食道を見つけるために、口の屋根に従ってください。何の抵抗に遭遇していない場合は、胃に向かって針を進めます。
注：動物が先に進む前に、適切に呼吸していることを確認します。 - ゆっくりと混合物を管理し、ゆっくりと注射器を引き抜くことにより、チューブを削除し、マウスを離します。大腸炎の実験の過程で栄養により毎日一回の栄養補助食品を適用します。
疾患活動指数の3決意
注：疾患活動指数はOBである体重減少、肛門周囲の出血、および便の硬さのスコアの組み合わせであります毎日13 tained。
- 毎日体重を測定し、重量減少率に応じて0〜4のスコアを割り当て（0：0％、1：1から5までパーセント、2：5から10パーセント、3：10から20までパーセント、および4：> 20 ％）。
注：体重損失はDSS大腸炎の誘導および実際の重量前基礎重量との間のパーセント差を計算することによって決定されます。 - 肛門周囲出血のレベルを決定するために、新鮮な糞便サンプルを収集し、グアヤク便潜血検査キットからスライド上に薄い汚れを適用するために提供さアプリケーターを使用しています。各サンプルについて、新鮮なアプリケーターを使用してください。
- 前面のカバーを閉じて、スライドの背面にウィンドウを開きます。試料位置に戻って現像液の2滴を適用します。
- 30秒後に結果をお読みください。青色の痕跡は、潜血のための肯定的です。 0（0〜4のスコアを割り当て：なし、0.5から2.5：正グアヤク信号強度に応じて、便潜血検査（）、および3から4：GROssの出血）。
注：糞便中の血液が見える場合、グアヤク便潜血検査を実施しなければならない、および3のスコア、3.5、または4が割り当てられ、目に見える血液の量に依存しません。
- 新鮮な糞便サンプルを観察することにより、便の硬さを決定します。 （下痢0：ノーマル/固体、0.5 - ：： - 2.5 4ペースト状便、および3）0〜4のスコアを割り当てます。
4.エバンスブルーアッセイによりin vivoで腸上皮透過性の決定
- 食塩水（0.9％NaCl）中で希釈したケタミンの混合物（体重の100mg / kg）およびキシラジン（体重の13ミリグラム/ kg）を腹腔内にそれらを注入することによって動物を麻酔し、ピンチを監視することによって麻酔の深さを評価します引っ込め反射。
- 仰臥位で麻酔動物を配置し、腸を露出するために開腹術を行います。
- 盲腸を見つけ、コロンaの近位部に小切開を作りますscendens（盲腸に理想的には、すぐに隣接します）。
- 給餌針（G22）を挿入し、共通の絹糸を使用して、合字で固定します。慎重にコロンからすべての糞を洗い流すために管を通して豊かなPBSをフラッシュします。それは肛門に達するまで結腸にエバンスブルー溶液（PBS中w / vの1.5％）を植え付けます。
- 15分間のエバンスブルーをインキュベートします。肛門周囲の洗い出しが透明になるまで豊富なPBSでチューブをフラッシュすることにより染料を洗い流します。
- 頸椎脱臼により動物を安楽死させます。
- コロンを切除し、豊富なPBSで再びそれをすすいでください。結腸粘液に付着し、任意の色素を除去するためにPBSで6 mMのN個の -acetylcysteineの1ミリリットルで一回すすいでください。
- 縦方向にコロンをカットし、PBSおよび6 mMのN個の -acetylcysteine 1mLでもう一度それをすすいでください。
- 重量と長さを記録します。穏やかagitatioながら室温で一晩、Nの2 mLのN-ジメチルホルムアミドをコロンを置き、エバンスブルー色素を抽出するにはn個。 610 nmで分光光度的に色素濃度を測定します。
5.組織コレクション
- 食塩水（0.9％NaCl）中で希釈したケタミンの混合物（体重の100mg / kg）およびキシラジン（体重の13ミリグラム/ kg）を腹腔内にそれらを注入することによって動物を麻酔し、ピンチを監視することによって麻酔の深さを評価します引っ込め反射。
- 頸椎脱臼により動物を安楽死させます。
- 仰臥位で動物を置き、腹腔を露出するために開腹術を行います。
- はさみを使用して、結腸全体を分析し、その長さを記録。
- 糞を除去するために冷却したPBSで慎重に数回、コロンをフラッシュします。組織重量を記録し、ステップ5.6で説明したように、以下の実験の準備 - 5.8。
- RNAの単離およびミエロペルオキシダーゼ（MPO）アッセイのために、適切なサイズの組織サンプルを切断した（100mgは通常は十分です）、チューブ内に配置し、SNA液体窒素でそれをp型凍結。将来の使用のために-80℃で組織を保存してください。
- 免疫蛍光染色および酸化ストレスの決意（下記参照）のために、小さな大腸サンプルカット（0.5〜1センチメートル）を、最適な切削温度（OCT）化合物で満たされた小さなアルミカップにそれを沈めます。ドライアイス上でカップを置き、それらの気泡の形成を避けるために、ゆっくりと凍結させ。凍結組織サンプルは、将来の使用のために-80℃で保存することができます。
- スイスロール14は、縦方向にコロンを開き、慎重にピンセットを用いて糞を削除します。粘膜は、先の細いピンセットや細い、丸い木製の棒を使用して、内側に向けて、それをロールアップ。慎重に包埋カセット内に配置し、ステップ6.1に進みます。
注：DSSは、大腸内の損傷を誘発します。しかし、被害分布は通常、遠位結腸と直腸に見られるほとんどの損傷と、遠位結腸の近位から変化します。したがって、我々は、遠位COLのいずれかで組織像を分析することをお勧め上または結腸全体のスイスの役割インチ
ヘマトキシリン - エオシン染色により結腸組織学の6分析
- 組織標本
- 組織学的分析のために、適切な固定を達成するために、室温（RT）で48時間、10％ホルムアルデヒド、5 mLのスイスロールまたはコントロールの特定の結腸領域から小さい組織片と処置されたマウスのいずれかを水没。
注：ステップ6のすべてのさらなる工程は、特に断らない限り、室温で行われます。 - 18時間水道水でそれらを洗ってください。
- 1時間、1時間、1時間、96％、および無水エタノール、70％エタノール15mLでそれらを脱水します。次の濃度に進む前に、新鮮なアルコールとの各ステップを繰り返します。
- 無水エタノール7.5 mL及び1時間絶対キシレン7.5ミリリットルの混合物中に脱水を続けます。 1時間の絶対的キシレン15 mLにサンプルを渡す前に一度繰り返します。新鮮なキシレンで一度、この手順を繰り返します。
- パラフィンで結腸組織サンプルを埋め込みます
- 17時間、流動パラフィン50mL中の試料を浸し。一度だけ3時間、この手順を繰り返します。
- 流動パラフィンの810 mL中：キューブ内のサンプル（22×22のx 22ミリメートルのプラスチック、正方形の金型、サイズ）を浸し。
- 結腸組織サンプルとパラフィンを室温で24時間、固化することができます。
- ミクロトームを用いて組織の断面を切断します
- 5ミクロンの厚さで、製造元の指示に従って、ミクロトームを用いて大腸サンプルをカットします。
- 0.3％ゼラチンを含む水浴（1 L）の削減を収集します。これは、組織断面の折り畳みを阻止します。組織切片を回収し、ガラススライド上にマウントします。
- 組織断面のヘマトキシリンおよびエオシン染色
- インキュベーター中で60℃で18時間、サンプルを脱パラフィン。この目的のために、ガラスのに使用ハンドル付きライドラック。
- 脱パラフィンした後、5分間の絶対的キシレン70mLの中にスライドを浸します。新鮮なキシレンで一度、この手順を繰り返します。
- 1分間無水アルコール70mLの中にサンプルを転送します。新鮮なアルコールで一度、この手順を繰り返します。
- 1分間のエタノール96％の70ミリリットルで大腸組織試料をインキュベートします。新鮮なアルコールで一度、この手順を繰り返します。
- 2秒間回水道水でサンプルを洗浄します。
- 7分間ハリスヘマトキシリンで組織をインキュベートします。
- 2秒間回水道水でサンプルを洗浄します。
- 7秒間酸性アルコール中のサンプル（エタノール70％の70 mLおよび1 M塩酸の700μL）をインキュベートします。
- 2秒間回水道水でサンプルを洗浄します。
- 7秒間炭酸リチウム（蒸留水100mL中の炭酸リチウムの1グラム）の70ミリリットルで組織サンプルをインキュベートします。
- 2秒間回水道水でサンプルを洗浄します。
- エタノール80の70 mLのサンプルをインキュベート1分間％。
- 15秒間エオシン-Yの70ミリリットルにサンプルを移します。
- 1分間96％エタノール70ミリリットルでそれらをインキュベートします。新鮮なアルコールで一度、この手順を繰り返します。
- 1分間無水エタノール（エチルアルコール絶対無水）70mLの中で組織サンプルをインキュベートします。新鮮なアルコールで一度、この手順を繰り返します。
- 無水アルコール35mLの混合物および1分間の絶対的キシレン35 mLと70 mLのサンプルをインキュベートします。
- 1分間の絶対的キシレン70mLの中にサンプルを転送します。新鮮な絶対的キシレン70mLの中で5分間、この手順を繰り返します。
- 、結腸組織サンプルに合成樹脂の80μLを加えるカバースリップでそれらをカバーし、室温で24時間のためにそれらが乾燥してみましょう。最後に、明視野顕微鏡8を使用してサンプルを分析します。
7.免疫蛍光によってジャンクション組成分析
- ステップ5.7で説明したように組織を準備し、8ミクロンの厚さの断面をカットクリオスタットを使用して。
- 修正し、20分間-20℃で96％エタノールで結腸の断面を透過。
注：特に明記しない限り、以降のすべてのインキュベーションは、乾燥し、蛍光色素の退色を防止するために、湿気の暗箱に、室温で実施されるべきです。 - その後、空気乾燥サンプル、および1×PBSで彼らに5分間、3回ずつすすぎます
- 2時間（PBS 0.01％のTweenおよび2％BSAを含む）ブロッキング溶液でサンプルをインキュベートします。
- ブロッキング溶液を除去し、10分間、PBS-0.01％Tweenでそれをすすいでください。
- この間、PBS-0.01％Tween中所望の濃度に一次抗体を希釈します。
- 、洗浄液を削除する前のステップからの抗体溶液を適用し、湿潤箱中で4℃で一晩インキュベートします。
- 抗体溶液を除去し、非常に穏やかに撹拌しながら、10分間、脱イオン水で1回5分間ずつPBS-0.01％Tweenで3回洗浄し、。
- 洗浄、遠心フッ素一方4℃で20分間、14,000×gで、種特異的二次抗体をochromeconjugated。
- PBS-0.01％Tween中プロバイダーによって示されるように沈殿することなく、二次抗体を希釈し、それを適用し、そして室温で1時間インキュベートします。
- 繰り返しステップ7.8とできるだけ完全に洗浄液を除去します。
- スライド上の各サンプルオーバー褪色防止剤のピペット4μL。
- カバーガラスのサンプルをカバーしています。
- 1時間空気乾燥。
- マニキュアとシールスライド。スライドは、さらなる分析まで-20℃で保存することができます。
- 共焦点レーザー顕微鏡8に分析します。
エチジウムの酸化による酸化ストレスの8決意
- ステップ5.7で説明し、5ミクロンの厚さでクライオスタットに大腸セクションをカットするようDSS大腸炎の7日後に、組織を準備します。ガラススライド上にマウント断面は、ポリ-L-リジン溶液で処理した試料のウィットをインキュベート暗所で30分間、37℃の水で時間ジヒドロの5μM（DHE）。
- PBS（pHは7.6）を室温で穏やかに攪拌しながら15分間、3回のサンプルを洗ってください。空気がサンプルを乾燥し、蛍光を保護するためにメディアをマウントするのドロップを追加します。レーザー走査共焦点顕微鏡（40X倍率、568 nmの波長）上で酸化エチジウムの蛍光を観察します。
MPOアッセイによる白血球リクルートの9分析
- DSS大腸炎の7日後、結腸組織を採取し、試料均質化 - 氷上でホモジナイザーを用いてヘキサデシル1mLの（HTAB）緩衝液（50mMリン酸緩衝液中の0.5％HTAB、pH6.0）で（200〜400 mg）を。
- 10秒ごとに40％の振幅で5回溶解物中のすべての組織を含み、それを超音波処理するために1 mLのHTABの緩衝液で2回ホモジナイザーの先端を洗浄します。液体窒素で3回融解を凍結。
- 15分間、14,000×gで遠心分離し、上清を集めます。クエン酸ナトリウム（水中1 M）、過酸化水素0.1mlをABTS、5ミリリットルを混合し、2,2'-アジノ - ビス（3-ethylbenzothiazoline -6-スルホン酸）（ABTS）溶液を調製し、双方向の45ミリリットル-蒸留水。
- 96ウェル平底プレート中のABTS溶液を0.1 mLで各上清0.1mLのを混ぜます。 10分後、分光光度計を用いて460 nmの吸光度を測定します。
10. PCRによる炎症性サイトカインの発現を評価します
- 組織の均質化
- パワーホモジナイザーを用いて、酸グアニジウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム混合物1mLに結腸組織試料の50から100mgを均一。
- 15分間室温でインキュベート。
- 相分離
- クロロホルム0.2 mLを加え、30秒間激しく振ります。
- 4℃で30分間インキュベートします。
- 4℃で60分間、12,000×gで遠心分離します。
- Uを転送新しいチューブ（〜500μL）にPPER水相。
- RNA沈殿および再懸濁
- イソプロピルアルコール0.5 mLを加え、60分間4℃でサンプルをインキュベートします。
- 4℃で30分間、12,000×gで遠心分離します。
- 完全に上清を取り除きます。
- エタノール75％および渦の1 mLを加え。
- 4℃で30分間、12,000×gで遠心分離します。
- 上清を取り除きます。
- 3-5分間空気乾燥に残りのエタノールを許可します。
注：非常にその溶解度を減少させるようにRNAペレットは、完全に乾燥させないようにすることが重要です。 - ジエチル0.3mLの（DEPC）処理水でペレットを再溶解します。直ちに-80℃でのcDNA（より安定し、ステップ10.5を参照）、またはストアにRNAサンプルを転写します。
- RNA定量
- DEPC処理水99μLとRNAの1μLに希釈します。
- 目を読みます試料濃度及び純度を決定するために、UV / VIS分光光度計を用いて260 nmおよび280 nmでのE OD。
- cDNA合成
- RNaseフリーの滅菌チューブ中1オリゴのμL（DT）12-18（0.5μgの/μL）およびDEPC処理水（12μLの総容量）でRNAサンプル（1-5μgの）を混ぜます。
- 70℃で10分間インキュベートします。
- 10×PCRバッファー、50のMgCl 2、10mMのdNTPをミックス1μL、および0.1 Mジチオスレイトール（DTT）の2μLの1μLの2μLを追加します。
- 5分間4℃でインキュベートします。
- 逆転写酵素の1μLを加え、5分間42℃でインキュベートします。
- 70℃で15分間インキュベートします。
- 15分間4℃でインキュベートします。 cDNAを、さらに使用するまで-20℃で保存することができます。
- PCR
- 10×PCR緩衝液、25mMのMgCl 2を、0.5の10mM dNTPミックスのμL、0.25μの1.5μLの2.5μLを混ぜます25μLの全体積のTaq DNAポリメラーゼ、各プライマーの0.25μL（10μM）およびcDNA（100 ngの）、および滅菌水のL。
- 96ウェルサーマルサイクラーにサンプルを実行します。 IL1β-FW：GCAACTGTTCCTGAACTCAACTとIL1β-RE：フォワード、ゲノムDNAの増幅を防止し、プライマーを逆にするには、異なるエクソンに配置する必要がありますTCTTTTGGGGTCCGTCAACT。 IL6-FW：CCTTCCTACCCCAATTTCCAAとIL6-RE：AGATGAATTGGATGGTCTTGGTC。 KC-FW：TGTCAGTGCCTGCAGACCATとKC-RE：CCTGAGGGCAACACCTTCA。そして、アクチンFW：TATCCACCTTCCAGCAGATGTとアクチン-RE：AGCTCAGTAACAGTCCGCCTA。 15秒、30秒間58℃、30秒間72℃、加えて72℃で10分間の最終伸長95℃、95℃、5分間の30サイクル、続いて以下のPCR条件を使用して。
- 組織学的分析のために、適切な固定を達成するために、室温（RT）で48時間、10％ホルムアルデヒド、5 mLのスイスロールまたはコントロールの特定の結腸領域から小さい組織片と処置されたマウスのいずれかを水没。
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Representative Results
ダイエットサプリメントDSS大腸炎から保護することができます。
ビタミンC、ビタミンE、一酸化窒素（NO）-source L-アルギニン、及びω3多価不飽和脂肪酸（ω3-のPUFA）、抗炎症性および抗酸化ダイエットサプリメントは、動物における変化成功とともに使用されています炎症性疾患3,6,15の兆候を軽減するモデル。栄養失調、酸化ストレス、およびプロ炎症性サイトカインの産生は、両方の急性および慢性大腸炎3をトリガすることができます 。以前の研究では、微量栄養素の組み合わせが、インビボでの DSS誘発大腸炎に対して保護効果を示したことを証明しました。ここでは、これらの効果は、8を測定した方法についての詳細なプロトコルを提供しています。まず、我々は、体重減少の3つのパラメータからなる、疾患活動性指数（DAI）を決定することによって、疾患の進行の栄養補助食品の効果を分析しました便の硬さ、および肛門周囲の出血。代表的な結果は、DSS処理が継続的に増加DAI、予想されるように、7日目に8.2±0.46の最大に達した（ 図1A）につながっていることを示しました。抗炎症ダイエットサプリメントは、大腸炎の発症を遅延させたが、大腸炎が非常に強かったときに、後の時点で、保護効果は大腸炎がまだ強すぎないときにダイエットサプリメントのみ有効であることを示唆し、限界ともはや統計学的に有意ではなかったです。重要なことは、食事介入は、大腸炎（ 図1B）の重要な特徴である腸管上皮の透過性、中DSS誘発増加を防ぐことができます。 DSS大腸炎は減少し、大腸の長さにつながっており、この短縮はまた、抗炎症性および抗酸化ダイエットサプリメント（ 図1C）によって改善されました。従って、大腸炎の臨床症状は、実際に食事組成物の変化によって緩和することができます。
進行はダイエットサプリメントを受けた動物ではそれほど深刻であった大腸炎理由を分析するには、組織形態は、パラフィン包埋遠位結腸組織のヘマトキシリン/エオシン（H / E）染色後に調べました。 （; 図2A、中央パネルすなわち、白血球浸潤、浮腫形成、陰窩形成異常、および潰瘍）3.5％DSSで処置した動物は、大腸炎の典型的な徴候を示したのに対し、対照サンプルは、通常の形態（ 図2A、上パネル）を示しました。注目すべきは、ダイエットサプリメントでの並列処理は明らかに対照群（ 図2A、下のパネル）に匹敵した全体的な形態で、大腸炎誘発性の形態学的変化を緩和します。これらの観察はされたものと非常に類似していました明らかにプロバイオティック細菌13とを有する共治療のために食生活の変化が大腸炎の開発に対抗することができることを示していると報告しました。
我々は、大腸炎誘発性腸上皮透過性がダイエットサプリメントによって打ち消すことができることをすでに知っていました。透過性の増大は、IBDの特徴である、そしてそれは、安定化接着結合（AJ）とタイトジャンクション（TJ）の分解によって引き起こされる大部分です。接合タンパク質の内在化による上皮細胞接触の不安定化は、豊富大腸炎16中に生成される炎症誘発性サイトカインによって誘導されます。私たちは、TJ分子閉鎖帯-1（ZO-1）とAJ分子E-カドヘリンは、DSS誘導性大腸炎中に内在化し、これらのタンパク質の共局在化が部分的に失われたことを、遠位結腸組織の免疫蛍光染色を通じて、発見しました陰窩の上皮細胞接触に（ 図2B）。私DSS処置マウスは、抗炎症及び抗酸化ダイエットサプリメント（ 図2B）で同時処理したときmportantly、E-カドヘリンとZO-1の内在化を減少させました。全体的に、cryptとの接合構造が観察された保護効果は、少なくとも部分的に起因する組織構造の保全にあったことを示唆している、ダイエットサプリメントが適用されたコントロールに匹敵しました。
炎症性好中球リクルート、酸化ストレス、および炎症性サイトカインの産生を打ち消すことができます食事介入
IBDのもう一つの特徴は、制御されていない好中球の浸潤です。動員は、好中球産生および活性酸素種（ROS）およびプロテアーゼ17を放出することによって組織損傷に寄与する。 MPO活性アッセイを使用して、我々は打ち消された、DSSに対応して結腸に強い好中球動員を見つけましたダイエット補充により（ 図3A）。
酸化ストレスは、動員、好中球からのROSの放出によって引き起こされる大腸炎の他の重要な特徴です。したがって、我々は、結腸断面におけるROSの産生を分析しました。 図3Bは、DSS処理が強く、酸化ストレスを増加させることを実証します。注目すべきは、食生活の変化は完全に可能性が最も高い減少好中球動員（ 図3A）の結果であるDSS誘発酸化ストレス（ 図3B）を 、防ぎます。
炎症性サイトカインおよびケモカインは、強力大腸炎18中の様々な細胞型によって産生されます。このような炎症性メディエーターは、我々はすでに食生活の変化によって減衰することができる知っていた好中球動員および結合タンパク質内在-機能に貢献します。 RT-PCRによるmRNA発現の分析は、DSSことを明らかにしました予想通り（ 図3C）、IL1β、IL-6の発現、およびケラチノサイト由来ケモカイン（KC）の増加、および抗炎症ダイエットサプリメントは、このDSS誘発の増加（ 図3C）を減少しています。これらのデータは、ダイエットサプリメントが実際にIBDの臨床徴候に対抗するために役立つことができることを示唆しています。
図1.栄養補助食品は、疾患活動指数、腸上皮透過性、およびコロンの短縮を軽減することができます。 （A）疾患活動指数（DAIは、0からの値- 12）+体重減少、便の硬さ、および肛門周囲出血の三つのパラメータで構成され、制御（CTRL）、大腸炎、および大腸炎の実験群に毎日記録しました栄養補助食品（大腸炎+補遺。）。対照群は0 throughouのDAIその結果、大腸炎の兆候を示しませんでした実験期間をtは。群あたりn = 5。 （B）腸上皮透過性は、上述の実験群にエバンスブルーの漏洩で測定し、組織1gあたり620 nmでの吸収として表しました。群あたりn = 8。すべてのデータは平均値（SDM）の平均値±標準偏差として示されています。 * P <0.05。 ** P <0.01。 *** P <0.001。統計は、一方向ANOVAにより計算しました。 （C）治療の7日後の各実験群の全結腸の代表的な画像。左側のスケールはセンチメートルです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
栄養蘇を適用すると、図2の組織形態とジャンクションのアーキテクチャは、より良い大腸炎の間に保持されますpplements。 （A）各実験群の遠位結腸からの組織生検の5μmのパラフィン断面は、ヘマトキシリン/エオシンで染色し、そのような浮腫形成（矢印）、白血球浸潤（矢印）などの大腸炎の典型的な兆候を分析しましたおよび潰瘍（*）。大腸炎+補遺の全体的な組織形態。グループは、より多くのDSS大腸炎に対する全体的な保護効果を証明し、大腸炎群よりもコントロールのそれに似ています。画像は、グループごとに3つの独立した組織標本の代表的なものです。画像は、10倍の対物レンズを用いて撮影しました。バー=100μmです。 （B）各群の8ミクロン結腸凍結切片は、ZO-1に対する抗体（緑色）およびE-カドヘリン（赤）で染色しました。 （マージされた画像で黄色;矢印）の共局在性大腸炎の間に失われている陰窩の上皮細胞接触におけるE-カドヘリンとZO-1、のは、主に大腸炎+補遺に保存されています。グループ。画像は3の代表的なものです独立した組織標本。バー=50μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3好中球リクルートメント、酸化ストレスおよび炎症性サイトカインの産生は栄養補助食品によって低減することができます。 （A）ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性は、実験群における大腸組織への白血球動員の量を分析するために測定した：（。大腸炎+補遺）コントロール（CTRL）、大腸炎、および大腸炎+栄養補助食品。群あたりn = 5; * P <0.05。データは、SDM平均±として示されています。統計は、一方向ANOVAにより計算しました。 （B）酸化エチジウムの蛍光、共同の8μmの凍結切片における酸化ストレスの指標として赤で示されていますLON組織を、レーザー共焦点顕微鏡法によって記録しました。画像は3つの独立した組織標本の代表的なものです。バー=100μmです。 （C）プロ炎症性サイトカインの産生IL1β及びIL-6およびKCは（白黒が明確化のために戻された）を1.5％アガロースゲルで半定量的RT-PCRによって決定したケモカイン。 βアクチンは、ハウスキーピング遺伝子を務めました。三つの独立のcDNA調製物の代表的な画像が示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
臨床試験での栄養補助食品を使用するために、そのようなサプリメントの利点及び安全性を慎重に動物実験においてインビボで評価されなければなりません。大腸炎の場合には、IBDの臨床症状に似ているいくつかの適切な動物モデルは、DSS、TNBS、または酢酸を用いて化学モデルを含む、確立されています。ノックアウトなどIL10-KOとして（KO）モデル。養子T細胞転写19-21を用いて免疫細胞媒介性大腸炎。大腸炎のDSSモデルは、ヒトIBDの多くの疾患症状に似ており、大腸炎22の分子機構を調査する研究の大量に使用されている大腸炎を誘導する迅速かつ信頼できる方法です。また、DSS大腸炎は可逆的であり、colitogenic刺激が除去された後にこのようにしても、組織治癒の研究を可能にします。提供されたプロトコルを詳細に以前に私たちの研究室8に最適化されているDSS大腸炎モデルを説明します。
ここで説明するように、エバンスブルー色素アッセイ;：巨大分子のための腸管上皮の透過性を分析するために、3つの主要な方法は、文献全体で使用されてきました腸ループ内の4-kDaのFITCデキストランの点滴。および4-kDaのFITCデキストラン13,24,25の供給。後者のアッセイでは、FITCデキストランは、胃管栄養法により供給され、および上皮を越えて血流に漏出したFITCデキストランの量は、血清試料からの蛍光定量測定します。トレーサーは食道から直腸までのすべての方法を通過するので、このアッセイでは、消化管全体の透過性は、測定され、トレーサーのほとんどは、結腸に到達する前に通過します。ループモデルでは、透過性ループ（通常小腸）25に使用される限られた腸領域で測定されます。対照的に、エバンスブルーアッセイは、トレーサーを直接結腸全体に注入されるので、結腸内のみ上皮透過性を測定するという利点を有します。したがって、このアッセイを用いて、我々は、結腸上皮、ダイエットサプリメントで保護されていると結論付けることができます。
いくつかのデータは、（ 例えば、透過性のASSAにエバンスブルーをリークしたので、抽出後および他のアッセイのための組織を使用する前に、結腸重量と長さを記録することは常に重要ですy）は、組織1gあたりに発現されます。また、重量対長さの比は、組織の損傷26の独立した読み出しです。ここで説明したように、一般に、組織形態は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したパラフィン包埋組織を用いて分析します。パラフィン包埋組織の形態は、他の埋め込み方法に比べてはるかに優れた保存されているという利点を有します。このことは、粘膜内の異なる細胞タイプの明確な同定を可能にする（ すなわち、免疫細胞、上皮細胞、杯細胞、 等 ） のような浮腫形成、白血球浸潤、および上皮頂端びらん等の大腸炎の間の組織の変化の分析。一方、パラフィンは免疫蛍光染色のみ時間のかかるエピトープ回復した後に行うことができないという欠点を有しています。したがって、我々は常にOCT化合物の異なる凍結組織生検を準備します。そのような組織試料を容易にクライオスタットを用いて切片とAUTの低いレベルを示すことができofluorescence。 （メタノールが行うように）、それはアクチンフィラメントと干渉しないでもないので、私たちは脱水により固定用エタノールを使用し、また（PFAがするように）それは、自家蛍光を誘発しません。これらの技術を用いて、我々は、抗炎症性および抗酸化ダイエットサプリメントは、大腸炎（ 図2を比較）中の組織形態および接合構造を改善することができることを見出しました。
過度の好中球動員は、炎症17に応答して、化学誘引物質の産生により誘導される大腸炎の中に重要なイベントです。好中球が炎症キューの除去とその後の創傷治癒に貢献するため、好中球動員は、生理的なイベントです。この先天性免疫応答を適切に制御し、終了しない場合は、粘膜における好中球は、プロテアーゼおよび反応性酸素種を放出することによって組織の損傷に寄与することができます。好中球は、容易に測定することができるMPOを含有し、使用して定量MPOの量は、好中球の数に直接比例する比色アッセイ。 図3Aは、大腸炎、その食事介入中の好中球動員の増加が、この過剰な及び制御されない免疫応答を抑制することができることを示しています。粘膜で豊富な好中球の存在に応じて、酸化ストレスは、大腸炎（ 図3B）の間に増加します。
私たちのダイエットサプリメントは明らかに可能性が最も高い減少好中球動員の結果である酸化ストレスから粘膜を保護します。前述のように、好中球は、ケモカインによって引き寄せられ及びケモカインの生産は、大腸炎の間、様々な細胞型によって分泌される炎症誘発性サイトカインによって誘導されます。したがって、我々は、減少した好中球の動員が減少サイトカインおよびケモカイン産生の結果であると仮定する。 図3Cは、炎症性サイトカインIL-1βおよびIL-6ことを実証、並びにケモカインKCは、DSS誘導性大腸炎の間にアップレギュレートされています。ダイエットサプリメントは、レベルを制御するために戻ってIL-6のレベルを反転し、IL-1βおよびKCの増産を改善しました。注目すべきは、KCは、マウスの好中球のための最も重要な化学誘引物質です。
これにより、組織形態の観察された保存が原因で、順番に、KCの減少生産の結果である減少、好中球浸潤、であると推測することは魅力的です。残留DSSは、単離されたRNA中に存在する場合、RT-PCRにより、DSS処理された組織中のRNAの産生を分析して問題があります。 DSSは、逆転写酵素およびTaq-ポリメラーゼの両方を阻害するためです。全く増幅が達成できない場合、他の場所27に記載のように、さらに、LiClを媒介沈殿によりRNA試料を精製する必要があります。
要約すると、我々は詳細にDSS大腸炎の間に組織の損傷の分析方法と、このDのためのさまざまな方法を記述するamageは、栄養補助食品によって改善することができます。このような動物実験から得られた知識は、人間のIBDにおける分析サプリメントの保護効果を調査するために患者コホートの設立を正当化することができます。臨床試験から得られたデータは、IBDの管理のための代替治療戦略を開発するために新しい道を開く可能性があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、科学技術のためのメキシコ評議会（Conacyt、マイケルSchnoorに207268と233395）からの助成金によってサポートされていました。 KFCOは、修士の学位を取得するためにConacyt奨学金（396260）の受取人です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% of gelatin | Bioxon | 158 | |
| 10% formaldehyde | J.T. Baker | 2106-03 | |
| 96-well plate with flat bottom | Corning | 3368 | |
| Absolute ethanol | J.T. Baker | 9000-03 | |
| Absolute xylene | J.T. Baker | 9490-03 | |
| ABTS | Sigma Aldrich | H5882 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| ColoScreen | Helena Laboratories | 5072 | |
| Corabion (Kindly provided by Merck, Naucalpan, Mexico) | Merck | ||
| Dextran Sulfate Sodium Salt | Affymetrix | 9011-18-1 | (M.W. 40,000-50,000) |
| Dihydroethidium | Life Technology | D11347 | |
| Eosin-Y | J.T. Baker | L087-03 | |
| Evans blue | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Feeding needle | Cadence Science Inc. | 9921 | |
| Glass slide rack with handle | Electron Microscopy | 70312-16 | |
| Glass Slides | Corning | 2947 | |
| Harris hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hexadecyltrimethyammonium (HTAB) | Sigma Aldrich | H6269 | |
| Histosette (Embedding cassette) | Simport | M498.2 | |
| Hydrochloric acid 1 M | J.T. Baker | 9535-62 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H3410 | |
| Ketamine | PiSA Agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Liquid paraffin | Paraplast | 39501-006 | |
| Lithium carbonate | Sigma-Aldrich | 2362 | |
| N,N-dimethylformamide | J.T. Baker | 68-12-2 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Plastic cubes | Electron Microscopy | 70181 | |
| Poly-L-Lysine Solution | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | |
| Prism 5 statistical software | GraphPad Software | Prism 5 | |
| Saline Solution 0.9% NaCl | CS PiSA | Q-7833-009 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Synthetic resin | Poly Mont | 7987 | |
| Taq DNA polymerase | Invitrogen | 11615-010 | |
| Tissue-tek. O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Tuberculine Syringe | BD Plastipak | 305945 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Xylazine | PiSA Agropecuaria | Q-7833-099 |
References
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