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Genetics

शारीरिक ऑक्सीजन स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में कैप बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण

Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/55112
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Introduction

ट्रांसलेशनल नियंत्रण जीन अभिव्यक्ति में transcriptional विनियमन के लिए एक समान रूप से महत्वपूर्ण कदम के रूप में उभर रहा है, विशेष रूप से सेलुलर तनाव 1 की अवधि के दौरान। अनुवाद नियंत्रण का केन्द्र बिन्दु दीक्षा की दर सीमित कदम (एम 7 जीटीपी) 5 'mRNAs 2 की टोपी जहां प्रोटीन संश्लेषण के पहले चरण 7-methylguanosine को यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 4E (eIF4E) के बंधन को शामिल में है । eIF4E एक trimeric eIF4F नामित जटिल है कि eIF4A, एक शाही सेना helicase, और eIF4G, एक मचान प्रोटीन अन्य कारकों अनुवाद और 40 राइबोसोम 3 की भर्ती के लिए आवश्यक भी शामिल है का हिस्सा है। सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, mRNAs के विशाल बहुमत एक टोपी पर निर्भर तंत्र के माध्यम से अनुवाद कर रहे हैं, लेकिन सेलुलर तनाव के समय के तहत मानव mRNAs का लगभग 10% 5 'UTRs कि 1,4 intiation टोपी स्वतंत्र अनुवाद की अनुमति दे सकता है होते हैं। कैप पर निर्भर अनुवाद ऐतिहासिक पर्याय किया गया हैous eIF4F साथ, तथापि, eIF4F के तनाव-विशिष्ट रूपों एक trending विषय 5-8 बन गए हैं।

विभिन्न सेलुलर तनाव का कारण eIF4E गतिविधि rapamycin जटिल 1 (mTORC1) के स्तनधारी लक्ष्य के माध्यम से दमित किया जाना है। इस काइनेज तनाव है, जो अपने लक्ष्यों में से एक की वृद्धि की गतिविधि में परिणाम के तहत भ्रष्ट हो जाता है, 4E बाध्यकारी प्रोटीन (4E-बीपी)। गैर-फॉस्फोरिलेटेड 4E-बीपी eIF4E और ब्लॉक करने के लिए eIF4G टोपी पर निर्भर अनुवाद 9,10 के दमन के कारण के साथ बातचीत करने के लिए अपनी क्षमता को बांधता है। दिलचस्प बात यह है eIF4E की एक Homolog eIF4E2 (या 4EHP) का नाम शायद यह तनाव की मध्यस्थता दमन से बचने के लिए अनुमति देता है, 4E-बीपी 11 के लिए एक बहुत कम संबंध है। दरअसल, शुरू में eIF4G 12 के साथ बातचीत की कमी के कारण अनुवाद का एक repressor के रूप में होती, eIF4E2 hypoxic तनाव 6,13 दौरान mRNAs है कि उनके 3 'UTR में शाही सेना हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्व होते सैकड़ों की बात शुरू की। इस सक्रियण मैंeIF4G3, आरएनए प्रोटीन मूल भाव 4, और हाइपोक्सिया inducible कारक (HIF) 2α बाध्यकारी एक hypoxic eIF4F जटिल है, या eIF4F एच 6,13 का गठन करने के साथ बातचीत के माध्यम से प्राप्त कर रहा है। सामान्य परिस्थितियों में एक repressor के रूप में, eIF4E2 GIGYF2 और ZNF598 14 के साथ बांधता है। इन परिसरों थे, भाग में, agarose से जुड़े एम 7 जीटीपी समानता रेजिन के माध्यम से पहचान की। इस क्लासिक विधि 15 अनुवाद के क्षेत्र में मानक है और सबसे अच्छा और सबसे अधिक तकनीक का इस्तेमाल नीचे खींचने में टोपी बाध्यकारी परिसरों को अलग करने के लिए और इन विट्रो में बाध्यकारी assays 16-19 है। टोपी पर निर्भर अनुवाद मशीनरी के रूप में लचीला और अंतर-बदलते भागों 6-8,13 साथ अनुकूलनीय में उभर रहा है के रूप में, इस विधि तेजी से उपन्यास टोपी बाध्यकारी तनाव की प्रतिक्रिया में शामिल प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके अलावा, eIF4F में बदलाव व्यापक प्रभाव पड़ सकता है कई यूकेरियोटिक मॉडल प्रणाली तनाव प्रतिक्रियाओं इस तरह के लिए एक eIF4E2 homolog का उपयोग करने के रूप में प्रकटए thaliana 20 के रूप में, एस पोम्ब 21, डी मेलानोगास्टर 22, और 23 सी एलिगेंस।

सबूत बताते हैं कि eIF4F में बदलाव सख्ती से तनाव की स्थिति है, लेकिन सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान 24 में शामिल किया जा सीमित नहीं किया जा सकता है। (केशिका सिरों पर) या ऊतकों के भीतर ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति (microelectrodes के माध्यम से मापा जाता है) मस्तिष्क 25 में 2-6% से भिन्न होता है, फेफड़ों 26 में 3-12%, आंत 27, 4% में 3.5-6% जिगर 28, गुर्दे की 29 में 7-12%, मांसपेशियों में 30 में 4%, और अस्थि मज्जा 31 में 6-7%। कोशिकाओं और माइटोकॉन्ड्रिया 1.3% ऑक्सीजन 32 की तुलना में कम होते हैं। इन मूल्यों को बहुत परिवेशी वायु जहां कोशिकाओं को नियमित सुसंस्कृत हैं की तुलना में हाइपोक्सिया के करीब हैं। यह पता चलता है कि क्या पहले के रूप में हाइपोक्सिया-विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं एक शारीरिक सेटिंग में प्रासंगिक हो सकता है लगा रहे थे। दिलचस्प बात यह है eIF4F और eIF4F एच 24 से अवगत कराया कई अलग अलग मानव कोशिका लाइनों में अलग पूल या mRNAs की कक्षाओं का अनुवाद दीक्षा में भाग लेते हैं। कम ऑक्सीजन भी उचित भ्रूण के विकास 33 ड्राइव और कोशिकाओं को आम तौर पर उच्च प्रसार दर, अब जीवनकाल, कम डीएनए की क्षति और कम physioxia 34 में सामान्य तनाव प्रतिक्रियाओं की है। इसलिए, eIF4F एच संभावना शारीरिक शर्तों के तहत चुनिंदा जीनों की अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कारक है।

यहाँ, हम तय शारीरिक ऑक्सीजन की स्थिति में या एक गतिशील अस्थिर रेंज ऊतक microenvironments की संभावना अधिक प्रतिनिधि है कि संस्कृति की कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस पद्धति का एक लाभ यह है कि कोशिकाओं हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के भीतर lysed रहे हैं। यह कैसे सेल को hypoxic सेल संस्कृति से संक्रमण अन्य प्रोटोकॉल में किया जाता है स्पष्ट अक्सर नहीं है। प्रकोष्ठों अक्सर पहले एक छोटे से हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर से हटा रहे होसामने सेल, लेकिन ऑक्सीजन को यह जोखिम जैव रासायनिक रास्ते को प्रभावित कर सकता है के रूप में ऑक्सीजन के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया तेजी से (एक या दो मिनट) 35 है। कुछ टोपी बाध्यकारी प्रोटीन एक दूसरे के साथ बातचीत के आधार की आवश्यकता होती है या एम 7 जीटीपी, इसलिए कुछ टोपी interactors शुद्धिकरण की प्रक्रिया में याद किया जा सकता hydrolyze कर सकते हैं। Agarose से जुड़े enzymatically प्रतिरोधी टोपी analogs करने के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यहाँ वर्णित विधि के माध्यम से गतिविधि और eIF4F एच और eIF4F के अन्य रूपों की संरचना की खोज जटिल जीन अभिव्यक्ति मशीनरी है कि कोशिकाओं को शारीरिक शर्तों या तनाव प्रतिक्रियाओं के दौरान उपयोग पर प्रकाश डाला जाएगा।

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Protocol

1. सेल संस्कृति के लिए तैयारी

  1. मानव कोशिकाओं की व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शेयरों की खरीद।
    नोट: इस प्रोटोकॉल HCT116 कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और प्राथमिक मानव गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (HRPTEC) का इस्तेमाल करता है।
  2. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / उच्च ग्लूकोज मध्यम 7.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक: HCT116 की संस्कृति के लिए 500 मिलीलीटर मध्यम बनाओ।
  3. उपकला सेल के माध्यम 5% FBS, 1% उपकला सेल के विकास के पूरक के साथ पूरक, और 1% पी / एस: HRPTEC की संस्कृति के लिए 500 मिलीलीटर मध्यम बनाओ।
  4. 140 मिमी NaCl, 3 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 15 मिमी 2 के.एच. पीओ 4: 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 500 मिलीलीटर की तैयारी। 7.4 पीएच को समायोजित करें और 121 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए autoclaving द्वारा बाँझ।

2. सेल संवर्धन की शुरूआत

  1. ध्यान से टी परेशान करने के बिना एक 80-90% मिला हुआ पकवान से मध्यम aspirateवह कोशिकाओं।
  2. संस्कृति पकवान प्रति 1x पीबीएस के विभाज्य 3-5 मिलीलीटर, धीरे पकवान की सतह क्षेत्र कोट करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क रॉक, और ध्यान से 1x पीबीएस aspirate। एक दूसरे 1x पीबीएस धोने के लिए दोहराएँ।
  3. अशेष प्रत्येक संस्कृति डिश में 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर और धीरे समान रूप से कोट trypsin-EDTA के साथ कोशिकाओं के लिए रॉक। 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 90 सेकंड के लिए 4000 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण।
  5. पूरा DMEM के 1 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली।
  6. एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कोशिकाओं की गणना। गणना कितने गैर pyrogenic और polystyrene 100 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन 2 सेमी के अनुसार लगभग 2,500-5,000 कोशिकाओं का एक प्रारंभिक बोने घनत्व को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।
  7. पूर्व गर्म पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से कदम 1.2 या 1.3 30-45 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में में बनाया है।
  8. मध्यम बोतल और 70% इथेनॉल के साथ सेल शीशी शुद्ध करना। इस बिंदु से लेकर आगेसंचालन aseptically किया जाना चाहिए।
  9. अशेष के रूप में कई 100 मिमी सेल संस्कृति बोने घनत्व 2.6 चरण में उल्लेख भीतर जमे हुए कोशिकाओं की पूरी मात्रा का उपयोग करने के लिए आवश्यक बर्तन में पूरा DMEM के 6 मिलीलीटर।
  10. 100 मिमी संस्कृति बर्तन में से प्रत्येक के 2.6 चरण में गणना की सेल निलंबन की मात्रा स्थानांतरण। एक थाली मैन्युअल रॉक समान रूप से थाली की सतह पर कोशिकाओं को वितरित करने के लिए।
  11. एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वरीयता प्राप्त 100 मिमी सेल संस्कृति डिश रखें। कोशिकाओं अगले कदम से पहले कम से कम 24 घंटा सेते दें।

3. Subculturing

  1. एक खुर्दबीन के तहत प्रत्येक सेल संस्कृति डिश देखें (% कोशिकाओं पकवान के क्षेत्र को कवर) सेल confluency का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए। इनक्यूबेटर और पूर्व गर्म पूरा मध्यम और 1x पीबीएस में कोशिकाओं लौटें। अगले कदम के लिए आगे बढ़ते हैं तो कोशिकाओं 80-100% मिला हुआ हैं।
  2. ध्यान से परेशान बिना खर्च मध्यम aspirateप्रत्येक संस्कृति डिश में कोशिकाओं।
  3. संस्कृति पकवान प्रति 1x पीबीएस के विभाज्य 3-5 मिलीलीटर, धीरे पकवान की सतह क्षेत्र कोट करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क रॉक, और ध्यान से 1x पीबीएस aspirate। एक दूसरे 1x पीबीएस धोने के लिए दोहराएँ।
  4. अशेष प्रत्येक संस्कृति डिश में 0.05% trypsin EDTA के 3 मिलीग्राम और धीरे रॉक समान रूप से कोट trypsin-EDTA के साथ कोशिकाओं के लिए। 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. इस ऊष्मायन के दौरान, विभाज्य के रूप में कई संस्कृति बर्तन में पूरा मध्यम के 10 मिलीलीटर 2 सेमी प्रति 2,500-5,000 कोशिकाओं की सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।
  6. कोशिकाओं की थाली से अलग कर दिया है, जल्दी से 1x परिभाषित trypsin अवरोध के 3 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे 1 मिनट के लिए पकवान ज़ुल्फ़ सुनिश्चित करने के लिए कि trypsin-EDTA के सभी निष्प्रभावी कर दिया गया है।
  7. एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग कोशिकाओं स्थानांतरण और अलग निर्धारित करें। किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा होते हैं, और एक ही 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए कि डिश के लिए पीबीएस 1x 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. 150 XG centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं5 मिनट के लिए।
  9. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पूरा मध्यम के 3 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend।
  10. एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 150 मिमी संस्कृति पूरा मध्यम के 15 मिलीग्राम से युक्त 2 सेमी प्रति 2,500-5,000 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए व्यंजन बीज। प्रत्येक टोपी बाध्यकारी परख के लिए दो 150 मिमी का प्रयोग करें।
    नोट: तरल मीडिया के माध्यम से कोशिकाओं को ऑक्सीजन प्रसार मात्रा 36 पर निर्भर है। यह मीडिया के प्रयोगों के बीच लगातार की मात्रा रखने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं या निलंबन में कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं कि क्या सिफारिश की है। मीडिया के पूर्व वातानुकूलित किया जा सकता प्रसार में इन variabilities से बचने के लिए (24 घंटा के रूप में चर्चा में चर्चा के लिए कार्य केंद्र में incubated)।
  11. एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वरीयता प्राप्त संस्कृति बर्तन रखें। कोशिकाओं अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कम से कम 24 घंटा सेते दें।

4. Physioxic एक्सपोजर

  1. खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं देखें। BES के लिएटी परिणाम है, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को एक 24 घंटा तक पहुंचाने के लिए 70-80% मिला हुआ है, एक 48 घंटे के प्रदर्शन के लिए 50-60% मिला हुआ है, और एक 72 घंटा तक पहुंचाने के लिए 40-50% मिला हुआ हैं।
  2. कोशिकाओं वांछित समय (24, 48, या प्रयोग के आधार पर 72 घंटा) के लिए एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में रखें।
  3. उचित physioxia करने के लिए कार्य केंद्र की स्थापना की।
    नोट: उदाहरण के लिए, एक 3% 2 हे सेटिंग 5% सीओ 2 और 92% एन 2 के साथ किया जाएगा।
    नोट: एक गतिशील रेंज के भीतर ऑक्सीजन के उतार चढ़ाव के साधन में खत्म वांछित हैं एक विशिष्ट समय, कार्यक्रम अनुसूची या मैन्युअल वांछित अंतराल पर ऑक्सीजन सेटिंग्स समायोजित हैं।
  4. 60% तक की नमी को सेट करें। वर्कस्टेशन माहौल फिर भी बहुत शुष्क है, और मीडिया में काफ़ी लंबे प्रयोगों (> 48 घंटा) के दौरान लुप्त हो जाएगा। (ताकि मीडिया वर्कस्टेशन वातावरण के साथ equilibrated है) कार्य केंद्र के भीतर एक सेल संस्कृति फ्लास्क में एक मीडिया आरक्षित रखने सेल संस्कृति जिले में मीडिया की भरपाई करने केवह।
    नोट: कोई समाधान है कि कोशिकाओं सेल (जैसे पीबीएस और trypsin EDTA के रूप में) से पहले के साथ बातचीत करेंगे हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के भीतर उपयोग करने से पहले 24 घंटे के लिए पूर्व वातानुकूलित किया जाना चाहिए ताकि भंग ऑक्सीजन वायुमंडलीय ऑक्सीजन 36 के साथ equilibrates।
  5. सेल तक कार्य केंद्र के भीतर कोशिकाओं रखें।

5. कैप-बाध्यकारी परख के लिए तैयारी बफ़र

  1. 1x Tris बफर खारा (टीबीएस) तैयार करें।
    1. DH 2 हे की 800 मिलीलीटर में, 8.76 छ NaCl और 6.05 छ Tris आधार भंग।
    2. 1 एम एचसीएल का उपयोग कर 7.4 के अंतिम पीएच का हल लाओ।
    3. DH 2 ओ का उपयोग कर 1 एल के लिए अंतिम मात्रा लाओ
  2. गैर अप्राकृतिकरण lysis बफर तैयार करें। सेल तैयार टोपी बाध्यकारी परख के दिन बफर। खाली agarose मोती और γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोती (कदम 7.9 और 7.13) धोने के लिए अतिरिक्त lysis बफर बनाओ।
    1. DH 2 हे के 7 मिलीलीटर में, 160 μl 5 एम एनएसी जोड़नेएल, 160 μl 1 एम Tris एचसीएल पीएच 7.4, 40 μl 200 मिमी NAF, 40 μl 1 एम 2 MgCl, और 40 μl 1 मिमी सोडियम orthovanadate।
    2. 7 मिलीलीटर समाधान के लिए Igepal के 40 μl जोड़ें। पिपेट की नोक कटौती करने में मदद करने के लिए Igepal पुनः प्राप्त के रूप में यह बहुत चिपचिपा है।
    3. , ऊपर और नीचे pipetting, या भंवर द्वारा मिक्स 7 मिलीलीटर समाधान जब तक Igepal के सभी भंग कर दिया गया है।
    4. 8 मिलीलीटर के समाधान के अंतिम मात्रा बढ़ाने के लिए और बर्फ पर रख।
  3. 4x सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) -PAGE नमूना बफर तैयार करें।
    1. एक बीकर में, 16 एमएल 1 एम Tris एचसीएल पीएच 6.8, 12.64 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, और 8 मिलीग्राम dithiothreitol (डीटीटी) गठबंधन।
    2. एसडीएस के 3.2 जी और bromophenol नीले रंग की 0.16 ग्राम जोड़ें। पाउडर पूरी तरह से एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ मिश्रण से भंग करने की अनुमति दें।
    3. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

6. सेल

  1. गैर denaturing lysis बफर तैयार है और बर्फ पर वीं के दिन रखने केई टोपी बाध्यकारी परख।
  2. पूर्व गर्म 1x पीबीएस और 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में trypsin।
  3. अशेष 980 प्रत्येक टोपी बाध्यकारी परख के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में lysis बफर के μl प्रदर्शन किया जा रहा है।
  4. lysis बफर के 980 μl को 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl फ्लोराइड हाइड्रोक्लोराइड के 10 μl और 100x protease अवरोध कॉकटेल के 10 μl जोड़ें। बर्फ पर रखें।
  5. हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के भीतर एक कचरे के कंटेनर में प्रत्येक 150 मिमी पकवान से मीडिया त्यागें।
  6. गर्म 1x पीबीएस के 3-4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें और तरल के सभी त्यागें।
  7. प्रत्येक पकवान गर्म 0.05% trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 2 मिनट के लिए या कोशिकाओं नहीं रह प्लेट का पालन कर रहे हैं जब तक बैठते हैं।
  8. एक विंदुक का प्रयोग, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए एक थाली की कोशिकाओं को हस्तांतरण। जरूरत के रूप में तो यह है कि कोशिकाओं में से प्रत्येक प्लेट एक अलग 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को सौंप दिया है दोहराएँ।
  9. 90 सेकंड के टी के लिए 6000 XG पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों अपकेंद्रित्रओ गोली कोशिकाओं।
  10. गोली परेशान बिना trypsin एक पिपेट का उपयोग aspirate। गोली 90 सेकंड के लिए 6000 XG पर परेशान है, तो फिर से सेंट्रीफ्यूज 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
  11. धीरे सिर्फ गोली ऊपर ट्यूब में पीबीएस के 200 μl pipetting द्वारा गर्म 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पुनः सेंट्रीफ्यूज गोली परेशान है।
  12. गोली परेशान बिना पीबीएस aspirate।
  13. 1 मिलीलीटर से पिपेट 500 μl पहले सेलुलर गोली पर lysis बफर समाधान तैयार किया। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा पूरी तरह से गोली Resuspend।
  14. दूसरी सेल गोली के साथ resuspended कोशिकाओं का मिश्रण है और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा दूसरी गोली resuspend। इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक सभी छर्रों संयुक्त किया गया है और प्रत्येक नमूना के लिए resuspended।
  15. शेष 500 एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में lysis बफर के μl के साथ lysate जुडा है।
  16. हाइपोक्सिया कार्य केंद्र से नमूने निकालें।
    नोट: lysis बफर जोड़ने के बाद, एककरूँगा बाद के चरणों परिवेशी वायु में प्रदर्शन किया जा के रूप में हाइपोक्सिया कार्य केंद्र 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट कर दिया जाता है और निम्न चरणों का प्रदर्शन किया जा करने के लिए ठंड (4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर) कर रहे हैं।
  17. Lyse 1.5-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने घूर्णन द्वारा कोमल आंदोलन का उपयोग कोशिकाओं।
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर lysed कोशिकाओं अपकेंद्रित्र सेलुलर मलबे को हटाने के लिए।
  19. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब lysate स्थानांतरण और गोली त्यागें।
  20. रिजर्व सतह पर तैरनेवाला के एक हिस्से (5-10%) भविष्य पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक पूरे सेल lysate इनपुट नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।

7. कैप-बाध्यकारी परख

  1. प्रत्येक नमूना के लिए, अलग करने के लिए 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों खाली agarose मनका नियंत्रण घोल के 50 μl और γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मनका घोल के 50 μl हस्तांतरण। कैंची का प्रयोग पिपेट की नोक दूर करने के लिए मनका घोल के संग्रह की सुविधा के लिए।
  2. गोली मोती बीy 30 सेकंड के लिए 500 XG पर घोल centrifuging।
  3. सतह पर तैरनेवाला ध्यान से निकालें और टीबीएस के 500 μl में मोती resuspend।
  4. दोहराएँ 7.2 और 7.3 कदम। 30 सेकंड के लिए 500 XG पर मोती गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  5. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge खाली agarose मोती युक्त ट्यूब के लिए कदम 6.19 से lysate युक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    नोट: खाली agarose मोती lysate कि गैर विशेष मनका के साथ बातचीत से प्रोटीन को हटाने के लिए एक पूर्व समाशोधन कदम के रूप में काम करते हैं।
  6. कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. 30 सेकंड के लिए 500 XG पर centrifuging द्वारा खाली agarose मोती गोली।
  8. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोती युक्त ट्यूब के लिए lysate स्थानांतरण।
  9. , Lysis बफर के 500 μl में मोती resuspending 30 सेकंड के लिए 500 XG पर centrifuging द्वारा मोती pelleting, और superna discarding द्वारा खाली agarose मोती धोउग्रवादी। पांच washes के एक कुल के लिए दोहराएँ इस चार बार।
  10. 1x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर में खाली agarose मोती Resuspend, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 90 सेकंड के लिए मोती फोड़ा। भविष्य पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर का निरीक्षण करने के लिए ब्याज की प्रोटीन मनका को बांधता है कि क्या गैर-विशेष रूप से।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोतियों के साथ lysate सेते टोपी बाध्यकारी प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए।
  12. 30 सेकंड के लिए 500 XG पर centrifuging द्वारा γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोती गोली। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  13. कदम 7.9 दोहरा द्वारा γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोती धो लें।
  14. lysis बफर के 600 μl में मोती resuspend।
  15. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जीटीपी जोड़ें।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोती कोमल आंदोलन के साथ + 1 मिमी जीटीपी सेते हैं। नोट: यहप्रोटीन है कि गैर विशेष मीटर 7 जीटीपी के साथ बातचीत को अलग होगा (यानी, गैर-मिथाइल जीटीपी के साथ बातचीत)।
  17. 30 सेकंड के लिए 500 XG पर centrifuging द्वारा γ-aminophenyl एम 7 जीटीपी agarose C10-लिंक्ड मोती गोली।
  18. एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और 4x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, 100 मिमी डीटीटी, 2% एसडीएस, 0.1% bromophenol नीले, और 10% ग्लिसरॉल) के 200 μl जोड़ें। भविष्य पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 37 -20 डिग्री सेल्सियस पर जीटीपी नियंत्रण नमूना स्टोर। कदम 7.9 दोहरा द्वारा मोती धो लें।
  19. 90 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1x एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर (50 मिमी Tris एचसीएल, 100 मिमी डीटीटी, 2% एसडीएस, 0.1% bromophenol नीले, और 10% ग्लिसरॉल), और फोड़ा में मोती resuspend। भविष्य पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 37 -20 डिग्री सेल्सियस पर मीटर 7 जीटीपी बाध्य अंश स्टोर।

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Representative Results

एक एम 7 जीटीपी आत्मीयता स्तंभ में eIF4E और eIF4E2 की ऑक्सीजन के जवाब में कैप बाध्यकारी क्षमता का विश्लेषण

आंकड़े 1 और 2 दो मानव कोशिका लाइनों में ऑक्सीजन के उतार चढ़ाव के जवाब में दो प्रमुख टोपी बाध्यकारी प्रोटीन की खासियत मीटर 7 जीटीपी आत्मीयता शुद्धि के पश्चिमी blots प्रतिनिधित्व करते हैं: प्राथमिक मानव गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर उपकला एफ igure 1 और कोलोरेक्टल कार्सिनोमा में कोशिकाओं (HRPTEC) ( HCT116) चित्रा 2 में। कोशिकाओं 24 घंटे के लिए संकेत ऑक्सीजन की उपलब्धता पर रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए तरल मीडिया में घुलित ऑक्सीजन हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के भीतर हवा के साथ equilibrated है। इनपुट लेन (IN) एम 7 जीटीपी से जुड़े agarose मोती टोपी बाध्यकारी प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए जोड़ रहे हैं इससे पहले पूरे सेल lysate के 10% का प्रतिनिधित्व करता है। इस इनपुट लेन एक आधारभूत संवर्धन को मापने के लिए के रूप में प्रयोग किया जाता हैएम 7 जीटीपी अधोगामी में एक लक्ष्य प्रोटीन की। जीटीपी लेन मीटर 7 जीटीपी मोती है कि 1 मिमी जीटीपी साथ Elute थे से eluate है। यह कदम प्रोटीन भी है कि गैर-मिथाइल जीटीपी को पहचान का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। टोपी बाध्यकारी प्रोटीन eIF4E और eIF4E2 को पहचान एम 7 जीटीपी विशेष रूप से, लेकिन उनके Homolog eIF4E3 (यहाँ दिखाया गया है) भी गैर methylated जीटीपी को बांधता है। 5 'mRNA टोपी संरचना (एम 7 जीटीपी) बाध्य करने eIF4E और eIF4E2 की क्षमता (कुल उपलब्ध पूल) इनपुट लेन में तीव्रता मीटर 7 जीटीपी स्तंभ सापेक्ष में उनके बैंड की तीव्रता की तुलना द्वारा मापा जा सकता है।

इस मात्रा का ठहराव ImageJ जैसे एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ तीन जैविक प्रतिकृति के लिए प्रोटीन बैंड के पिक्सेल तीव्रता को मापने के द्वारा किया जा सकता है। परिणाम घनत्व इकाइयों (RDU) मतलब की मानक त्रुटि ± के रिश्तेदार साधन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। कच्चे मूल्यों से पहले सामान्य बनाने के लिएदोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण के नमूनों से unpaired दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण से तुलना की गई। पी <0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था। इस प्रतिनिधि प्रयोग से पता चलता है कि दो सेल लाइनों उनकी eIF4E और eIF4E2 उपयोग के लिए ऑक्सीजन की विभिन्न श्रेणियों की है। चित्रा 1 से पता चलता है कि HRPTEC में केवल eIF4E दृढ़ता से मीटर को बांधता 7 जीटीपी 8% ओ 2 (चित्रा 1 ए) पर है कि दोनों eIF4E और eIF4E2 काफी एम 7 3-5% से जीटीपी हे 2 (चित्रा 1 बी - सी) के साथ जुड़े रहे हैं, और कहा कि केवल eIF4E2 1% 2 हे (चित्रा -1) पर मीटर 7 जीटीपी करने के लिए दृढ़ता से बांधता है। चित्रा 2 में, HCT116 कोशिकाओं में, इन टोपी बाध्यकारी प्रोटीन की ऑक्सीजन पर निर्भर उपयोग अलग है: केवल eIF4E मीटर 7 जीटीपी 12% 2 हे (2A चित्रा) में, दोनों टोपी बाध्यकारी प्रोटीन मीटर से 7 काफी बाध्य करने के लिए काफी बांधता 5-8% 2 हे रेंज में जीटीपी(चित्रा 2 बी - सी), और केवल eIF4E2 काफी एम 7 जीटीपी करने के लिए 3% ओ 2 (चित्रा 2 डी) में बांधता है। जीटीपी के साथ मीटर 7 जीटीपी स्तंभ से क्षालन के अभाव से पता चलता है कि eIF4E और eIF4E2 मीटर 7 जीटीपी के लिए विशिष्ट हैं और गैर-मिथाइल जीटीपी पहचान नहीं है। बार रेखांकन तीन जैविक ImageJ का उपयोग प्रतिकृति की मात्रा का ठहराव प्रतिनिधित्व करते हैं। हमारे परिणाम है कि दो प्रमुख टोपी बाध्यकारी प्रोटीन, eIF4E और eIF4E2, एक ऑक्सीजन निर्भर तरीके में mRNA मीटर 7 जीटीपी टोपी संरचना के लिए बाध्य करने के लिए अपनी क्षमता में भिन्न होते हैं प्रदर्शित करता है।

पिछले साहित्य है कि इन दो प्रोटीन mRNAs की अनोखी कक्षाएं का अनुवाद आरंभ के आधार पर, टोपी बाध्यकारी गतिविधि में इस बदलाव ऑक्सीजन की उपलब्धता में बदलाव के लिए अनुकूल करने के लिए उत्पन्न विभिन्न proteomes में परिणाम सकता है। इस तकनीक उपन्यास अनुवाद दीक्षा कारक है कि 5 'mRNA टोपी के साथ बातचीत को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता(या टोपी बाध्यकारी प्रोटीन के साथ) इस तरह के एक मीटर 7 जीटीपी eluate के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के रूप में एक लक्षित पश्चिमी धब्बा दृष्टिकोण या एक व्यापक दृष्टिकोण के माध्यम से।

आकृति 1
चित्रा 1: eIF4E और eIF4E2 गतिविधियों 3-5% ओ 2 से HRPTEC में physioxia दौरान ओवरलैप। मानव गुर्दे समीपस्थ ट्यूबलर उपकला कोशिका में जीटीपी मोती मीटर 7 का उपयोग कर कब्जा assays (HRPTEC) lysates (ए) 8%, (बी) के 5%, (सी) 3% या (डी) 24 घंटे के लिए 1% 2 हे से अवगत कराया। जीटीपी, जीटीपी धोने M 7 जीटीपी के लिए विशिष्टता को मापने के लिए; एम 7 जीटीपी, जीटीपी धोने के बाद मीटर 7 जीटीपी मोतियों के लिए बाध्य प्रोटीन। प्रतिनिधि पश्चिमी blots दिखाया जाता है और कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा ImageJ द्वारा मात्रा और रिश्तेदार घनत्व इकाइयों के रूप में व्यक्त किया गया (आरडीयू) के पूरे सेल lysate के 10% इनपुट (IN) के सापेक्ष। * पी <0.05 (unpaired दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण) एक महत्वपूर्ण परिवर्तन जब टोपी बाध्य अंश (एम 7 जीटीपी) में में eIF4E या eIF4E2 के संवर्धन की तुलना में माना जाता था। डाटा, तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब (SEM) के मानक त्रुटि ± मतलब है। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। टिंपनो, एस और Uniacke, जे मनुष्य की शारीरिक ऑक्सीजन के तहत संवर्धित कोशिकाओं अनुवाद के लिए अलग mRNAs की भर्ती के लिए दो टोपी बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग। 2016; 291 (20): 10772-82 24। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 eIF4E और eIF4E2 गतिविधियों 5-8 से HCT116 में physioxia दौरान ओवरलैप% 2 हे। कैद HCT116 मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (ए) 12%, (बी) 8%, (सी) 5% या (डी) 24 घंटे के लिए 3% ओ 2 से अवगत कराया lysates में जीटीपी मोती मीटर 7 का उपयोग assays। जीटीपी, जीटीपी धोने M 7 जीटीपी के लिए विशिष्टता को मापने के लिए; एम 7 जीटीपी, जीटीपी धोने के बाद मीटर 7 जीटीपी मोतियों के लिए बाध्य प्रोटीन। प्रतिनिधि पश्चिमी blots दिखाया जाता है और कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा ImageJ द्वारा मात्रा और के रूप में सापेक्ष घनत्व इकाइयों (RDU) पूरे सेल lysate के 10% इनपुट (IN) के सापेक्ष व्यक्त किया गया। * पी <0.05 (unpaired दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण) एक महत्वपूर्ण परिवर्तन जब टोपी बाध्य अंश (एम 7 जीटीपी) में में eIF4E या eIF4E2 के संवर्धन की तुलना में माना जाता था। डाटा, तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब (SEM) के मानक त्रुटि ± मतलब है। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। TimpAno, एस और Uniacke, जे मनुष्य की शारीरिक ऑक्सीजन के तहत संवर्धित कोशिकाओं अनुवाद के लिए अलग mRNAs की भर्ती के लिए दो टोपी बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग। 2016; 291 (20): 10772-82 24। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

शारीरिक ऑक्सीजन की स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में टोपी बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण उपन्यास ऑक्सीजन विनियमित अनुवाद दीक्षा कारकों की पहचान के लिए अनुमति दे सकते हैं। लिंक्ड जीटीपी agarose मोती mRNA या अन्य टोपी जुड़े प्रोटीन की 5 'टोपी के लिए इन कारकों की आत्मीयता मीटर 7 करने के लिए उनके संघ की ताकत से मापा जा सकता है। इस तकनीक का एक चेतावनी है कि यह प्रोटीन के बाद सेल की टोपी बाध्यकारी संभावित उपायों, लेकिन यह गैर denaturing की स्थिति है कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और बाद translational संशोधनों (PTMs) को बनाए रखने के तहत किया जाता है। कई प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत 5 'टोपी के लिए eIF4E परिवार के बंधन मध्यस्थता। 4E-बीपी बांध और eIF4G के साथ अपनी बातचीत अवरुद्ध और 43s पूर्व दीक्षा जटिल 38 की भर्ती को रोकने के द्वारा eIF4E represses। eIF4E / 4E-बीपी जटिल 5 'mRNA टोपी के लिए बाध्य रहता है, कि प्रतिलेख से किसी भी दीक्षा अवरुद्ध, और कर सकते हैंएम 7 जीटीपी आत्मीयता के कॉलम में eIF4E निषेध के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। इसके विपरीत, एम 7 जीटीपी स्तंभों पर eIF4G साथ eIF4E की बातचीत सक्रिय अनुवाद दीक्षा के लिए एक मार्कर हो सकता है। PTMs अनुवाद दीक्षा कारकों की गतिविधि को विनियमित करने के लिए एक और तरीका है। उदाहरण के लिए, Mnk1 द्वारा eIF4E के फोस्फोराइलेशन 5 'mRNA के लिए टोपी 39 अपने संबंध बढ़ा सकते हैं। प्रोटीन आपरिवर्तक इंटरफेरॉन प्रेरित जीन 15 (ISG15) द्वारा इनकोडिंग एक PTM कि रोगज़नक़ संक्रमण 40 के माध्यम से इंटरफेरॉन प्रेरण के जवाब में eIF4E2 की टोपी बाध्यकारी गतिविधि बढ़ जाती है। ISG15 जीन इसके प्रमोटर सुझाव है कि इस प्रणाली के कम ऑक्सीजन में eIF4E2 विनियमित सकता है में एक हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्व शामिल हैं। बहुत कम कैसे PTMs physiologically प्रासंगिक ऑक्सीजन की स्थिति के दौरान टोपी बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि को बदल सकता है के बारे में जाना है। इस तकनीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद उपन्यास ऑक्सीजन विनियमित और physiologically प्रासंगिक PTMs वें प्रकट कर सकता हैपर अनुवाद दीक्षा कारकों की गतिविधि मध्यस्थता।

एक एम 7 जीटीपी टोपी एनालॉग के साथ कब्जा करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका एक ज्ञात टोपी बाध्यकारी eIF4E या eIF4G के रूप में इस तरह के प्रोटीन immunoprecipitate और जुड़े प्रोटीन की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन करने के लिए किया जाएगा। इस रणनीति की एक सीमा है कि टोपी बाध्यकारी प्रोटीन अक्सर इस तरह के तनाव के भीतर कणिकाओं 41 के रूप में या टोपी स्वतंत्र अनुवाद 1,4 वैकल्पिक सेलुलर भूमिकाओं है। इसलिए, एम 7 जीटीपी टोपी analogs का उपयोग सबसे अच्छा, सबसे अधिक विश्वसनीय टोपी बाध्यकारी प्रोटीन को अलग-थलग करने के लिए, खासकर जब उपन्यास टोपी जुड़े प्रोटीन की जांच विधि है। एक एम 7 जीटीपी टोपी एनालॉग के उपयोग की एक सीमा है कि इस तरह के मेहतर decapping एंजाइम डीसीपी केवल मीटर 7 जीटीपी mRNA टोपी के साथ बातचीत नहीं, लेकिन यह भी रूप में कुछ टोपी बाध्यकारी प्रोटीन बाध्यकारी 42 के लिए दूसरे आधार की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस तरह के Dcp1 / Dcp2 परिसर के रूप में सामान्य रूप से decapping एंजाइमों, hydr कर सकते हैंolyze मीटर 7 जीटीपी और प्रभावी ढंग से राल क्षमता को कम। इसलिए, कुछ टोपी बाध्यकारी प्रोटीन इस विश्लेषण में खो दिया जा सकता है। इन निरंतर बाईपास के लिए, enzymatically प्रतिरोधी mRNA टोपी analogs उपयोग किया जा सकता है। दो गैर hydrolyzable टोपी analogs, mononucleotide मीटर 7 GpCH2pp या डाईन्यूक्लियोटाइड मीटर 7 GpCH2ppA डीसीपी, Dcp1, और Dcp2 43 पर कब्जा करने के लिए दिखाया गया है। ये mRNA टोपी analogs व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, लेकिन रासायनिक संश्लेषित किया जाना चाहिए नए सिरे से। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि केवल टोपी के बंधन के माध्यम से "पिगीबैकिंग" प्रोटीन या टोपी बाध्यकारी प्रोटीन के साथ बातचीत प्रोटीन पर कब्जा कर लिया जाएगा। जबकि टोपी पर निर्भर अनुवाद दीक्षा दीक्षा का प्रमुख रूप है, टोपी-स्वतंत्र तंत्र सेलुलर तनाव 1 की शर्तों के दौरान विशेष रूप से प्रचलित हैं। हालांकि, इस तकनीक के संदर्भ और अनुवाद दीक्षा 6-8,24 के क्षेत्र में उभरती प्रवृत्तियों, उपन्यास तनाव प्रेरित कारक है कि पहचान करने में देहातटोपी पर निर्भर दीक्षा में rticipate अनुसंधान के एक होनहार क्षेत्र है।

एक और पहलू है इस प्रोटोकॉल में विचार करने के लिए मीडिया में ऑक्सीजन है। एक तरल माध्यम में संवर्धन कोशिकाओं कोशिकाओं और वातावरण के बीच एक बाधा प्रदान करता है। यह दिखाया गया है कि तरल मीडिया वायुमंडलीय गैस रचना 36 के साथ संतुलित करने के लिए 24 घंटा तक लग सकते हैं। इसलिए, कोशिकाओं सेल से पहले वांछित ऑक्सीजन की उपलब्धता में 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, या मीडिया के पूर्व वातानुकूलित किया जा सकता है, तो कम incubations आवश्यक हैं। प्री-कंडीशनिंग एक बाँझ संस्कृति फ्लास्क में कम से कम 24 घंटा है कि गैस विनिमय की अनुमति देता है के लिए हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में मीडिया को बनाए रखने शामिल है। हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के भीतर कोशिकाओं के लिए शुरू की किसी भी ऑक्सीजन समाधान तेजी से इस तरह की टोपी पर निर्भर अनुवाद दीक्षा कि इस प्रोटोकॉल में जांच की जा रही है के रूप में सेलुलर संकेत दे रास्ते को बदल सकता है। कोशिकाओं में ऑक्सीजन संवेदन रास्ते की संवेदनशीलता, किसी भी समाधान है कि होगा की वजहऐसे पीबीएस और trypsin EDTA के रूप में सेल से पहले कोशिकाओं के साथ बातचीत भी कम से कम 24 घंटे के लिए पूर्व वातानुकूलित किया जाना चाहिए। सेल और बाद सेल धोने बफ़र्स ठंड इस्तेमाल किया जाना चाहिए और इसलिए नहीं 37 डिग्री सेल्सियस हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में पूर्व वातानुकूलित हैं। प्रोटीन के लिए कुछ ऑक्सीजन पर निर्भर संशोधनों सक्रिय पद-सेल हो सकता है, ठंड बफ़र्स enzymatic गतिविधियों और प्रोटीन, प्रोटीन या प्रोटीन-आरएनए परिसरों की 'फेरबदल' है कि कलाकृतियों के लिए ले जा सकता है कम से कम करने के लिए आवश्यक हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधन तंगी बढ़ाने के लिए 24 घंटे के लिए पूर्व शर्त सेल और बाद सेल धोने बफ़र्स और फिर बर्फ पर उन्हें सेते उपयोग करने से पहले कार्य केंद्र के भीतर करने के लिए हो सकता है। मीडिया और buffers तीन से अधिक दिनों के लिए हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में नहीं रखा जाना चाहिए, क्योंकि इन समाधान पानी के वाष्पीकरण के कारण ध्यान देना होगा। लंबी अवधि के अध्ययन के लिए (> 3 दिन), वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की प्रारंभिक राशि ध्यान से विचार किया जाना चाहिए। कोशिकाओं के विभाजन और पकवान की सतह क्षेत्र भीड़ हो जाता है,इस तरह के मीडिया अम्लीकरण के रूप में अन्य तनाव टोपी बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है। प्रयोग के अंतिम दिन पर, कोशिकाओं में 80-90% की एक confluency होनी चाहिए।

सेल तक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में कोशिकाओं को बनाए रखने, कोशिकाओं की राशि का इस्तेमाल किया, मोती धोने, और गैर methylated जीटीपी नियंत्रण: इस प्रोटोकॉल के भीतर चार महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। 1) वहाँ कम ऑक्सीजन में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए कई तरीके हैं। इनमें से अधिकांश छोटे कक्षों कि केवल सेल संस्कृति व्यंजन पकड़ कर सकते हैं शामिल हैं, लेकिन किसी भी हेरफेर या सेल परिवेशी वायु में कक्षों के बाहर प्रदर्शन किया जाना चाहिए। ऐसे हाइपोक्सिया inducible कारक के रूप में ऑक्सीजन संवेदन मशीनरी के घटक सक्रिय या एक या दो मिनट 35 के एक मामले में निष्क्रिय रहे हैं। इसलिए, जैसा कि पहले उल्लेख के रूप में, एक हाइपोक्सिया कार्य केंद्र में कोशिकाओं lysing महत्वपूर्ण टोपी बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि संबंधित ऑक्सीजन की उपलब्धता के साथ जुड़ा हुआ है सुनिश्चित करने के लिए है। 2) कोशिकाओं की संख्याइस प्रोटोकॉल (दो 150 मिमी बर्तन) में सुझाव मजबूत मीटर के लिए पर्याप्त है ऐसे eIF4E परिवार या eIF4F परिसर (eIF4A और eIF4G) के सदस्यों के रूप में 7 जीटीपी interactors। अधिक कोशिकाओं, कम से कम पांच 150 मिमी व्यंजन, क्षणिक बातचीत या eIF4F के माध्यम से मीटर 7 जीटीपी mRNA टोपी के साथ कि केवल सहयोगी के साथ प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है। 3) उन्हें सेल lysate साथ incubating के बाद मोती वॉशिंग एक कड़े और कम कठोर तरीके से किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक कड़े विकल्प है जहाँ lysis बफर मोती पांच बार धोने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रदान करता है। कमजोर बातचीत के साथ प्रोटीन के लिए अगर टोपी बाध्यकारी प्रोटीन ब्याज की हैं, एक कम washes के प्रदर्शन और Tris बफर खारा के बजाय lysis बफर का उपयोग कर सकते हैं। 4) हालांकि यह unconjugated agarose के साथ सेल lysate पूर्व स्पष्ट प्रोटीन है कि गैर विशेष मनका के साथ बातचीत को दूर करने, मिथाइल जीटीपी (मीटर, कुछ टोपी बाध्यकारी प्रोटीन सच mRNA टोपी संरचना के बीच अंतर नहीं कर सकते करने के लिए महत्वपूर्ण है7 जीटीपी), और गैर methylated जीटीपी। ऐसा ही एक प्रोटीन eIF4E सजात eIF4E3 44 है। जीटीपी के साथ मोती एल्यूटिंग किसी भी प्रोटीन भी है कि गैर-मिथाइल जीटीपी, जो ब्याज की हो सकती है पहचानता हटाना होगा। प्रोटीन है कि दोनों मीटर 7 जीटीपी को समझते हैं और जीटीपी अभी तक की जैविक प्रासंगिकता पूरी तरह से स्पष्ट किया जाना है। इस eIF4E3 eIF4E और eIF4E2 प्रोटीन है, जो गैर-methylated जीटीपी से पहचान एम 7 जीटीपी कर के सापेक्ष (जिसके साथ एक संरक्षित टोपी बाध्यकारी डोमेन एक सदाशयी टोपी बाध्यकारी प्रोटीन है) से जुड़े कुछ प्रकाशनों से बल दिया है।

इस तकनीक के रूप में प्रस्तुत किया है, एक लक्षित दृष्टिकोण ब्याज का मीटर 7 जीटीपी interactors की पहचान के रूप में या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से मीटर 7 जीटीपी eluate का विश्लेषण करके एक व्यापक दृष्टिकोण के रूप में किया जा सकता है। कई अन्य तकनीकों physioxic जोखिम (प्रोटोकॉल 4) का पालन कर सकते हैं इस तरह के subcellular विभाजन, immunofluorescence, सह immunoprecipitation, एक के रूप में टोपी बाध्यकारी गतिविधि का विश्लेषण करने के लिएएन डी polysome विश्लेषण। ट्रांसलेशनल नियंत्रण प्रतिलेखन के रूप में जीन अभिव्यक्ति के लिए एक समान योगदानकर्ता के रूप में उभर रहा है। इस तकनीक का उपयोग गतिविधि और टोपी बाध्यकारी परिसरों की संरचना की जांच करने के लिए कैसे टोपी पर निर्भर अनुवाद दीक्षा कम ऑक्सीजन के जवाब में विनियमित है पर प्रकाश डाला जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

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References

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आनुवंशिकी अंक 118 अनुवाद mRNA मी ऑक्सीजन टोपी eIF4E eIF4E2 जीटीपी दीक्षा शारीरिक
शारीरिक ऑक्सीजन स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में कैप बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण
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Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, … More

Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

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