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Genetics

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/55112
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph
* These authors contributed equally

Introduction

Control de la traducción está emergiendo como un paso igualmente importante para la regulación transcripcional de la expresión génica, especialmente durante los períodos de estrés celular 1. Un punto central de control de la traducción está en la etapa limitante de la velocidad de iniciación, donde los primeros pasos de la síntesis de proteínas implican la unión del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) a la 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 'cap de mRNAs 2 . eIF4E es parte de un complejo trimérico llamado eIF4F que incluye eIF4A, una helicasa de ARN, y eIF4G, una proteína de andamiaje necesario para la contratación de otros factores de traducción y los ribosomas 40S 3. En condiciones fisiológicas normales, la gran mayoría de los ARNm se traducen a través de un mecanismo dependiente de la cubierta, pero en períodos de estrés celular aproximadamente el 10% de los ARNm humanos contiene 5 'UTRs que podrían permitir la traducción independiente de caperuza intiation 1,4. traducción dependiente de la cubierta ha sido históricamente sinónimoous con eIF4F, sin embargo, las variaciones de tensión específica de eIF4F se han convertido en un tema de tendencia 5-8.

Diversos estreses celulares causan actividad de eIF4E a ser reprimida a través del objetivo de mamíferos de la rapamicina complejo 1 (mTORC1). Esta quinasa se deteriora bajo tensión, lo que resulta en el aumento de la actividad de uno de sus objetivos, la proteína de unión a 4E (4E-BP). No fosforilada 4E-BP se une a eIF4E y bloquea su capacidad para interactuar con eIF4G haciendo que la represión de la traducción dependiente de cap-9,10. Curiosamente, un homólogo de eIF4E llamado eIF4E2 (o 4EHP) tiene una afinidad mucho menor para 4E-BP 11, tal vez lo que le permite evadir la represión mediada por el estrés. De hecho, caracterizada inicialmente como un represor de la traducción debido a su falta de interacción con eIF4G 12, eIF4E2 inicia la traducción de centenares de ARNm que contienen elementos de respuesta a la hipoxia de ARN en su 3 'UTR durante el estrés hipóxico 6,13. Esta i activacións logrado a través de interacciones con proteínas motivo 4, y el factor inducible por hipoxia (HIF) 2α eIF4G3, ARN de unión para constituir un complejo eIF4F hipóxica, o eIF4F H 6,13. Como un represor en condiciones normales, eIF4E2 une con GIGYF2 y ZNF598 14. Estos complejos fueron, en parte, identificados a través de 7 m resinas de afinidad GTP vinculados-agarosa. Este método clásico 15 es estándar en el campo de la traducción y los ensayos es mejor y más comúnmente utilizado la técnica para aislar los complejos de unión de capuchón en la tracción y la unión in vitro 16-19. A medida que la maquinaria de traducción dependiente de la cubierta está emergiendo como flexible y adaptable con las piezas de cambio inter 6-8,13, este método es una herramienta poderosa para identificar rápidamente nuevas proteínas de unión con forma de capuchones que intervienen en la respuesta al estrés. Por otra parte, las variaciones en eIF4F podría tener amplias implicaciones como varios sistemas modelo eucariotas parecen usar un homólogo de eIF4E2 de las respuestas de estrés talescomo A. thaliana 20, S. pombe 21, 22 D. melanogaster y C. elegans 23.

La evidencia sugiere que las variaciones en eIF4F no pueden limitarse estrictamente a condiciones de estrés, pero estar implicados en la fisiología normal 24. El suministro de oxígeno a los tejidos en los extremos (capilares) o dentro de los tejidos (medido a través de microelectrodos) varía desde 2 hasta 6% en el cerebro 25, 3-12% en los pulmones 26, 3,5 a 6% en el intestino 27, 4% en el hígado 28, 7-12% en el riñón 29, 4% en el músculo 30, y 6-7% en la médula ósea 31. Las células y las mitocondrias contienen menos de 1,3% de oxígeno 32. Estos valores son mucho más cerca de la hipoxia que el aire ambiente donde las células son cultivadas de forma rutinaria. Esto sugiere que lo que se pensaba anteriormente de procesos celulares como la hipoxia-específicos pueden ser relevantes en un entorno fisiológico. Curiosamente, eIF4F y eIF4F H 24. Bajos niveles de oxígeno también impulsa el correcto desarrollo fetal y 33 células por lo general tienen mayores tasas de proliferación, mayor esperanza de vida, menos daño en el ADN y las respuestas al estrés en general menos de 34 physioxia. Por lo tanto, eIF4F H es probablemente un factor clave en la expresión de genes de selección en condiciones fisiológicas.

A continuación, ofrecemos un protocolo para cultivar células en condiciones fijas de oxígeno fisiológicas o en un rango de fluctuación dinámica que es probable que sea más representativo de los microambientes de tejido. Una ventaja de este método es que las células se lisan dentro de la estación de trabajo de la hipoxia. No es a menudo claro cómo se lleva a cabo la transición del cultivo de células hipóxicas a la lisis celular en otros protocolos. Las células se quitan a menudo por primera vez de una pequeña incubadora hipoxia serlisis de proa, pero esta exposición al oxígeno podría afectar a las vías bioquímicas como la respuesta celular al oxígeno es rápida (una o dos min) 35. Ciertas proteínas de unión con forma de capuchones requieren la interacción con una segunda base o pueden hidrolizar el GTP m 7, por lo tanto, algunos interactores cap pueden pasarse por alto en el proceso de purificación. Agarosa ligada a los análogos de tapa enzimáticamente resistentes puede sustituirse en este protocolo. La exploración de la actividad y la composición de eIF4F H y otras variaciones de eIF4F a través del método descrito aquí arrojará luz sobre los genes de expresión intrincados mecanismos que utilizan las células en condiciones fisiológicas o las respuestas al estrés.

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Protocol

1. Preparativos para el cultivo celular

  1. Comprar acciones disponibles en el mercado de las células humanas.
    NOTA: Este protocolo utiliza el carcinoma colorrectal y HCT116 células humanas primarias epiteliales tubulares renales proximales (HRPTEC).
  2. Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HCT116: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) media / alta de glucosa suplementado con 7,5% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S).
  3. Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HRPTEC: medio celular epitelial suplementado con 5% FBS, 1% de suplemento de crecimiento de células epiteliales, y 1% P / S.
  4. Preparar 500 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave durante 40 minutos a 121 ° C.

2. Inicio de cultivo de células

  1. aspirar cuidadosamente el medio de un plato confluente 80-90% sin molestar tél células.
  2. Alícuotas de 3-5 ml de PBS 1x por placa de cultivo, agite con cuidado cada matraz para recubrir la superficie del plato, y con cuidado aspirar el PBS 1x. Repita este procedimiento para un segundo lavado 1x PBS.
  3. Alícuota 3 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) en cada placa de cultivo y suavemente roca para cubrir uniformemente las células con tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C durante 2-3 min.
  4. La transferencia de las células separadas en un tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifuga a 4.000 g durante 90 seg.
  5. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de DMEM completo.
  6. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Calcula cuántos apirógeno y poliestireno de 100 mm de cultivo celular platos se requiere para alcanzar una densidad inicial de siembra de aproximadamente 2.500-5.000 células por cm2.
  7. Pre-caliente medio de cultivo celular completo realizado en los pasos 1.2 o 1.3 en un baño de agua a 37 ° C durante 30-45 minutos.
  8. Descontaminar la botella medio y vial de células con 70% de etanol. A partir de este punto en adelante todolas operaciones deben llevarse a cabo de forma aséptica.
  9. Alícuota de 6 ml de DMEM completo en tantas placas de cultivo celular de 100 mm necesarios para utilizar todo el volumen de las células congeladas dentro de la densidad de siembra mencionado en el paso 2.6.
  10. Transferir el volumen de suspensión celular calculada en el paso 2.6 para cada una de las placas de 100 mm de cultivo. Roca cada placa manualmente para distribuir uniformemente las células sobre la superficie de la placa.
  11. Coloque la cabeza de serie placa de cultivo celular 100 mm en la incubadora a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Permitir que las células se incuban al menos 24 horas antes de que los próximos pasos.

3. El subcultivo

  1. Ver cada placa de cultivo de células bajo un microscopio para determinar el porcentaje de confluencia celular (% de células que cubren el área del plato). Volver a las células de la incubadora y medio completo de pre-calentamiento y 1x PBS. Proceder al siguiente paso si las células son 80-100% de confluencia.
  2. aspirar con cuidado el medio gastado sin perturbar elcélulas en cada placa de cultivo.
  3. Alícuotas de 3-5 ml de PBS 1x por placa de cultivo, agite con cuidado cada matraz para recubrir la superficie del plato, y con cuidado aspirar el PBS 1x. Repita este procedimiento para un segundo lavado 1x PBS.
  4. Alícuota de 3 ml de 0,05% tripsina-EDTA en cada placa de cultivo y cuidado de roca para cubrir uniformemente las células con tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C durante 2-3 min.
  5. Durante esta incubación, se requiere alícuota de 10 ml de medio completo en placas de cultivo como muchos para obtener la densidad de células de 2.500-5.000 células por cm 2.
  6. Cuando las células se han separado de la placa, añadir rápidamente 3 ml de inhibidor de tripsina 1x definido y agitar suavemente el plato para 1 min para asegurar que toda la tripsina-EDTA ha sido neutralizado.
  7. La transferencia de las células separadas en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y dejar de lado. Añadir 3 ml de 1x PBS al plato para recoger las células restantes, y la transferencia de que para el mismo tubo de centrífuga de 15 ml.
  8. Sedimentar las células por centrifugación 150 xgdurante 5 min.
  9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio completo.
  10. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y sembrar placas de cultivo de 150 mm que contenían 15 ml de medio completo para obtener una densidad celular de 2.500-5.000 células por cm 2. Use dos de 150 mm para cada ensayo de fijación de límites máximos.
    NOTA: la difusión de oxígeno a las células a través de medios líquidos depende en el volumen 36. Se recomienda mantener el volumen de los medios de comunicación consistentes entre los experimentos si se utilizan células adherentes o células en suspensión. Los medios pueden ser pre-condicionadas (se incubaron en la estación de trabajo durante 24 horas como se comenta en la discusión) para evitar estas variabilidades en la difusión.
  11. Colocar las cápsulas cabeza de serie de la cultura en la incubadora a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Permitir que las células se incuban al menos 24 horas antes de proceder a los pasos siguientes.

4. La exposición Physioxic

  1. Ver las células bajo el microscopio. para best resultados, aseguran que las células son 70-80% de confluencia para una exposición de 24 horas, el 50-60% de confluencia para una exposición de 48 horas, y el 40-50% de confluencia para una exposición de 72 horas.
  2. Colocar las células en una estación de trabajo hipoxia durante el tiempo deseado (24, 48, o 72 hr dependiendo del experimento).
  3. Ajuste la estación de trabajo al physioxia apropiado.
    NOTA: Por ejemplo, un ajuste de 3% de O2 estaría acompañada de 5% de CO2 y 92% de N2.
    NOTA: Si se desean las fluctuaciones de oxígeno dentro de un rango dinámico más de una línea de tiempo específico, el programa de la programación en el instrumento o ajustar manualmente los ajustes de oxígeno en los intervalos deseados.
  4. Ajuste la humedad relativa al 60%. La atmósfera de trabajo es muy secas, no obstante, los medios de comunicación y se evapore notablemente durante los experimentos de largo (> 48 h). Mantenga una reserva de medios de comunicación en un frasco de cultivo de células dentro de la estación de trabajo (de modo que los medios de comunicación se equilibra con la atmósfera estación de trabajo) para reponer los medios de comunicación en la dis cultivo celularél es.
    NOTA: Cualquier solución que interactuar con las células antes de la lisis (por ejemplo, PBS y tripsina-EDTA) se debe preacondicionarse durante 24 h antes de su uso dentro de la estación de trabajo hipoxia de modo que el oxígeno disuelto se equilibra con el oxígeno atmosférico 36.
  5. Mantener las células dentro de la estación de trabajo hasta que la lisis.

5. Los tampones se preparan para el análisis del cabo de unión

  1. Preparar tamponada con Tris 1x solución salina (TBS).
    1. En 800 ml de H2O destilada, se disuelven 8,76 g de NaCl y 6,05 g de Tris Base.
    2. Se lleva la solución a un pH final de 7,4 usando HCl 1 M.
    3. Llevar el volumen final a 1 L con dH 2 O.
  2. Preparar tampón de lisis no desnaturalizante. Preparar lisis amortiguar el día del ensayo de unión de topes. Hacer buffer de lisis adicional para lavar las perlas de agarosa en blanco y el γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa vinculados-C10 (pasos 7.9 y 7.13).
    1. En 7 ml de H2O destilada, añadir 160 l de NaCl 5 Ml, NaF mM 160 l 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 l 200, 40 l 1 M MgCl 2, y ortovanadato de sodio 40 l 1 mM.
    2. Añadir 40 l de Igepal a la solución de 7 ml. Cortar la punta de la pipeta para ayudar a recuperar Igepal ya que es extremadamente viscoso.
    3. Mezclar pipeteando arriba y abajo, o vórtice, la solución de 7 ml hasta que todo el Igepal se ha disuelto.
    4. Elevar el volumen final de la solución a 8 ml y mantener en hielo.
  3. Preparar 4x dodecil sulfato de sodio (SDS) -PAGE tampón de muestra.
    1. En un vaso de precipitados, se combinan 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, y 8 ml de ditiotreitol (DTT).
    2. Añadir 3,2 g de SDS y 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que el polvo se disuelva completamente mediante la mezcla con una barra de agitación magnética.
    3. Alícuota de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C.

6. Lisis Celular

  1. Preparar la desnaturalización no tampón de lisis y mantener en hielo el día de THe cap-ensayo de unión.
  2. 1x PBS pre-calentamiento y tripsina en un baño de agua a 37 ° durante 30 minutos.
  3. Alícuotas de 980 l de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada ensayo de fijación de límites máximos que se realizan.
  4. Añadir 10 l de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo fluoruro y 10 l de 100x cóctel inhibidor de proteasa a los 980 l de tampón de lisis. Mantener en hielo.
  5. Desechar los medios de comunicación de cada plato de 150 mm en un contenedor de residuos dentro de la estación de trabajo de la hipoxia.
  6. Se lavan las células con 3-4 ml de PBS 1x cálida y desechar todo el líquido.
  7. Añadir 1 ml de tibia 0,05% de tripsina-EDTA a cada placa y dejar reposar durante 2 minutos o hasta que las células ya no se adhieren a la placa.
  8. Con una pipeta, transferir las células de una placa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita según sea necesario de manera que cada placa de células se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado.
  9. Centrifugar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 6.000 xg durante 90 seg to sedimentar las células.
  10. Aspirar el tripsina usando una pipeta sin perturbar el sedimento. Si el sedimento es perturbado, volver a centrifugar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg.
  11. Se lavan las células con PBS 1x caliente suavemente pipeteando 200 l de PBS en el tubo justo por encima de la pastilla. Re-centrifugadora si se altera el sedimento.
  12. Aspirar el PBS sin perturbar el sedimento.
  13. Pipeta 500 l de 1 ml de solución tampón de lisis preparados en el primer precipitado celular. Resuspender el precipitado en su totalidad por pipeteando arriba y abajo.
  14. Se combinan las células resuspendidas con el segundo sedimento celular y resuspender el segundo precipitado pipeteando arriba y abajo. Repita este proceso hasta que todos los gránulos se han combinado y se resuspendieron para cada muestra.
  15. Combinar el lisado con los restantes 500 l de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  16. Extraer muestras de la estación de trabajo de la hipoxia.
    NOTA: Después de la adición de tampón de lisis, unaetapas posteriores ll se han de realizar en el aire ambiente como la estación de trabajo hipoxia se establece en 37 ° C y los pasos siguientes se van a realizar en frío (4 ° C o en hielo).
  17. Lisar las células utilizando agitación suave mediante la rotación de las muestras a 4 ° C durante 1,5-2 horas.
  18. Centrifugar las células lisadas a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares.
  19. Transferir el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar el sedimento.
  20. Reservar una parte (5 a 10%) del sobrenadante a ser utilizado como todo un control de entrada de lisado de células para el futuro análisis de transferencia Western.

7. Ensayo de unión a Cap-

  1. Para cada muestra, la transferencia de 50 l de la suspensión de control de cuentas de agarosa en blanco y 50 l de la suspensión de perlas vinculado-C10 γ-aminofenil-m 7 GTP de agarosa para separar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Con unas tijeras para retirar la punta de la pipeta para facilitar la recogida de la suspensión de perlas.
  2. Se precipitan los talones By centrifugación de la suspensión a 500 x g durante 30 seg.
  3. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y volver a suspender las perlas en 500 l de TBS.
  4. Repita los pasos 7.2 y 7.3. Sedimentar las perlas a 500 xg durante 30 segundos y retirar el sobrenadante.
  5. Transferir el sobrenadante que contiene el lisado de la etapa 6.19 al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las perlas de agarosa en blanco.
    NOTA: Las perlas de agarosa en blanco actúan como una etapa de pre-compensación para eliminar las proteínas del lisado que interactúan de forma no específica con la perla.
  6. Incubar durante 10 min a 4 ° C con agitación suave.
  7. Sedimentar las perlas de agarosa en blanco por centrifugación a 500 xg durante 30 seg.
  8. Transferir el lisado al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10-linked.
  9. Se lavan las perlas de agarosa en blanco resuspendiendo las perlas en 500 l de tampón de lisis, la granulación las perlas por centrifugación a 500 xg durante 30 seg, y descartar el supernatante. Repita esto cuatro veces para un total de cinco lavados.
  10. Volver a suspender las perlas de agarosa en blanco en tampón de muestra 1x SDS-PAGE, y hervir los granos por 90 segundos a 95 ° C. Almacenar a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot para observar si la proteína de interés se une de forma no específica a la perla.
  11. Incubar el lisado con las perlas de enlaces-C10 γ-aminofenil-m 7 GTP de agarosa con agitación suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar proteínas de unión a la tapa.
  12. Sedimentar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. Descartar el sobrenadante.
  13. Lavar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado repitiendo el paso 7.9.
  14. Volver a suspender las perlas en 600 l de tampón de lisis.
  15. Añadir GTP a una concentración final de 1 mM.
  16. Se incuban las γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado + 1 mM de GTP con agitación suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Estese disociar las proteínas que interactúan de forma no específica con m 7 GTP (es decir, también interactuar con GTP no metilado).
  17. Sedimentar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado por centrifugación a 500 xg durante 30 seg.
  18. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 200 l de tampón de muestra 4x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol). Almacenar la muestra de control de GTP a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot 37. Lavar las perlas repitiendo el paso 7.9.
  19. Resuspender las perlas en tampón 1x de muestra de SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol), y hierven a 95 ° C durante 90 seg. Almacenar la fracción m 7 GTP a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot 37.

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Representative Results

Análisis de Capacidad del casquillo de unión en respuesta al oxígeno de eIF4E y eIF4E2 en un m 7 GTP columna de afinidad

Las figuras 1 y 2 representan transferencias Western de m 7 GTP afinidad purificación típica de las dos principales proteínas de unión del casquillo en respuesta a las fluctuaciones de oxígeno en dos líneas celulares humanas: células primarias humanas renales proximales tubulares epiteliales (HRPTEC) en F igura 1 y carcinoma colorrectal ( HCT116) en la Figura 2. Las células se mantienen en la disponibilidad de oxígeno indicada por 24 hr para asegurar que el oxígeno disuelto en el medio líquido ha equilibrado con el aire dentro de la estación de trabajo hipoxia. El carril de entrada (IN) representa el 10% de todo el lisado celular antes de la m se añaden 7 perlas de agarosa GTP vinculados a capturar las proteínas de unión de capuchón. Este carril de entrada se utiliza como línea de base para medir el enriquecimientode una proteína diana en el m 7 pulldown GTP. El carril GTP es el eluato de la m 7 GTP perlas que eran eluyen con GTP 1 mM. Este paso permite la detección de proteínas que también reconocen GTP no metilado. Las proteínas de unión a la tapa-eIF4E y eIF4E2 reconocen m 7 GTP específicamente, pero su homólogo eIF4E3 (no mostrado aquí) también se une a GTP no metilado. La capacidad de eIF4E y eIF4E2 de obligar a la estructura de la tapa 5 'de ARNm (m 7 GTP) se puede medir mediante la comparación de la intensidad de sus bandas en el m 7 GTP columna relativa a la intensidad en el carril de entrada (total de piscina disponible).

Esta cuantificación se puede realizar mediante la medición de la intensidad de los píxeles de las bandas de proteína para los tres réplicas biológicas con un software de análisis de imágenes, tales como ImageJ. Los resultados se expresan como medias relativas de unidades de densidad (RDU) ± error estándar de la media. valores en bruto antes de la normalizacióntanto experimentales y de control muestras se compararon mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas. P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Este experimento representativo muestra que las dos líneas celulares tienen diferentes rangos de oxígeno para su uso eIF4E y eIF4E2. La Figura 1 muestra que en HRPTEC solamente eIF4E se une fuertemente a m 7 GTP a 8% de O 2 (Figura 1A), que tanto eIF4E y eIF4E2 están asociados significativamente con m 7 GTP 3-5% O 2 (Figura 1B - C), y que sólo se une fuertemente a eIF4E2 m 7 GTP en el 1% de O 2 (Figura 1D). En la Figura 2, en células HCT116, el uso dependiente de oxígeno de estas proteínas de unión a la tapa-es diferente: solamente eIF4E se une de manera significativa a m 7 GTP a 12% de O 2 (Figura 2A), ambas proteínas de unión a la tapa-une significativamente a m 7 GTP en el rango de 5-8% de O2(Figura 2B - C), y sólo eIF4E2 se une de manera significativa a m 7 GTP a 3% O 2 (Figura 2D). La ausencia de la elución de la columna de GTP la m 7 con GTP muestra que eIF4E y eIF4E2 son específicos de m 7 GTP y no reconocen GTP no metilado. Los gráficos de barras que representan la cuantificación de tres réplicas biológicas usando ImageJ. Nuestros resultados demuestran que los dos principales proteínas de unión a la tapa-eIF4E, y eIF4E2, difieren en su capacidad para unirse a la estructura de la tapa 7 GTP mRNA m en una forma dependiente de oxígeno.

Con base en la literatura previa que estas dos proteínas inician la traducción de clases únicas de los ARNm, este cambio en la actividad de fijación de límites máximos podría resultar en diferentes proteomas generados para adaptarse a los cambios en la disponibilidad de oxígeno. Esta técnica se puede utilizar para caracterizar nuevos factores de iniciación de la traducción que interactúan con el "tope 5 mRNA(o con las proteínas de unión de capuchón) a través de un enfoque de transferencia de western dirigida o un enfoque amplio como el análisis de espectrometría de masas de un eluido de GTP m 7.

Figura 1
Figura 1: eIF4E y eIF4E2 actividades se solapan durante physioxia en HRPTEC 3-5 de% de O2. Ensayos de captura utilizando m 7 GTP perlas en las células del túbulo proximal renal humano epitelial (HRPTEC) lisados expuestos a (A) 8%, (B) 5%, (C) 3% o (D) 1% de O2 durante 24 horas. GTP, lavado de GTP para medir la especificidad para m 7 GTP; m 7 GTP, las proteínas unidas a 7 m perlas de GTP GTP tras lavado. Western blots representativos se muestran y los datos de al menos tres experimentos independientes se cuantificaron mediante ImageJ y se expresaron como unidades de densidad relativa (RDU) con relación a la entrada% 10 (IN) de lisado de células enteras. * P <0,05 (dos colas unpaired la prueba t de Student) se consideró un cambio significativo cuando se compara el enriquecimiento de eIF4E o eIF4E2 en la fracción cap-bound (m 7 GTP) de la EN. Datos, media ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes. Esta investigación fue publicada originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. y Uniacke, J. células humanas cultivadas en oxígeno fisiológica utilizan dos proteínas de unión con forma de capuchones para reclutar ARNm distintos para la traducción. de 2016; 291 (20): 10772-82 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. actividades eIF4E2 eIF4E y se superponen durante physioxia en HCT116 a partir 5-8% De O2. Ensayos de captura utilizando m 7 GTP perlas en HCT116 carcinoma colorrectal humano lisados expuestos a (A) 12%, (B) 8%, (C) 5% o (D) 3% de O2 durante 24 horas. GTP, lavado de GTP para medir la especificidad para m 7 GTP; m 7 GTP, las proteínas unidas a 7 m perlas de GTP GTP tras lavado. Western blots representativos se muestran y los datos de al menos tres experimentos independientes se cuantificaron mediante ImageJ y se expresaron como unidades de densidad relativa (RDU) con relación a la entrada% 10 (IN) de lisado de células enteras. * P <0,05 (dos colas unpaired la prueba t de Student) se consideró un cambio significativo cuando se compara el enriquecimiento de eIF4E o eIF4E2 en la fracción cap-bound (m 7 GTP) de la EN. Datos, media ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes. Esta investigación fue publicada originalmente en la revista Journal of Biological Chemistry. Timpano, S. y Uniacke, J. células humanas cultivadas en oxígeno fisiológica utilizan dos proteínas de unión con forma de capuchones para reclutar ARNm distintos para la traducción. de 2016; 291 (20): 10772-82 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El análisis de proteínas de unión a la tapa-en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas pueden permitir la identificación de nuevos factores de iniciación de traducción regulada de oxígeno. La afinidad de estos factores para la tapa 5 'del mRNA u otras proteínas de tapa asociada se puede medir por la fuerza de su asociación a la m 7 GTP ligada perlas de agarosa. Una advertencia de esta técnica es que mide el potencial de unión de topes de proteínas post-lisis, pero se realiza en condiciones no desnaturalizantes que mantienen las interacciones proteína-proteína y modificaciones posteriores a la traducción (PTMs). Varias interacciones proteína-proteína median la unión de la familia eIF4E a tapa 5 '. El 4E-BP se une y reprime eIF4E mediante el bloqueo de su interacción con eIF4G y prevención del reclutamiento de los 43S previas a la iniciación complejos 38. El complejo eIF4E / 4E-BP permanece unido a la 'tapón 5 ARNm, bloqueando cualquier iniciación de esa transcripción, y puedeser utilizado como un marcador para la inhibición eIF4E en m 7 columnas de afinidad GTP. Por el contrario, la interacción de eIF4E con eIF4G en m 7 columnas GTP podría ser un marcador de inicio de la traducción activo. PTMs son otro método para regular la actividad de los factores de iniciación de traducción. Por ejemplo, la fosforilación de eIF4E por Mnk1 puede aumentar su afinidad por el ARNm 5 'cap 39. El modificador de la proteína codificada por el gen de interferón estimulado 15 (ISG15) es una PTM que aumenta la actividad de unión de topes de eIF4E2 en respuesta a la inducción de interferón a través de la infección por patógenos 40. El gen ISG15 contiene un elemento de respuesta a hipoxia en su promotor lo que sugiere que este sistema podría regular eIF4E2 baja en oxígeno. Se sabe muy poco acerca de cómo PTM pueden alterar la actividad de las proteínas de unión de capuchones, durante condiciones de oxígeno fisiológicamente relevantes. Esta técnica seguida de análisis de espectrometría de masas podría revelar nuevos PTM regulados por el oxígeno y fisiológicamente relevantes then mediar en la actividad de los factores de iniciación de traducción.

Un método alternativo para la captura con un m 7 GTP analógico tapa sería para inmunoprecipitar una proteína de unión de topes conocido tal como eIF4E o eIF4G y llevar a cabo la espectrometría de masas para identificar las proteínas asociadas. Una limitación de esta estrategia es que las proteínas de unión a cap-a menudo tienen funciones celulares alternativas tales como el estrés dentro de los gránulos 41 o en la traducción independiente de caperuza 1,4. Por lo tanto, la utilización de análogos de 7 m de tapa GTP es el mejor método, más fiable para aislar proteínas de unión con forma de capuchones, especialmente cuando la investigación de nuevas proteínas cap-asociado. Una limitación de la utilización de un análogo de GTP casquillo 7 m es que algunas proteínas de unión de capuchón como el eliminador de decapping enzima dcps interactuar no sólo con la tapa m 7 GTP ARNm, pero también requieren la segunda base 42 para la unión. Además, decapping enzimas en general, tales como el complejo de DCP1 / Dcp2, pueden HYDRolyze m 7 GTP y reducir efectivamente la capacidad de la resina. Por lo tanto, algunas proteínas de unión de capuchón se pueden perder en este análisis. Para pasar por alto estas advertencias, los análogos de tapa ARNm enzimáticamente resistentes pueden ser utilizados. Dos análogos no hidrolizables casquillo, mononucleótido m 7 GpCH2pp o dinucleótido m 7 GpCH2ppA se han demostrado para capturar dcps, DCP1, y Dcp2 43. Estos análogos casquillo mRNA no están disponibles comercialmente, pero se deben sintetizar químicamente de novo. Otra limitación de este protocolo es que sólo el casquillo de unión a proteínas o proteínas que interactúan con proteínas de unión a través de capuchón "que lleva a cuestas" va a capturar. Mientras iniciación de la traducción dependiente de la cubierta es la principal forma de iniciación, los mecanismos de la tapa independiente son especialmente frecuentes durante condiciones de estrés celular 1. Sin embargo, en el contexto de esta técnica y las nuevas tendencias en el campo de la iniciación de la traducción 6-8,24, la identificación de nuevos factores inducidos por el estrés que los participate en la iniciación dependiente de la cubierta es un área prometedora de la investigación.

Otro factor a considerar en este protocolo es el oxígeno en los medios de comunicación. El cultivo de células en un medio líquido proporciona una barrera entre las células y la atmósfera. Se ha demostrado que los medios líquidos pueden tardar hasta 24 horas se equilibre con la composición del gas atmosférico 36. Por lo tanto, las células deben ser cultivadas durante 24 horas en la disponibilidad de oxígeno deseada antes de la lisis, o los medios de comunicación pueden ser pre-condicionados si se requieren incubaciones cortas. Pre-acondicionado implica el mantenimiento de los medios de comunicación en la estación de trabajo hipoxia durante al menos 24 h en un matraz de cultivo estéril, que permite el intercambio de gases. Cualquier solución oxigenada presentación a las células dentro de la estación de trabajo de la hipoxia podría alterar rápidamente las vías de señalización celulares, tales como la iniciación de la traducción dependiente de la cubierta que está siendo examinado en este protocolo. Debido a la sensibilidad de las vías con sensor de oxígeno en las células, cualquier solución que seinteractuar con las células antes de la lisis tal como PBS y tripsina-EDTA también debe ser pre-expuesto, por lo menos 24 horas. Lisis y de lavado después de la lisis tampones deben utilizarse frío y por lo tanto no están pre-acondicionado en la estación de trabajo de 37 ° C hipoxia. Mientras que algunas modificaciones dependientes de oxígeno a proteínas podrían ser activos después de la lisis, se requieren los tampones fríos para minimizar las actividades enzimáticas y "barajado" de los complejos proteína-proteína o proteína-ARN que podrían conducir a artefactos. Una modificación de este protocolo para aumentar la rigurosidad puede ser pre-condición de lisis y de lavado después de la lisis tampones durante 24 horas y luego se incuba en hielo dentro de la estación de trabajo antes de su uso. Medios y tampones no deben mantenerse en la estación de trabajo hipoxia durante más de tres días debido a que estas soluciones se concentrarán debido a la evaporación del agua. Para los estudios a largo plazo (> 3 días), la cantidad inicial de células sembradas se debe considerar cuidadosamente. Como las células se dividen y la superficie del plato se convierte lleno de gente,otros factores de estrés tales como la acidificación de los medios de comunicación podrían afectar a la actividad de las proteínas de unión de capuchón. En el último día del experimento, las células deben tener una confluencia del 80-90%.

Hay cuatro pasos críticos dentro de este protocolo: el mantenimiento de las células en la estación de trabajo hipoxia hasta la lisis, la cantidad de células usadas, el lavado de las perlas, y el control no metilado GTP. 1) Hay varios métodos para mantener las células en bajos niveles de oxígeno. La mayoría de ellas son pequeñas cámaras que pueden contener sólo las placas de cultivo celular, pero cualquier manipulación o la lisis celular tendrán que realizar fuera de las cámaras en el aire ambiente. Componentes de la maquinaria con sensor de oxígeno, tales como los factores de hipoxia inducible se activan o inactivan en cuestión de uno o dos minutos 35. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, la lisis de las células en una estación de trabajo hipoxia es crítico para asegurar la actividad de las proteínas de unión a la tapa-está asociado con el respectivo disponibilidad de oxígeno. 2) El número de célulasse sugiere en este protocolo (dos placas de 150 mm) es adecuada para un fuerte m 7 GTP interactores como la familia o eIF4E miembros de la eIF4F compleja (eIF4A y eIF4G). Más células, por lo menos cinco placas de 150 mm, podrían ser necesarios para detectar las proteínas con interacciones transitorias o que sólo se asocian con la tapa GTP ARNm m 7 a eIF4F. 3) lavado de las perlas después de la incubación con el lisado celular se puede realizar de una manera rigurosa y menos estrictas. El protocolo que se presenta aquí ofrece una opción estrictas donde se utiliza tampón de lisis para lavar las perlas cinco veces. Si las proteínas con las interacciones más débiles a Cap-proteínas de unión son de interés, se puede realizar un menor número de lavados y utilizar solución salina tamponada con Tris en lugar de tampón de lisis. 4) Si bien es importante comprobar la validez de aclarar el lisado celular con conjugado de agarosa para eliminar las proteínas que interactúan de forma no específica con el talón, algunas proteínas de unión a la tapa-no pueden diferenciar entre la verdadera estructura de caperuza del ARNm, GTP metilado (m7 GTP), y GTP no metilado. Una de estas proteínas es el eIF4E homólogo eIF4E3 44. La elución de las bolitas con GTP desalojar cualquier proteína que también reconoce GTP no metilado, que podría ser de su interés. La relevancia biológica de las proteínas que reconocen tanto m 7 GTP y GTP aún no se ha aclarado completamente. Esto se acentúa por las pocas publicaciones que implican eIF4E3 (que es una proteína de unión de topes de buena fe con un dominio de unión de topes conservada) en relación con las proteínas eIF4E y eIF4E2, que sí reconocen m 7 GTP a partir de GTP no metilado.

Esta técnica, tal como se presenta, se puede realizar como un enfoque específico para identificar m 7 interactores GTP de interés o como un enfoque amplio mediante el análisis del eluato GTP m 7 a través de espectrometría de masas. Varias otras técnicas pueden seguir la exposición physioxic (Protocolo 4) analizar la actividad de unión de topes tales como fraccionamiento subcelular, inmunofluorescencia, co-inmunoprecipitación, unapolisomas análisis nd. control de la traducción está emergiendo como un colaborador igual a la expresión de genes como la transcripción. La utilización de esta técnica para investigar la actividad y la composición de los complejos de unión cap-arrojará luz sobre cómo iniciación de la traducción dependiente de la cubierta está regulada en respuesta a bajos niveles de oxígeno.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads Jena Bioscience AC-1555 Agarose-linked m7GTP
100 mm culture dish Corning 877222 10-cm culture dish
150 mm culture dish Thermofisher 130183 15 cm culture dish
AEBSF Hydrochloride ACROS Organics A0356829 AEBSF
Agarose Beads Jena Bioscience  AC-0015 Agarose bead control
Bromophenol Blue Fisher BP112-25 Component of SDS-PAGE loading buffer
1.5 ml Centrifuge Tubes FroggaBio 1210-00S Used to centrifuge small volumes
15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher 1495970C Used in culturing primary cells
Defined trypsin inhibitor Fisher R007100 DTI
Dithiothreitol Fisher BP172-25 DTT
Epithelial cell medium (complete kit) ScienCell 4101 Includes serum and growth factor supplements)
Glycerol Fisher BP229-1 Component of SDS-PAGE loading buffer
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml Jena Bioscience 272076-0251M GTP
HCT116 colorectal carcinoma ATCC CCL-247 Human cancer cell line
Human renal proximal tubular epithelial cells ATCC PCS-400-010 HRPTEC
Hyclone DMEM/High Glucose GE Life Sciences SH30022.01 Standard media for human cell culture
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution GE Life Sciences SV30010 Antibiotic component of DMEM
H35 HypOxystation Hypoxygen N/A Hypoxia workstation
Igepal CA-630 MP Biomedicals 2198596 Detergent component of lysis buffer
Monopotassium phosphate Fisher P288-500 KH2PO4
Potassium chloride Fisher P217-500 KCl
Magnesium chloride Fisher M33-500 MgCl2
Sodium chloride Fisher BP358-10 NaCl
Sodium fluoride Fisher 5299-100 NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer)
Disodium phosphate Fisher 5369-500 Na2HPO4
Premium Grade Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500 FBS
Protease Inhibitor Cocktail (100x) Cell Signalling 58715 Component of lysis buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 SDS
Sodium Orthovanadate Sigma 56508 Na3VO4
Tris Base Fisher BP152-5 Component of buffers
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 2500-067 Trypsin used to detach adherent cells

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Timpano, S., Melanson, G., Evagelou, S. L., Guild, B. D., Specker, E. J., Uniacke, J. Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions. J. Vis. Exp. (118), e55112, doi:10.3791/55112 (2016).

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