Summary
Den voksne Drosophila hjernen er et verdifullt system for å studere nevrale kretser, høyere hjernefunksjoner, og sammensatte lidelser. En effektiv metode for å dissekere hele hjernevev fra den lille flua hodet vil lette hjernebaserte studier. Her beskriver vi en enkel, ett-trinns disseksjon protokoll av voksne hjerner med godt bevarte morfologi.
Abstract
Det er en økende interesse for å bruke Drosophila å modellere menneskelige hjerne degenerative sykdommer, kart nevrale kretser i voksne hjerner, og studere molekylære og cellulære grunnlag av høyere hjernefunksjoner. En hel-mount forberedelse av voksne hjerner med godt bevarte morfologi er kritisk for slike hele hjernebaserte studier, men kan være teknisk utfordrende og tidkrevende. Denne protokollen beskriver en lett-å-lære, ett-trinns metode disseksjon av en voksen flue hode på mindre enn 10 s, samtidig som den intakte hjerne festet til resten av legemet for å lette etterfølgende behandlingstrinn. Fremgangsmåten bidrar til å fjerne mesteparten av øyet og tracheal vev som normalt er forbundet med hjernen som kan forstyrre den senere billeddannelsestrinn, og også setter mindre krav til kvaliteten på dissekere tang. I tillegg, beskriver vi en enkel fremgangsmåte som tillater praktisk flipping av de monterte hjerneprøver på et dekkglass, som er viktig for å avbilde begge sider av bregner med samme signalintensitet og kvalitet. Som et eksempel på protokoll presenterer vi en analyse av dopaminergiske (DA) neuroner i voksne hjerner av WT (w 1118) fluer. Den høye effekten av disseksjon metoden gjør det spesielt nyttig for store voksen hjerne-baserte studier i Drosophila.
Introduction
Modellen organismen Drosophila, vanligvis kjent som bananflue, har lenge vært verdsatt for sine elegante genetiske verktøy, korte reproduktive ganger, og svært konservert molekylære og cellulære veier. Bananflue har blitt ansatt for å dissekere grunnleggende signalveier, Mønstringen mekanismer for flercellede organismer, samt mekanismene bak nevronale utvikling, funksjoner og sykdommer 1,2. Med nylige fremskritt i celle merking og bildeteknologi, har bananflue hjernen bli spesielt kraftig i fin kartlegging av neuronal kretser og i dissekere den molekylære og cellulære grunnlag av høyere hjernefunksjoner, slik som læring og hukommelse, og døgnrytme 1,3, 4,5,6,7,8.
En spesiell fordel med Drosophila-system er for sin relativt liten størrelse, slik at hel-mount fremstilling og undersøkelse av hjernen ved hjelp av en vanlig forbindelse eller et konfokalt mikroskop. This-funksjonen gjør det mulig detaljerte anatomiske og funksjonelle analyser av nervekretser, eller til en enkelt nervecelle, på cellulære og subcellulære nivåer, i sammenheng med en hel hjernevev, og dermed gi både et helhetlig syn på studert faget og dets eksakte geometri i hele hjerne. Imidlertid gitt heller miniatyrstørrelse av hjernen, representerer den også en teknisk utfordring på en effektiv måte å dissekere et intakt hjernevev ut av den beskyttende ytre skjelett hodet tilfelle i en voksen fly. Forskjellige effektive og relativt enkle disseksjon fremgangsmåter er blitt beskrevet i detalj, som vanligvis innebære forsiktig og trinnvis fjerning av hodet saken og tilhørende vev innbefattende øynene, luftrøret, og fett fra hjernen riktig 9, 10. Disse mikro disseksjon metodene ofte plasserer heller strenge krav til kvaliteten på disseksjon tang, avhengig av tang med fin godt justert tips som lett kan skades. Videre, ettersom de dissekerte hjerner er ofte separated fra resten av kroppen, kan hjernen lett gå tapt i løpet av de påfølgende farging og vaskeprosesser på grunn av sine små størrelser og deres transparens i behandlingen buffer. Her beskriver vi en relativt enkel og lett å lære, ett-trinns disseksjon protokoll for voksne hjerner som holder de dissekerte hjerner festet til overkroppen. Disseksjon prosessen ofte lett rydder unna det meste av hjerne-forbundet vev som øyet og luftrøret og reduserer behovet for god kvalitet disseksjon tang.
I tillegg, når avbilding av hjernen under fluorescerende forbindelse mikroskop eller konfokalt mikroskop, den side av hjernen som er borte fra det fluorescerende lyskilde frembringer ofte et svakere signal og mindre klare bilder på grunn av tykkelsen av det hel-mount hjernen. Her beskriver vi også en enkel montering metode som gjør det mulig enkelt å bla i hjerneprøvene, slik at praktisk avbildning av begge sider av hjernen med tilsvarende signal intensiTy og kvalitet.
Som et proof-of-concept for anvendelsen av denne metoden for å studere den voksne hjernen, vi videre undersøkt tilstedeværelsen av DA nevroner i hjernen til w 1118 fluer; en genotype som ofte brukes som foreldrelinjen for å generere transgene fluer og villtype kontroll i mange Drosophila studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Solutions Brukes for Brain Dissection og Immunofluorescent Farging
- Dissekere voksen hjerne fly i kunstig cerebral spinalvæske (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 1,3 mM MgCl2, og 10 mM glukose. Før bruk gass den aCSF med 5% CO2 / 95% O 2 i 10 - 15 min og pigg med 2,5 mM CaCl2. Steriliser aCSF oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,22 um membranfilter.
Merk: Oppbevar aCSF ved 4 ° C for å hindre bakteriell forurensning. Flyr hjerner kan også bli dissekert i en fosfatbufret saltløsning (PBS) løsning, selv om detaljerte sammenligninger av effekten av de to disseksjon løsninger på den endelige bildekvalitet av de dissekerte hjerne ikke er blitt utført. - Bruke 4% paraformaldehyd (PFA) fremstilt i 1 x PBS som bindemiddel-løsning, som normalt alikvotert og lagret ved -20 ° C.
CAUTIOn: PFA er giftig og etsende og må behandles med forsiktighet. - Bruk 1x PBS for å skylle PFA fra hjernen, og etter det siste vasketrinnet, i løpet av immunfluorescens-fargingen av de dissekerte hjerne. Forbered 1x PBS fra 10x PBS stamløsning (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na 2 HPO 4 og 18 mM KH 2 PO 4).
- Bruker 0,3% Tween-20 i 1 x PBS (1x PBT) for alle de etterfølgende vasketrinnene i løpet av immuno-fluorescensfarging av de dissekerte hjerne.
2. mikro Disseksjon av Adult Fly Heads
Merk: disseksjon prosedyren er vist i figur 1.
- Anesthetize de voksne fluene med CO 2. Bruk pinsett, plukke opp en flue og kort dewax sin skjellaget ved å dyppe den i 70% etanol i 3 - 5 s. Dette sikrer at ingen bobler holder seg til fly cuticle når nedsenket i aCSF eller 1X PBS disseksjon løsning.
- Under endissekere mikroskop med en lyskilde i en vinkel som ikke vil bli blokkert av hendene, sett objektiv for å oppnå et klart syn på flua (1,2x forstørrelse). Bruk pinsett med nondominant hånd for å immobilisere dyr og dyppe fly inn i den kalde oppløsningen disseksjon med buken vendt oppad, som vist i figur 1A.
- Hold tang på en 160-170 ° vinkel i forhold til disseksjon plate, mens utøver en liten kraft på buken av flue (vist som piler i figur 1A). Dette trinnet vil immobilisere fly og tvinge den til å bevege hodet bakover med 15 - 25 ° mens utvide snabel oppover. I fremgangsmåten, en myk og gjennomskinnelig område av skjellaget, under snabel, skal bli tydelig. Øk forstørrelsen og justere fokusplanet på denne regionen.
Merk: Ikke hold pinsett for hardt, men heller bare fast nok til å stabiliserefluen. For mye kraft vil føre til at de indre organene til å sprekke i løsningen. - Bruk dominerende hånd til å trykke dissekere tang slik at dens tips er stengt, noe som vil generere en mild motstandsdyktig kraft på tuppen av tang, slik at tang vil åpnes når trykket fra driftsenheten hånd slippes. Plasser tang vinkelrett på tang som holder fly, som vist i figur 1B.
- Pierce de lukkede tips av disseksjon tang gjennom myk og gjennomskinnelig område av skjellaget under snabel, som illustrert ved den røde pilen i figur 1B. Det er viktig å ikke trenge pinsett for dypt at den berører hjernen. Hjernen riktig skal bli synlig. Opprettholde en stabil forståelse av fly med nondominant hånd.
- Raskt, men jevnt, slipper tips av disseksjon tang av sin egen makt og stole på momentum fra denne utgivelsen å rive bort than exoskeleton rundt flua hodet. En intakt hjerne riktig bør bli synlig (den hvite vevet umiddelbart over spissen av den nedre forcep i figur 1C) Følg en imaginær linje for å lede fremdriften av de frigjorte forcep tips (illustrert som de ytre røde pilene som er vist i figur 1C). Dette vil fjern forsiktig ytre skjelett og det meste av hjerne-assosierte øye og luftrør fra hjernen. Den riktige tidspunkt og kraften for å åpne den ytre skjelett vil være avhengig av undersøkeren erfaring.
Merk: Dette er den mest kritiske trinnet under disseksjon. Det er viktig å stole på naturlige kraften som genereres fra fremdriften av åpnings tang for å fjerne det ytre skjelett og samtidig la den eksponerte hjernen forblir bundet til resten av kroppen. - Bruk pinsett i den dominerende hånden for å forsiktig fjerne rest tilbehørs vev, slik som luftrør som vises som hvite fiberstrukturer remaining festet til hjernen. Vær forsiktig med å trekke eller skade hjernen riktig.
3. Immunofluorescent Farging av Brains
- Fest dissekert hjerneprøver med tilhørende overkropp i ca 1 ml 4% PFA for 40 - 60 min.
Merk: For dette og etterfølgende trinn, holde rør eller plater med prøver på en nutator du skal blande prøvene i løsningen. - Skyll med 1 ml av 1 x PBS ved å pipettere løsningen opp og ned 3 ganger. Vær forsiktig så du ikke suge hjernen unna.
- Vask 5 ganger med 1x PBT i 5 min hver. Hold prøvene på nutator under inkubasjon.
- Inkuber med primære antistoffer på riktig fortynning O / N ved 4 ° C.
- Neste dag, fjerne primære antistoffer, og vaske prøvene 5 ganger med 1x PBT. La prøvene i 5 - 10 min i 1x PBT løsning i mellom hver vask. Hold prøvene på nutator under inkubasjon.
- Inkuber vasketPrøvene i egnede sekundære antistoffer med den foreslåtte fortynning og inkubasjonstiden.
- Vask prøvene seks ganger med 1x PBT med en 10 minutters inkubasjon mellom hver vask.
Dette trinnet er kritisk for å fjerne uspesifikt bundet sekundære antistoffer fra prøven. - Inkuber i en 1: 10.000 fortynning av 1 mg / mL, 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 1x PBT-løsning i 30 minutter. DAPI er en DNA-fargestoff som binder til AT-regioner av DNA, og kan brukes for å avsløre den totale morfologi av hjernen.
- Skyll tre ganger med 1 x PBS.
- Overfør prøvene til en disseksjon tallerken, og skille hjerner fra likene i en disseksjon rett med tang.
- Etter at flekker og vasketrinn, montere hjernen i mellom to Dekk og plasser Dekk på toppen av en monterings lysbilde. På denne måte kan hjernen prøvene lett vippes slik at begge sider av hjernen kan avbildes med en tilsvarende signalintensitet.
- Plassere en 18 x 18 mm dekkglass på toppen av en monterings lysbilde. Utvid åpningen av en pipette med et blad og bruke den til å overføre hjernen i 1x PBS løsning på 18 x 18 mm dekkglass.
- Plasser hjernen på midten av dekkglass, fjerne væske rundt hjernen med en fin pipette, og deretter legge til en annen 20 - 40 mL av anti-fade montering medium (0,2% (w / v) n-propyl gallate i 99,5 % ACS grade glyserol) over hjernen.
Merk: Mengden av monteringsmedium tilsettes avhenger av hvor mange hjerner undersøkt.- Forsiktig spre ut hjernen mens fortrenge det viskøse monteringsmedium utover. Plassere en andre 18 x 18 mm dekkglass på toppen av hjernen ved først å senke sleiden fra den ene side til den får kontakt medoverflaten av monterings slip, og deretter langsomt å senke den andre siden for å minimalisere hjerne kontakt med luftbobler.
Merk: Det er ikke nødvendig å bruke et avstandsstykke mellom de to dekkglass, som volumet av monteringsmedium og hjernene bør tilveiebringe en tilstrekkelig plass til å skille de to dekkglass.- La lysbilder å slå seg ned. Fjerne overdreven væske som kommer ut fra sidene av kilene med en laboratorie-vev.
- For å hindre glassene med montert hjernen faller ut av monterings lysbildet under transport, bruk et lite stykke tape til å feste dekk til monterings lysbilde.
Merk: Brains montert i mellom lysbildene kan avbildes umiddelbart eller konservert ved 4 ° C i opp til en uke uten betydelig tap av fluorescerende signal, uten behov for å bruke noen tetningsmiddel for å forsegle lysbilder. For langsiktig bevaring av farget hjernen, kan den siden av de to slips forsegles with neglelakk og lagret i en -20 ° C fryser, selv farget hjerner kan miste sine signaler over tid. Dette anbefales ikke.
- Først hente bildet fra den side av hjernen nærmere målet, og deretter forsiktig flip glassene for å ha prøvene klemt i midten. Dette trinnet muliggjør henting av bildet av den andre siden av den samme hjernen.
- Bruk en oppreist sammensatte fluorescerende mikroskop og en 20X objektiv til bilde hele hjernen (eksempler i figur 2) og en 40X objektiv til bilde mindre regioner av hjernen, for eksempel DA nevroner i parvise Anterior Medial (PAM) cluster region (eksempler i Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer de viktigste prosedyrer for voksen hjerne disseksjon, som beskrevet ovenfor, figur 2 og 3 er representative bilder av 3 dager gammel WT. (Genotype: w 1118) voksen fly hjerner, som ble costained med et antistoff mot tyrosinhydroksylase (TH , farget i rødt på figur 2 og hvite i figur 3), en markør som vanligvis brukes til å merke dA-nevroner 11, i tillegg til DNA-fargestoff DAPI å merke alle cellekjernene og et antistoff mot Elav protein, en markør for alle differensierte neuroner i fly (farget i grønt), som sammen avslørte den samlede strukturen i hjernen.
For de primære antistoffer i figurene 2 og 3, benyttet vi kanin anti-TH-antistoff ved en 1: 200-fortynning og rotte-anti-Elav antistoff ved en 1: 100 fortynning, WHIch ble fremstilt i 1x PBT med 5% normalt geiteserum for å blokkere ikke-spesifikk binding. For sekundære antistoffer, anvendte vi Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti-rotte-antistoff og AlexaFluor596-konjugert geite-anti-kanin-antistoff ved en 1: 500 fortynning i 1 x PBT.
Å bilde hjernen, brukte vi en oppreist sammensatte fluorescerende mikroskop utstyrt med en apotome funksjon for å skaffe Z-stack bilder av hjernen skiver som dekker hele dybden av regionen av interesse i hjernen. For eksempel, for å få en klar visualisering av den generelle fordelingen av DA nevroner i hele hjernen, brukte vi en 20X objektiv til separat bilde fremre og bakre sider av samme hjernen (figur 2). Dybden av hver side av hjernen avbildes som kan dekke alle de DA-nevroner er omtrent 20 - 25 um totalt. Å pålitelig visualisere og kvantifisere DA nevroner i PAM klynge regionen, som har mindre cellestørrelser og svakere TH signals (se nedenfor), brukte vi en 40X objektiv. I tillegg, i Z-serien oppkjøpet funksjon fra kommersiell programvare, valgte vi en del tykkelse på 0,5 til 1 mikrometer mellom hver avbildes skive, som sikret optimal bildekvalitet i en 3D-rekonstruksjon av PAM klynge regionen (figur 3c). Tykkelsen på PAM klynge i hjernen som dekker alle DA nevroner er ca 8-10 mikrometer totalt. I vår erfaring, kan apotome funksjon i betydelig grad redusere støysignalet i avbilding av tykke prøver med høy bakgrunn, som for eksempel en hel hjerne eller PAM klynge regionen.
Figurene 2A-E viser den fremre riss av en hjerne, mens fig 2F-J viser den bakre riss av den samme hjernen etter å vippe Dekkglass som holder hjerneprøver, som viser et tilsvarende nivå av signalintensitet mellom to sider av hjernen etter alle de tre fotografert kanaler. DA Neuerons ble gruppert i ulike klynger følgende tidlig betegnelse 11, men her bruker vi navnet Paret posterior Medial (PPM) å inkludere spm1, PPM2, og PPM3 klynger på fremre side av hjernen, og navnet Paret posterior Lateral (PPL ) for å dekke PPL1 og PPL2 klynger fra bakre side av hjernen, som vist i figur 2E og 2J. Tall 2E og 2J i hvitt showet fremre og bakre utsikt over den samme hjernen i høy forstørrelse, avslører de ulike klynger av dA nevroner på begge sider av hjernen. Den hvite stiplede linjer markere fremtredende PAM og parvise Anterior Lateral (PAL) klynger i fremre side av hjernen (figur 2E) samt PPL og PPM klynger i den bakre side av hjernen (figur 2J).
Figurene 3A og 3B en re sammendrag av kvantifisering resultater for noen av DA klynger i w 1118 fluer. Vi telte DA nevroner skjære av stykket, og også fra 3D rekonstruert bilder, som skal minimere upresis telling. Vi regner med at de tre dager gamle w 1118 fluer har i gjennomsnitt 27 DA nevroner sammenlagt i PPM klyngen per hjernen, 16 DA nevroner i PPL klyngen per halvkule, 5 DA nevroner i PAL klynge per halvkule (figur 3A) og 97 DA nevroner i hver av PAM klynger (Figur 3B). Figur 3C er et representativt 3D rekonstruksjon av DA nevroner i PAL og PAM klynger, projisert fra skiver av høy forstørrelse bilder som dekker alle DA nevroner i denne regionen. Det er klart at sammenlignet med andre grupper slik som PAL, DA-nevronene i PAM klyngen har relativt små cellestørrelser og svakere TH fargesignaler.
"Src =" / files / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
Figur 1:. Grafisk Illustrasjon av Dissection Protokoll for Adult Drosophila Brain (A) Fluer er plassert med ventral side oppover, og holdt av thorax hjelp av ikke-dominante hånd. Force ble forsiktig brukt (røde piler) til tang for å indusere bakover tilting av flua hode og svakt utover utvidelse av snabel, utsette den hvite gjennomsiktige regionen nedenfor. (B) tang fra den dominerende hånd er satt inn i den gjennomsiktige regionen under snabel, og skaper et grunt snitt (rød pil). Merk at tang vi bruker ikke har veldig fin spiss ender. (C) tang får lov til å falle fra hverandre ved sin egen kraft, som antydet med de røde pilene. Momentum genereres ved å åpne tang fjerner øynene og exoskeleton, utsette en forholdsvis ren Drosophila hjernen. Mesteparten av luftrøret er fjernet i prosessen. (
Figur 2:. DA nevroner avslørt med anti-tyrosin hydroksylase (TH) Antistoff i voksen hann Drosophila B regn (Ervervet med en 20X Objective) Dette tallet inkluderer representative bilder av dissekerte voksne hjerner, rekonstruert ved hjelp av Z-stablet bilder av hjernen regionen interesse oppnådd med forbindelsen fluorescerende mikroskop. (AE) Anterior og (FJ) POSTERIØRE visninger av samme voksne hjernen; (A-F) cellekjerner ble fotografert med DAPI farging (hvit) og (C-H) neuroner were merket med pan-nevronale markør anti-Elav antistoffer (grønn); (B & G) DA nevroner er avslørt av anti-TH-antistoffer (rød). (D & I) Overlegg av bilder for DAPI, TH og Elav behandling. (E & J) Forstørret visning av hjernen med DA nevroner vist i hvitt. Stiplede linjer markere PAL og PAM klynger i fremre av hjernen og PPL og PPM klynger i bakre av hjernen. Målestokk representerer 50 mikrometer i alle panelene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kvantifisering av DA nevroner i hjernen til Male voksen w 1118 fluer (Ervervet med en 40X Objective). (A & B) Kvantifisering av DA neurons av dagen tre mannlige w 1118 fluer, avslørt av anti-TH flekker. Data er representert ved whisker boksplott som viser minimums- og maksimumsverdiene som uteliggere; så vel som den første (Q1), andre (Q2) og tredje (Q3) iler. Den andre kvartil er representert som middelverdi. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, Q1: 24 Gjennomsnitt: 27, Q2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, Q1: 12, Gjennomsnittlig: 16, Q2: 18, Max: 25}, og PAL {(n = 24), Min: 2, Q1: 4, Gjennomsnittlig: 5, Q2: 5, Max: 10} klynger; (B) PAM klynge {(n = 20) Min: 86, Q1: 94, Gjennomsnittlig: 97, Q2: 97, Max: 99}. (C) En representant projeksjon bilde som viser DA nevroner i PAM og PAL klynger av mannlige w 1118 fluer på tre d. Scale bar representerer 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med en økende interesse for å bruke voksen Drosophila hjernen for å studere menneskelige hjerne sykdommer, nevronale kretser, og høyere hjernefunksjoner, er det nødvendig å utvikle enkle og raske metoder for å få intakte flue hjerner for hel-mount analyser, noe som er spesielt viktig for stor- skalere hjerne-baserte skjermer. Vår metode gir en enkel og lett-å-lære tilnærming til å dissekere ut en flue hode (ofte i mindre enn 10 sek med erfaring) med godt bevarte morfologi som er i stor grad ryddet av tilhørende vev. Som dissekerte hjerne fremdeles er festet til resten av fluelegemer, har de vanligvis synke til bunnen av prøverøret raskt og er lett å kjenne igjen og samle i løpet av vaske- og fargingstrinn. Dette reduserer betraktelig prøvetap som kan være et fremtredende tema i behandlingen av hjerneprøver av små fysiske størrelser. Dette problemet kan være spesielt viktig for store studier. Hjernen kan lett løsrevet fra kroppenetter fullføring av fargeprosessen, før monteringen.
Under disseksjon, er det viktig å plassere fly på riktig måte, opprettholde de riktige vinkler ved fjerning av den ytre skjelett fra fly hode, og forsiktig utøve den riktige kraft i hvert trinn. Det anbefales at tangen er plassert i rett vinkel til hverandre for å hindre halshogging av flue (figur 1B). Som vist i de representative bildene på figur 2, hjernen fremstilt ved anvendelse av denne protokollen gi tilfredsstillende resultater. I dette eksempelet har vi fokusert på DA nevroner i PAM klynge av voksne hjerner. En Drosophila hjernen i gjennomsnitt har totalt ca 280 DA nevroner per protocerebrum, som er distribuert i ulike klynger i ulike regioner av hjernen med karakteristiske projeksjon mønstre og funksjonell utgang 11, 12. Forrige karakterisering av DA nevroner i voksen Drosophila hjernen, including fly modeller av menneskelige sykdomsgener som i Parkin mutanter, har i stor grad fokusert på PAL, PPL, og PPM klynger som har relativt store cellestørrelser og fremtredende uttrykk for TH, standard maker brukes for merking DA nevroner 13-18.
Imidlertid er de fleste av DA nevroner i fly hjernen funnet i PAM klynger, med ca 100 DA nevroner per klynge. Sammenlignet med andre celler i DA klynger, DA-nevronene i PAM klynge normalt vise en mindre grad av tyrosinhydroksylase ekspresjon og mindre cellestørrelser. I prøver fremstilt fra vår disseksjon og farging protokollen, kan DA nevroner i PAM klyngen være tydelig visualisert og avbildes i høy kvalitet ved hjelp av et sammensatt fluorescerende mikroskop, uten confocal bildebehandling. Gitt det store antall, kanskje kvantifisering av DA nevroner i PAM klynge av ulike genetiske bakgrunn produsere mer pålitelige og reproduserbare resultater. Vi foreslår at DA nevroner i PAM cluster representerer en annen nyttig system for å studere DA biologi og modellering DA-relaterte lidelser, så som Parkinsons sykdom.
I vår erfaring, apotome funksjon fra mikroskopet brukte vi kan redusere bakgrunnssignalet, spesielt i å undersøke prøver med betydelige mektigheter, slik som hele den voksne flua hjernen. Selv konfokalmikroskop kan produsere bilder med flere detaljer, høyere forstørrelse og bedre kvalitet, er det ofte tidkrevende og kostbart. Dette gjelder spesielt for å avbilde et stort antall tykke prøver slik som voksne hjerner som krever serie med Z-stabel seksjon for klart å rekonstruere 3D og dekonvolvering analyse. I dette perspektiv representerer apotome funksjon en hurtig og kostnadseffektivt alternativ for å fremstille bilder av tilstrekkelig kvalitet (for eksempel, bilder i figurene 2 og 3).
I hjernen studier, er det ofte nødvendig å avbilde celler som på begge sides av den samme hjernen. For eksempel, DA-nevroner er tilstede i klynger fra både fremre og bakre sider av hjernen. Men på grunn av sin tykkelse, etter en hjerne er montert på lysbildet, siden vekk fra lyskilden (dvs. den siden som vender mot monterings lysbilde) vanligvis gir opphav til svakere signaler og mindre klare bilder når avbildes med vanlig sammensatte og confocal mikroskoper. Ved å montere prøvene i mellom de to dekkglass, gjør det praktisk flipping av prøvene på det monterte glide og påfølgende avbildning av begge sider av samme hjernen med tilsvar signalintensiteter. Figur 2 er et eksempel på en bilde DA-nevroner fra begge sider av fly hjernen ved hjelp av denne metoden, som viste relativt sammenlignbare signalintensitet og bildekvalitet.
Flere enkle å følge metoder for å dissekere voksne fly hjerner har vært pent beskrevet 9, 10. Vår tilnærming gir en alternativ metode som kan pelsther forenkle disseksjon og farging prosesser av voksen fly hjerner. Med flere store studier blir utført for å kartlegge hele hjernen nevronale kretser så vel som dets molekylære og cellulære bestanddeler, er det påregnelig at automatiserte disseksjon og bilde tilnærminger kan utvikles for voksne Drosophila hjerner til å realisere high-throughput genetiske og narkotika-skjermer in vivo i denne klassiske genetiske modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkjenner Mr. Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, og Ms Danna Ghafir for deres enorme støtte til prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J.
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H.
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
