Summary
ذبابة الفاكهة الدماغ الكبار هو نظام القيم لدراسة الدوائر العصبية، وظائف الدماغ العليا، واضطرابات معقدة. وسيلة فعالة لتشريح أنسجة المخ كله من الرأس ذبابة صغيرة وتسهيل الدراسات القائمة على الدماغ. نحن هنا وصف، بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة من أدمغة البالغين مع التشكل الحفاظ عليها جيدا.
Abstract
هناك اهتمام متزايد في استخدام ذبابة الفاكهة لنموذج الدماغ من الأمراض التنكسية الإنسان، خريطة circuitries العصبية في أدمغة البالغين، ودراسة الأسس الجزيئية والخلوية من وظائف المخ العليا. وإعداد كامل جبل أدمغة البالغين مع التشكل المحفوظة جيدا أمر بالغ الأهمية لمثل هذه الدراسات القائمة على الدماغ كله، ولكن يمكن أن يكون تحديا وتستغرق وقتا طويلا من الناحية الفنية. يصف هذا البروتوكول نهج تشريح خطوة واحدة سهلة لتعلم، من رأس الذبابة في أقل من 10 ثانية، مع الحفاظ على الدماغ سليمة تعلق على بقية الجسم لتسهيل خطوات المعالجة اللاحقة. الإجراء يساعد على إزالة معظم أنسجة العين والقصبة الهوائية التي ترتبط عادة مع الدماغ التي يمكن أن تتداخل مع خطوة التصوير في وقت لاحق، ويضع أيضا أقل من الطلب على نوعية ملقط تشريح. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طريقة بسيطة التي تسمح التقليب مريحة للعينات الدماغ التي شنت على ساترة، وهو أمر مهم لتصوير جانبي بالأمطار مع كثافة إشارة مماثلة والجودة. وكمثال على ذلك البروتوكول، نقدم تحليلا لالدوبامين (DA) الخلايا العصبية في أدمغة البالغين من WT (ث 1118) الذباب. فعالية عالية في طريقة تشريح يجعلها مفيدة بشكل خاص للدراسات تستند الدماغ الكبار على نطاق واسع في ذبابة الفاكهة.
Introduction
الكائن الحي نموذج ذبابة الفاكهة، والمعروف باسم ذبابة الفاكهة، منذ فترة طويلة قيمتها لأدوات الوراثية الأنيقة، وأحيانا الإنجابية قصيرة، وحفظها للغاية المسارات الجزيئية والخلوية. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة بنجاح لتشريح مسارات أساسية الإشارات، وآليات الزخرفة من الكائنات متعددة الخلايا، وكذلك الآليات الكامنة وراء تطوير الخلايا العصبية، وظائف، وأمراض 1،2. مع التطورات الحديثة في تقنيات وضع العلامات الخلية والتصوير، وأصبح الدماغ ذبابة الفاكهة قوية خاصة في رسم الخرائط على ما يرام من الدوائر العصبية وفي تشريح الأساس الجزيئي والخلوي وظائف الدماغ العليا، مثل التعلم والذاكرة، وإيقاع الساعة البيولوجية 1،3، 4،5،6،7،8.
ميزة واحدة معينة من نظام ذبابة الفاكهة هو حجمها الصغير نسبيا، مما يسمح كله جبل إعداد وفحص الدماغ باستخدام مركب العادية أو المجهر متحد البؤر. ثيتمكن الصورة ميزة تحليلات مفصلة التشريحية والوظيفية للدوائر العصبية، أو حتى الخلايا العصبية واحدة، عند مستويات الخلوية والتحت خلوية، في سياق أنسجة المخ بأكملها، وبالتالي تقديم كل نظرة شمولية لدرس الموضوع وهندسته بدقة داخل كله الدماغ. ومع ذلك، وبالنظر إلى حجم مصغر بدلا من الدماغ، ويعرض أيضا تحديا تقنيا في تشريح بكفاءة على أنسجة المخ سليمة من اقية حالة رئيس الهيكل الخارجي في ذبابة الكبار. وقد وصفت مختلف وسائل فعالة وبسيطة نسبيا تشريح في التفاصيل، التي عادة ما تنطوي على الحذر وخطوة حكيمة شطب القضية الرأس والأنسجة المرتبطة بما في ذلك العينين والقصبة الهوائية، والدهون من الدماغ السليم 9 و 10. هذه الأساليب تشريح المجهرية في كثير من الأحيان تفرض ضغوطا صارمة بدلا من ذلك على نوعية ملقط تشريح، والاعتماد على ملقط مع غرامة نصائح متماشية بشكل جيد يمكن أن تتلف بسهولة. وعلاوة على ذلك، كما أدمغة تشريح غالبا ما تكون separatإد من بقية الجسم، والعقل يمكن أن تضيع بسهولة خلال عمليات تلطيخ والغسيل لاحقة بسبب أحجامها الصغيرة وشفافيتها في المخزن المؤقت المعالجة. هنا، نحن تصف بروتوكول تشريح خطوة واحدة بسيطة نسبيا وسهلة لتعلم، لأدمغة البالغين التي تحافظ على العقول تشريح تعلق على الجذع. عملية تشريح في كثير من الأحيان مسح بسهولة بعيدا معظم الأنسجة المرتبطة الدماغ مثل العين والقصبة الهوائية ويقلل من الطلب على ملقط تشريح ذات نوعية جيدة.
بالإضافة إلى ذلك، عندما تصوير الدماغ تحت المجهر المركب الفلورسنت أو المجهر متحد البؤر، إلى جانب الدماغ الذي هو بعيدا عن مصدر ضوء الفلورسنت غالبا ما تنتج إشارة أضعف والصور أقل وضوحا بسبب سماكة الدماغ كله جبل. هنا، ونحن أيضا تصف طريقة تركيب بسيط يسمح التقليب السهل من العينات الدماغ، مما يتيح سهولة التصوير من كلا الجانبين من المخ مع intensi إشارة مماثلةتاي والجودة.
ونتيجة لإثبات صحة مفهوم لتطبيق هذا الأسلوب لدراسة الدماغ الكبار، درسنا كذلك وجود الخلايا العصبية DA في أدمغة ث 1118 الذباب. النمط الجيني التي كثيرا ما تستخدم كخط الوالدين لتوليد الذباب المعدلة وراثيا والسيطرة wildtype في العديد من الدراسات ذبابة الفاكهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحلول المستخدمة لالدماغ تشريح وتلطيخ مناعي
- تشريح الكبار يطير العقول في اصطناعية السائل الشوكي الدماغي (ACSF): 119 مم كلوريد الصوديوم، 26.2 ملم NaHCO 3، 2.5 ملي بوكل، 1 ملم ناه 2 ص 4، 1.3 ملي MgCl 2 و 10 ملي الجلوكوز. قبل الاستخدام، والغاز ACSF مع 5٪ CO 2/95٪ O 2 ل10-15 دقيقة، وارتفاع 2.5 ملي CaCl 2. تعقيم الحل ACSF من خلال تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون الغشاء.
ملاحظة: مخزن ACSF في 4 درجات مئوية لمنع التلوث الجرثومي. ويمكن أيضا أن يطير العقول أن تشريح في حل مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، على الرغم من مقارنات تفصيلية من آثار الحلول تشريح اثنين على جودة التصوير النهائية من أدمغة تشريح لم يتم تنفيذها. - استخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) التي أعدت في برنامج تلفزيوني 1X هو الحل تثبيتي، والتي عادة aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية.
Cautioن: PFA غير سامة، وتآكل، وينبغي التعامل معها بحذر. - استخدام برنامج تلفزيوني 1X لشطف PFA من العقول وبعد الخطوة غسل الماضية، خلال تلوين مناعي من أدمغة تشريح. إعداد برنامج تلفزيوني 1X من 10X حل PBS الأسهم (1.37 م كلوريد الصوديوم، و 27 ملي بوكل، 100 ملي نا 2 هبو 4، و 18 ملي KH 2 PO 4).
- استخدام 0.3٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني 1X (1X PBT) لجميع الخطوات اللاحقة غسل خلال تلوين مناعي من أدمغة تشريح.
2. المجهرية تشريح رؤساء الكبار يطير
ملاحظة: يتم توضيح إجراء تشريح في الشكل 1.
- تخدير الذباب الكبار مع CO 2. باستخدام ملقط، والتقاط ذبابة لفترة وجيزة dewax بشرة عن طريق غمس في 70٪ من الإيثانول ل3-5 الصورة. هذا يضمن أن أي فقاعات تلتزم بشرة ذبابة عندما منغمسين في ACSF أو برنامج تلفزيوني 1X حل تشريح.
- تحتتشريح المجهر مع مصدر الضوء في زاوية لن يكون قد تم حظره من قبل الأيدي، تعيين عدسة موضوعية للوصول الى رؤية واضحة للذبابة (1.2X التكبير). استخدام ملقط مع جهة غير السائد لشل حركة الحيوانات وتزج الطاير في حل تشريح الباردة مع بطنها متجهة لأعلى، كما هو مبين في الشكل 1A.
- الحفاظ على ملقط في 160 - زاوية درجة 170 فيما يتعلق وحة التشريح، في حين تمارس قوة صغيرة على بطن الذبابة (كما هو موضح السهام في الشكل 1A). وهذه الخطوة شل الطاير واجبارها على تحريك الرأس الى الوراء من خلال 15 - 25 درجة في حين تمتد خرطوم صعودا. في هذه العملية، ومنطقة لينة وشفافة للبشرة، تحت خرطوم، يجب أن تصبح واضحة. زيادة التكبير وضبط البؤري على هذه المنطقة.
ملاحظة: لا تضع ملقط محكم جدا، بل مجرد شركة كافيا لتحقيق الاستقرارالذبابة. أيضا الكثير من القوة سوف يتسبب في أجهزة الداخلية لتمزق في الحل. - استخدام اليد المهيمنة للضغط على ملقط تشريح بحيث يتم إغلاق النصائح، والتي سوف تولد قوة مقاومة خفيفة على نصائح من ملقط، حتى أن ملقط والربيع الطلق عندما يتم تحرير الضغط من ناحية عقد. وضع ملقط عموديا على ملقط عقد الطاير، كما هو مبين في الشكل 1B.
- بيرس النصائح مغلقة من ملقط تشريح من خلال المنطقة لينة وشفافة للبشرة تحت خرطوم، كما يتضح من السهم الأحمر في الشكل 1B. ومن المهم عدم اختراق ملقط عميقا جدا أن يلمس الدماغ. الدماغ السليم ينبغي أن تصبح مرئية. الحفاظ على فهم ثابت للالطاير مع جهة غير السائد.
- بسرعة ولكن بثبات، والإفراج عن نصائح من ملقط تشريح بالقوة الخاصة والاعتماد على الزخم من هذا الإصدار المسيل للدموع بعيدا ركان الهيكل الخارجي الذي يحيط رأس ذبابة. دماغ سليمة السليم ينبغي أن تصبح مرئية (الأنسجة البيضاء مباشرة فوق غيض من forcep القاع في الشكل 1C) متابعة خط وهمي لتوجيه الزخم من النصائح forcep صدر (كما هو موضح السهام الحمراء الخارج هو مبين في الشكل 1C). سيؤدي هذا إلى إزالة بلطف الهيكل الخارجي والأكثر من العين المرتبط الدماغ والقصبة الهوائية من الدماغ. التوقيت المناسب وقوة تطبيق لفتح والهيكل الخارجي أن يعتمد على خبرة المحقق.
ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية أثناء تشريح. ومن المهم أن الاعتماد على القوة الطبيعية الناتجة عن زخم ملقط الانفتاح على إزالة الهيكل الخارجي بينما يترك الدماغ يتعرض تبقى تعلق على بقية الجسم. - استخدام الملقط في اليد المهيمنة لإزالة بعناية الأنسجة ملحق المتبقية، مثل القصبة الهوائية التي تظهر عن الهياكل الألياف البيضاء remainiتعلق نانوغرام إلى الدماغ. يجب الحرص على عدم سحب أو تلف في الدماغ السليم.
3. مناعي يلطخ من العقل
- إصلاح عينات الدماغ تشريح مع الجذوع المرتبطة بها في حوالي 1 مل من 4٪ PFA ل40 - 60 دقيقة.
ملاحظة: للحصول على هذا واللاحقة الخطوات، والحفاظ على أنابيب أو لوحات مع عينات على nutator لمزيج صحيح العينات في الحل. - شطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting الحل صعودا وهبوطا 3 مرات. يجب الحرص على عدم نضح العقول بعيدا.
- يغسل 5 مرات مع 1X PBT لمدة 5 دقائق لكل منهما. الحفاظ على عينات على nutator خلال الحضانة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في التخفيف يا سليم / N عند 4 درجات مئوية.
- في اليوم التالي، وإزالة الأجسام المضادة الأولية، وغسل العينات 5 مرات مع 1X PBT. ترك العينات لمدة 5-10 دقائق في حل 1X PBT بين كل غسل. الحفاظ على عينات على nutator خلال الحضانة.
- احتضان غسلهاالعينات في الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مع تخفيف ووقت حضانة المقترحة.
- غسل العينات ست مرات مع 1X PBT مع حضانة 10 دقيقة بين كل غسل.
هذه الخطوة هو أمر حاسم لإزالة الأجسام المضادة الثانوية ملزمة nonspecifically من العينة. - احتضان في 1: 10000 التخفيف من 1 ملغ / مل 4 "، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) في 1X حل PBT لمدة 30 دقيقة. دابي هو صبغ الحمض النووي التي تربط لمناطق AT من الحمض النووي ويمكن استخدامها للكشف عن التشكل العام للدماغ.
- شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
- عينات نقل إلى طبق التشريح، وفصل العقول من الجثث في طبق تشريح باستخدام ملقط.
- بعد تلطيخ وغسل الخطوات، تركيب أدمغة بين اثنين coverslips ووضع لل coverslips على أعلى شريحة متزايدة. في هذه الطريقة، وعينات الدماغ يمكن أن انقلبت بسهولة بحيث أن كلا الجانبين من الدماغ يمكن تصوير مع كثافة إشارة مماثلة.
- وضع ساترة 18 × 18 ملم على أعلى شريحة متزايدة. توسيع افتتاح طرف ماصة مع شفرة واستخدامه لنقل أدمغة في حل PBS 1X على ساترة 18 × 18 مم.
- وضع العقول في منتصف ساترة، وإزالة السائل حول أدمغة مع طرف ماصة على ما يرام، ثم إضافة 20 آخرين - 40 ميكرولتر من مكافحة تتلاشى المتوسطة المتزايدة (0.2٪ (ث / ت) ن ن غالاتي في 99.5 ٪ ACS الجلسرين درجة) على العقول.
ملاحظة: مقدار تصاعد أضاف المتوسطة يعتمد على عدد من العقول فحصها.- نشر بلطف من أدمغة بينما تهجير المتوسطة المتزايدة اللزج الخارج. ضع الثانية ساترة 18 × 18 ملم على أعلى العقول عن طريق خفض أولا الشريحة من جانب واحد حتى أنه يجعل الاتصال معسطح انزلاق تصاعد، ومن ثم تتراجع ببطء الجانب الآخر للحد من اتصال الدماغ مع فقاعات الهواء.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لاستخدام فاصل بين لل coverslips اثنين، حيث بلغ حجم والمتوسطة المتزايدة، وينبغي أن أدمغة توفر مساحة كافية لفصل لل coverslips اثنين.- السماح للشرائح ليستقر. إزالة السائل الزائد التي تخرج من الجانبين من زلات بمنديل مختبر.
- لمنع لل coverslips مع العقول التي شنت من السقوط في شريحة متزايدة أثناء النقل، واستخدام قطعة صغيرة من الشريط إرفاق لل coverslips إلى الشريحة المتزايدة.
ملاحظة: العقول التي شنت في بين الشرائح يمكن تصوير فورا أو الحفاظ عليها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى واحد من دون خسائر كبيرة في إشارة الفلورسنت، دون الحاجة إلى استخدام أي تسرب لختم الشرائح. للحفاظ على المدى الطويل من أدمغة الملون، إلى جانب قسائم اثنين يمكن أن تكون مختومة ثإيث طلاء الأظافر وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية، على الرغم من أن أدمغة الملون قد تفقد إشاراتها مع مرور الوقت. لا ينصح بذلك.
- أولا، الحصول على صورة من جانب من الدماغ أقرب إلى الهدف، ثم الوجه بعناية لل coverslips الحصول على عينات تقع في الوسط. هذه الخطوة تسهل الحصول على صورة من الجانب الآخر من نفس الدماغ.
- استخدام تستقيم المجهر المركب الفلورسنت و20X عدسة الهدف لصورة كاملة الدماغ (الأمثلة في الشكل 2) وهدف 40X إلى مناطق أصغر صورة من الدماغ، مثل الخلايا العصبية DA في المنطقة مجموعة تقرن الأمامي الإنسي (PAM) (أمثلة في الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح الشكل (1) والإجراءات الرئيسية لتشريح الدماغ الكبار، على النحو المبين أعلاه أرقام 2 و 3 هي صور تمثيلية من العمر 3-يوم-WT. (الوراثي: ث 1118) الكبار يطير العقول، التي costained مع الأجسام المضادة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH والملون باللون الأحمر في الشكل 2 والأبيض في الشكل 3)، علامة تستخدم عادة لتسمية الخلايا العصبية DA 11، بالإضافة إلى صبغ الحمض النووي دابي وصف كل نواة الخلية والأجسام المضادة ضد بروتين Elav، علامة لجميع الخلايا العصبية متباينة في الطاير (ملونة باللون الأخضر)، والتي كشفت معا الهيكل العام للدماغ.
لالأجسام المضادة الأولية في الشكلين 2 و 3، وكنا أرنب الأجسام المضادة لمكافحة TH في 1: 200 التخفيف والفئران مكافحة Elav الأجسام المضادة في التخفيف 1: 100، مبادرة الخوذ البيضاءأعدت الفصل في 1X PBT مع 5٪ مصل الماعز العادي لمنع ملزمة انوعي. عن الأجسام المضادة الثانوية، كنا اليكسا فلور 488 مترافق الأجسام المضادة الماعز مكافحة الفئران والماعز AlexaFluor596 مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في التخفيف 1: 500 في 1X PBT.
لصورة العقول، واستخدمنا المجهر المركب الفلورسنت تستقيم مجهزة وظيفة apotome للحصول على الصور Z-كومة من شرائح الدماغ التي تغطي عمق كاملة من منطقة الفائدة في الدماغ. على سبيل المثال، للحصول على تصور واضح لتوزيع العام من الخلايا العصبية DA في الدماغ كله، استخدمنا 20X عدسة موضوعية لحدة الصورة الأمامية والخلفية الجانبين من نفس الدماغ (الشكل 2). عمق كل جانب من الدماغ تصوير يمكن أن تغطي جميع الخلايا العصبية دا هو حوالي 20-25 ميكرومتر في المجموع. لتصور بشكل صحيح وتحديد الخلايا العصبية DA في المنطقة كتلة حزب الأصالة والمعاصرة، والتي لديها أحجام الخلية أصغر وأضعف الاشتراكية THgnals (أنظر أدناه)، استخدمنا 40X عدسة الهدف. بالإضافة إلى ذلك، في وظيفة اكتساب Z-سلسلة من البرامج التجارية، اخترنا سمك مقطع من 0،5-1 ميكرون بين كل شريحة تصويرها، والذي يكفل جودة الصورة المثلى في إعادة الإعمار 3D من المنطقة كتلة حزب الأصالة والمعاصرة (الشكل 3C). سمك كتلة حزب الأصالة والمعاصرة في الدماغ والتي تغطي جميع الخلايا العصبية DA حوالي 8-10 ميكرون في المجموع. في تجربتنا، يمكن الدالة apotome تقلل إلى حد كبير إشارة الضوضاء في التصوير عينات سميكة مع خلفية عالية، مثل الدماغ كله أو المنطقة كتلة حزب الأصالة والمعاصرة.
الأرقام 2A-E إظهار العرض الأمامي من الدماغ، في حين أن الأرقام 2F-J إظهار العرض الخلفي من نفس الدماغ بعد التقليب لل coverslips التي تحمل عينات الدماغ، الذي عرض على مستوى مماثل من شدة إشارة بين الجانبين من الدماغ ل جميع القنوات تصوير ثلاثة. وneur DAوقد جمعت الإضافات إلى مجموعات مختلفة التالية أوائل تعيين 11، على الرغم من هنا نستخدم اسم المقترنة الخلفي الإنسي (PPM) لتشمل PPM1، PPM2، ومجموعات PPM3 في الجانب الأمامي من الدماغ، واسم المقترنة الخلفي الجانبي (PPL ) لتغطية مجموعات PPL1 وPPL2 من الجانب الخلفي من الدماغ، كما هو مبين في الشكلين 2E و2J. 2E أرقام و2J في أبيض عرض الأمامي والآراء الخلفية من نفس الدماغ في عالية التكبير، وكشف عن مجموعات مختلفة من DA الخلايا العصبية على جانبي الدماغ. تحطمت الأبيض خطوط الضوء على حزب الأصالة والمعاصرة بارز ومجموعات تقرن الأمامي الجانبي (PAL) في الجانب الأمامي من الدماغ (الشكل 2E) وكذلك PPL ومجموعات PPM في الجانب الخلفي من الدماغ (الشكل 2J).
أرقام 3A و 3B ل إعادة ملخصات لنتائج القياس الكمي لبعض الكتل DA في ث 1118 الذباب. أحصينا الخلايا العصبية DA شريحة من قبل شريحة وأيضا من 3D بناء صور، والتي ينبغي تقليل عد غير دقيق. ونحن نقدر أن عمرها 3 أيام ث 1118 الذباب لديها في المتوسط 27 الخلايا العصبية DA عموما في الكتلة جزء في المليون في الدماغ، 16 الخلايا العصبية DA في الكتلة PPL في نصف الكرة الأرضية، 5 الخلايا العصبية DA في المجموعة PAL في نصف الكرة الأرضية (الشكل 3A)، و97 الخلايا العصبية DA في كل مجموعة من مجموعات حزب الأصالة والمعاصرة (الشكل 3B). الشكل 3C هو إعادة الإعمار 3D تمثيلية من الخلايا العصبية DA في المجموعات PAL وحزب الأصالة والمعاصرة، المتوقع من شرائح من الصور عالية التكبير التي تغطي جميع الخلايا العصبية DA في هذه المنطقة. ومن الواضح أنه بالمقارنة مع المجموعات الأخرى مثل PAL، الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة وأحجام الخلايا الصغيرة نسبيا وضعف إشارات تلطيخ TH.
"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
الشكل 1: رسم بياني لبروتوكول تشريح لالكبار ذبابة الفاكهة الدماغ يتم وضع (A) الذباب مع الجانب البطني صعودا، والتي تحتفظ بها الصدر باستخدام اليد غير المسيطرة. والقوة المطبقة بلطف (الأسهم الحمراء) إلى ملقط للحث على آماله المتخلفة من رئيس الطيران والإرشاد الخارجي طفيف للخرطوم، وتعريض المنطقة أبيض شفاف أدناه. تندس (ب) الملقط من ناحية المهيمنة في المنطقة شفافة تحت خرطوم، وخلق شق الضحلة (السهم الأحمر). لاحظ أن ملقط نستخدمها لا تملك نهايات طرف الجميلة جدا. ويسمح (C) الملقط لتفكك من خلال القوة الخاصة به، كما يتبين من السهام الحمراء. الزخم الذي تولد عن طريق فتح ملقط يزيل العين والهيكل الخارجي، وفضح لذبابة الفاكهة الدماغ نظيفة نسبيا. تتم إزالة معظم القصبة الهوائية في هذه العملية. (
الشكل 2: كشف DA الخلايا العصبية مع مكافحة هيدروكسيلاز التيروزين (TH) الأجسام المضادة في الكبار ذكر ذبابة الفاكهة B المطر (المكتسبة مع الهدف 20X) ويشمل هذا الرقم صور تمثيلية من أدمغة البالغين تشريح، أعيد بناؤها باستخدام الصور مكدسة Z في المنطقة دماغ الفائدة التي تم الحصول عليها مع المجهر الفلورسنت مركب. (AE) الأمامية و(FJ) وجهات النظر الخلفي من نفس الدماغ الكبار. (A & F) تم تصوير نواة خلية من تلطيخ دابي (أبيض) والخلايا العصبية (C & H) ثيحرث وصفت من قبل الأجسام المضادة علامة عموم العصبية مكافحة Elav (الأخضر)؛ وكشف الخلايا العصبية (B & G) DA بواسطة أضداد TH (الحمراء). (D & I) تراكب الصور لدابي، TH والعلاج Elav. (E & J) نظرا الموسع للمناطق الدماغ مع الخلايا العصبية دا هو مبين في الأبيض. الخطوط المتقطعة تبرز PAL وحزب الأصالة والمعاصرة مجموعات في الجزء الأمامي من الدماغ ومجموعات PPL وجزء في المليون في الخلفية من الدماغ. ويمثل الشريط على نطاق و50 ميكرون في كل من لوحات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الكمي لDA الخلايا العصبية في أدمغة الذكور البالغين ث 1118 الذباب (المكتسبة مع الهدف 40X). (A & B) الكمي لدا نeurons من يوم 3 ذكور ث 1118 الذباب، التي كشفت عنها تلطيخ مكافحة TH. يتم تمثيل البيانات عن طريق الخط الطولي المؤامرات مربع تبين الحدين الأدنى والأقصى حيث القيم المتطرفة. وكذلك أول (Q1)، الثاني (Q2) والثالث (Q3) الربعية. ويمثل الربع الثاني حيث بلغت قيمة المتوسط. (A) جزء في المليون {(ن = 28) الحد الأدنى: 21، Q1: 24، متوسط: 27، Q2: 30، الحد الأقصى: 32}، PPL {(ن = 26) الحد الأدنى: 10، Q1: 12، متوسط: 16، Q2: 18، الحد الأقصى: 25}، وبال {(ن = 24)، الحد الأدنى: 2، Q1: 4، متوسط: 5، Q2: 5، الحد الأقصى: 10} مجموعات؛ الكتلة (ب) PAM {(ن = 20) الحد الأدنى: 86، Q1: 94، متوسط: 97، Q2: 97، الحد الأقصى: 99}. (C) صورة الإسقاط تمثيلية تظهر الخلايا العصبية DA في حزب الأصالة والمعاصرة وPAL مجموعات من الذكور ث 1118 الذباب في 3 د. يمثل مقياس شريط 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع اهتمام متزايد في استخدام الكبار ذبابة الفاكهة الدماغ لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان الدماغ، الدوائر العصبية، وظائف المخ العليا، فمن الضروري لتطوير أساليب بسيطة وسريعة للحصول على العقول ذبابة سليمة لتحليل كامل جبل، وهو أمر مهم خصوصا للواسع حجم شاشات القائم على الدماغ. يوفر طريقة لدينا بسيطة وسهلة لتعلم نهج لتشريح من رأس الذبابة (غالبا في أقل من 10 ثانية مع الخبرة) مع التشكل المحفوظة جيدا أن أخلى إلى حد كبير من الأنسجة المرتبطة بها. كما لا تزال تعلق أدمغة تشريح لبقية الهيئات الطيران، وعادة ما تنزل الى قاع الأنبوب عينة بسرعة ويسهل التعرف عليها وجمع أثناء الغسل وتلطيخ الخطوات. هذا يقلل بشكل ملحوظ فقدان العينة التي يمكن أن تكون قضية بارزة في تجهيز العينات الدماغ من الأحجام الجسدية صغيرة. يمكن أن تكون هذه القضية أهمية خاصة للدراسات واسعة النطاق. الدماغ يمكن فصله بسهولة من الجسمبعد الانتهاء من عملية التلوين، قبل تصاعد.
أثناء تشريح، فمن المهم أن موقف الطاير بشكل صحيح، والحفاظ على الزوايا المناسبة عند إزالة الهيكل الخارجي من رأس ذبابة، وبلطف ممارسة القوة المناسبة في تنفيذ كل خطوة. فمن المستحسن أن ملقط توضع بشكل عمودي مع بعضها البعض من أجل منع قطع الرأس من ذبابة (الشكل 1B). كما هو مبين في الصور ممثل في الشكل 2، والعقول إعدادها باستخدام هذا البروتوكول تسفر عن نتائج مرضية. في هذا المثال، ركزنا على الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة من أدمغة البالغين. والدماغ ذبابة الفاكهة في المتوسط لديها ما مجموعه نحو 280 الخلايا العصبية DA في protocerebrum، والتي يتم توزيعها في مجموعات متميزة في مناطق مختلفة من الدماغ مع أنماط العرض المميزة والمخرجات الوظيفية 11 و 12. التوصيف السابق من الخلايا العصبية DA في العقول ذبابة الفاكهة الكبار، includiنانوغرام يطير نماذج من جينات الأمراض البشرية مثل المسوخ باركين، وركزت بشكل كبير على بال، PPL، وPPM الكتل التي لديها أحجام خلية كبيرة نسبيا والتعبير بارز من TH، صانع القياسية المستخدمة لوصفها الخلايا العصبية DA 13-18.
ومع ذلك، تم العثور على معظم الخلايا العصبية DA في الدماغ ذبابة في مجموعات حزب الأصالة والمعاصرة، مع حوالي 100 الخلايا العصبية DA لكل كتلة. مقارنة مع الخلايا في مجموعات DA أخرى، الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة تظهر عادة على مستوى أصغر التعبير هيدروكسيلاز التيروزين وأحجام خلايا صغيرة. في عينات أعد من وجهة نظرنا بروتوكول تشريح وتلطيخ، والخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة يمكن تصور واضح وتصوير في ذات جودة عالية باستخدام مجهر فلوري مركب، دون التصوير متحد البؤر. نظرا عدد سكانها الكبير، وتحديد حجم الخلايا العصبية DA في الكتلة حزب الأصالة والمعاصرة من خلفيات وراثية مختلفة قد تؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. نقترح أن الخلايا العصبية DA في clus حزب الأصالة والمعاصرةثالثا تمثل نظام آخر مفيد لدراسة البيولوجيا DA ونمذجة الاضطرابات المرتبطة DA، مثل مرض الشلل الرعاش.
في تجربتنا، وظيفة apotome من المجهر كنا يمكن أن تقلل بشكل كبير من إشارة الخلفية، خصوصا في فحص عينات مع سمك كبير، مثل كله الذبابة الدماغ. على الرغم من أن المجهر متحد البؤر يمكن أن تنتج صورا مع مزيد من التفاصيل، تضخم أعلى وجودة أفضل، وغالبا ما تستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وهذا ينطبق بشكل خاص على تصوير عدد كبير من العينات سميكة مثل أدمغة البالغين التي تتطلب سلسلة من القسم Z المكدس واضح لإعادة الإعمار 3D والتحليل deconvolution. في هذا المنظور، وتمثل وظيفة apotome بديل سريع وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج صور ذات نوعية كافية (على سبيل المثال، الصور في الشكلين 2 و 3).
في دراسات الدماغ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لخلايا صورة على حد سواء الاشتراكيةقصر من نفس الدماغ. على سبيل المثال، الخلايا العصبية DA موجودة في مجموعات من كل من الأمامي والخلفي الجانبين من الدماغ. ولكن نظرا لسمكها، بعد أن يتم تركيب الدماغ على الشريحة، وعلى الجانب بعيدا عن مصدر الضوء (أي الجانب التي تواجه شريحة متزايدة) وعادة ما يثير الإشارات الضعيفة والصور أقل وضوحا عند تصويرها باستخدام مركبات منتظم ومتحد البؤر المجهر. بواسطة تركيب العينات في بين اثنين من الشرائح غطاء، لأنها تتيح التقليب مريحة من العينات على الشريحة التي شنت والتصوير لاحق من كلا الجانبين من نفس الدماغ مع شدة إشارة مماثلة الشكل 2 مثال على التصوير الخلايا العصبية DA من جانبي يطير العقول باستخدام هذه الطريقة، التي أظهرت كثافة إشارات مماثلة نسبيا وجودة التصوير.
وكانت عدة طرق سهلة المتابعة للتشريح الكبار يطير العقول لطيف وصفها 9 و 10. يوفر نهجنا طريقة بديلة يمكن أن الفراءذر تبسيط عمليات تشريح وتلطيخ الكبار تطير العقول. مع المزيد من الدراسات على نطاق واسع يجري لرسم المخ بأكملها الدوائر العصبية وكذلك مكوناته الجزيئية والخلوية، فمن المتوقع أن تشريح والتصوير النهج الآلي يمكن تطويرها للكبار العقول ذبابة الفاكهة لتحقيق شاشات الوراثية والمخدرات عالية الإنتاجية في الجسم الحي في هذا النموذج الجيني الكلاسيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونحن نعترف السيد أنيس محمد، السيدة كيارا اندرادي، السيدة بيلار رودريجيز، كريس كوك، والسيدة دانا سورة غافر للحصول على الدعم الهائل لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
