Summary
Den voksne Drosophila hjerne er et værdifuldt system til at studere neuronal kredsløb, højere hjernefunktioner, og komplekse lidelser. En effektiv metode til at dissekere hele hjernevæv fra den lille flue hoved vil lette hjerne-baserede undersøgelser. Her beskriver vi en enkel, et-trins dissektion protokol af voksne hjerner med velbevaret morfologi.
Abstract
Der er en stigende interesse i at bruge Drosophila at modellere menneskelige hjerne degenerative sygdomme, kort neuronale kredsløbssystemer hos voksne hjerner, og studere det molekylære og cellulære grundlag af højere hjernefunktioner. En hel-mount forberedelse af voksne hjerner med velbevaret morfologi er afgørende for sådanne hele hjernen-baserede undersøgelser, men kan være teknisk udfordrende og tidskrævende. Denne protokol beskriver en nem at lære, et-trins dissektion tilgang af en voksen flue hoved på mindre end 10 s, medens den intakte hjerne er fæstnet til resten af kroppen for at lette efterfølgende forarbejdningstrin. Proceduren hjælper med at fjerne de fleste af øjet og trakeale væv normalt er forbundet med hjernen, der kan forstyrre den senere billedbehandling trin, og placerer også mindre krav til kvaliteten af de dissekere pincet. Derudover beskriver vi en simpel metode, der tillader bekvem flipping af de monterede hjerneprøver på et dækglas, hvilket er vigtigt til afbildning begge sider af bregnskyl med lignende signal intensitet og kvalitet. Som et eksempel på protokollen, vi fremlægge en analyse af dopaminerge (DA) neuroner i voksne hjerner WT (w 1118) fluer. Den høje effektivitet af dissektion metode gør det især nyttigt for store voksne hjerne-baserede studier i Drosophila.
Introduction
Modellen organisme Drosophila, almindeligvis kendt som bananfluen, har længe været værdsat for sine elegante genetiske værktøjer, korte reproduktive gange, og stærkt bevaret molekylære og cellulære veje. Bananfluen er blevet anvendt med held til at dissekere grundlæggende signalveje, mønstret mekanismer flercellede organismer, såvel som mekanismerne bag neuronal udvikling, funktioner og sygdomme 1,2. Med de seneste fremskridt inden for celle mærkning og imaging teknologier, har bananfluen hjernen bliver særligt effektiv i fin kortlægning af neuronal kredsløb og i at dissekere den molekylære og cellulære grundlag af højere hjernefunktioner, såsom indlæring og hukommelse, og døgnrytme 1,3, 4,5,6,7,8.
En særlig fordel ved Drosophila-systemet er dets relativt lille størrelse, hvilket tillader hel-mount fremstilling og undersøgelse af hjernen under anvendelse af en almindelig forbindelse eller konfokal mikroskop. This funktion giver detaljerede anatomiske og funktionelle analyser af neuronal kredsløb, eller endda en enkelt neuron, ved cellulære og subcellulære niveauer, i forbindelse med en hel hjernevæv, hvilket giver både et holistisk syn på den undersøgte genstand og dens præcise geometri i hele hjerne. Men i betragtning af den temmelig miniature størrelse af hjernen, præsenterer det også en teknisk udfordring i effektivt dissekere en intakt hjernevæv ud af den beskyttende exoskeleton hoved sagen i en voksen flue. Forskellige effektive og relativt simple dissektion metoder er blevet beskrevet i detaljer, som normalt involverer omhyggelig og trinvis fjernelse af hovedet sagen og de tilknyttede væv, herunder øjnene, luftrør, og fedt fra hjernen ordentlig 9, 10. Disse mikrokirurgiske dissektionsmetode Placer ofte ret strenge krav til kvaliteten af de dissektion pincet, bygger på pincet med fine godt alliancefrie tips, der let kan beskadiges. Da de dissekerede hjerner ofte separatelyed fra resten af kroppen, kan hjerner let tabt under de efterfølgende farvning og vaskeprocesser grund af deres små størrelser og deres gennemsigtighed i behandlingen buffer. Her beskriver vi en relativt simpel og nem at lære, et-trins dissektion protokol for voksne hjerner, der holder de dissekerede hjerner knyttet til torsoen. Den dissektion proces ofte let rydder væk de fleste af hjernen-associerede væv, såsom øjet og luftrøret og reducerer behovet for god kvalitet dissektion pincet.
Derudover, når billeddannelse af hjernen under fluorescerende forbindelse mikroskop eller konfokalt mikroskop, den side af hjernen, der er væk fra den fluorescerende lyskilde frembringer ofte et svagere signal og mindre klare billeder på grund af tykkelsen af hele-mount hjernen. Her beskriver vi også en enkel montering metode, der muliggør let flipping af hjerneprøver, hvilket muliggør bekvem billeddannelse af begge sider af hjernen med lignende signal intensiveretty og kvalitet.
Som en proof-of-concept for anvendelsen af denne metode til at studere den voksne hjerne, vi yderligere undersøgt tilstedeværelsen af DA neuroner i hjernen på w 1118 fluer; en genotype, som ofte anvendes som den parentale linje til generering af transgene fluer og vildtype kontrol i mange Drosophila undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Løsninger Bruges til Brain Dissektion og immunfluorescensfarvning
- Dissekere voksen flyve hjerner i kunstig cerebral spinalvæske (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO4, 1,3 mM MgCl2, og 10 mM glucose. Før brug gas i aCSF med 5% CO2 / 95% O 2 for 10 - 15 min og spike med 2,5 mM CaCl2. Steriliser aCSF opløsningen ved filtrering gennem et 0,22 um membranfilter.
Bemærk: Opbevar aCSF ved 4 ° C for at forhindre bakteriel forurening. Fly hjerner kan også dissekeret i en phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning, selv om der ikke er blevet udført detaljerede sammenligninger af virkningerne af de to dissektion løsninger på den endelige billeddannelse kvaliteten af de dissekerede hjerner. - Brug 4% paraformaldehyd (PFA) fremstillet i 1x PBS som fiksativ opløsning, der normalt alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C.
caution: PFA er giftigt og ætsende og skal håndteres med forsigtighed. - Brug 1x PBS til skylning af PFA fra hjernerne og efter den sidste vasketrin under immunfluorescensfarvning af de dissekerede hjerner. Forbered 1x PBS fra 10x PBS-stamopløsning (1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 100 mM Na 2 HPO 4, og 18 mM KH 2 PO 4).
- Brug 0,3% Tween-20 i 1x PBS (1x PBT) for alle de efterfølgende vasketrin under immunfluorescensfarvning af de dissekerede hjerner.
2. Microsurgical Dissektion af Adult Fly Heads
Bemærk: Proceduren for dissektion er illustreret i figur 1.
- Bedøver de voksne fluer med CO 2. Ved hjælp af pincet, afhente en flue og kortvarigt afvoksning sin neglebånd ved at dyppe det i 70% ethanol i 3 - 5 s. Dette sikrer, at ingen bobler holde sig til fluen neglebånd når nedsænket i aCSF eller 1X PBS dissektion løsning.
- under endissektionsmikroskop med en lyskilde i en vinkel, der ikke vil blive blokeret af hænder, satte sig som mål linse for at opnå et klart billede af fluen (1.2X forstørrelse). Brug pincet med nondominant hånd at immobilisere dyret og nedsænke fluen i det kolde dissektion løsning med sin mave opad, som vist i figur 1A.
- Hold pincet på en 160 - 170 ° vinkel i forhold til dissektion plade, under let lille kraft på underlivet af fluen (illustreret som pilene i figur 1A). Dette skridt vil immobilisere fluen og tvinge den til at bevæge hovedet bagover med 15 - 25 ° samtidig udvide snabel opad. I processen, en blød og gennemskinnelige region af kutikula, under snabel, bør fremgå. Øge forstørrelsen og justere fokusplanet på denne region.
Bemærk: Du må ikke holde tangen for stramt, men snarere blot fast nok til at stabiliserefluen. For stor kraft vil bevirke de indvendige organer til at briste i opløsningen. - Brug den dominerende hånd til at trykke de dissekere pincet så dens tip er lukket, hvilket vil generere en mild resistent kraft på spidsen af tangen, så tangen springer åbne, når trykket fra bedriften hånd slippes. Placer tangen vinkelret på tangen holder fluen, som vist i figur 1B.
- Pierce de lukkede spidsen af dissektion pincet gennem det bløde og gennemskinnelige region af neglebånd nedenunder snabel, som illustreret ved den røde pil i figur 1B. Det er vigtigt ikke at trænge tangen for dybt, at det rører hjernen. Hjernen korrekt bør blive synlig. Oprethold en stabil forståelse af fluen med nondominant hånd.
- Hurtigt, men støt, frigiver spidsen af dissektion pincet af sin egen kraft og stole på det momentum fra denne udgivelse til at rive væk than ydre skelet omgiver fluen hoved. Et intakt hjerne korrekt bør blive synlig (hvid væv umiddelbart over spidsen af den nederste forcep i figur 1C) Følg en imaginær linje til at styre dynamikken af de frigivne pincetspidser (illustreret som passiv røde pile vist i fig 1C). Dette vil forsigtigt fjerne exoskelettet og det meste af hjernen-associerede øje og trachea fra hjernen. Den rette timing og kraft, der påføres åbne exoskelettet vil være afhængig af investigator erfaringer.
Bemærk: Dette er det mest kritiske trin under dissektion. Det er vigtigt at stole på den naturlige kraft, der genereres fra fremdriften i åbningen pincet til at fjerne exoskelettet mens den udsatte hjernen forbliver bundet til resten af kroppen. - Brug pincet i den dominerende hånd til forsigtigt at fjerne de resterende tilbehør væv, såsom den trachea, der vises som hvide fiber strukturer remaining knyttet til hjernen. Pas på ikke at trække eller skade hjernen korrekt.
3. immunfluorescensfarvning af Brains
- Fix de dissekerede hjerneprøver med tilhørende torsoer i ca. 1 ml 4% PFA for i 40 - 60 min.
Bemærk: Af denne og efterfølgende trin, holde rør eller plader med prøver på en nutator til korrekt blande prøverne i opløsningen. - Skyl med 1 ml 1x PBS ved pipettering af opløsningen op og ned 3 gange. Pas på ikke at aspirere hjernen væk.
- Vask 5 gange med 1x PBT i 5 min hver. Hold prøverne på nutator under inkubation.
- Inkuber med primære antistoffer ved korrekt fortynding O / N ved 4 ° C.
- Den næste dag, fjerne de primære antistoffer, og vask prøverne 5 gange med 1x PBT. Lad prøverne i 5 - 10 min i 1x PBT løsning i mellem hver vask. Hold prøverne på nutator under inkubation.
- Inkubér vasketprøver i passende sekundære antistoffer med den foreslåede fortynding og inkubationstid.
- Vask prøverne seks gange med 1x PBT med en 10 min inkubering mellem hver vask.
Dette trin er kritisk for fjernelse af ikke-specifikt bundne sekundære antistoffer fra prøven. - Inkuber i en 1: 10.000 fortynding af 1 mg / ml 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 1x PBT opløsning i 30 minutter. DAPI er en DNA-farvestof, som binder til AT områder af DNA og kan anvendes til at afsløre den overordnede morfologi af hjernen.
- Skyl tre gange med 1x PBS.
- Overfør prøver til en dissektion fad, og adskille hjerner fra de organer i en dissektion fad med en pincet.
- Efter farvning og vasketrin, montere hjerner i mellem to dækglas og placere dækglas oven på et monterings dias. På denne måde kan de hjerneprøver let vendes, således at begge sider af hjernen kan afbildes med en lignende signalintensitet.
- Placer en 18 x 18 mm dækglas på toppen af en monteringsglideren. Udvide åbningen af en pipettespids med en kniv og bruge det til at overføre hjerner i 1x PBS opløsningen på 18 x 18 mm dækglas.
- Placer hjernerne på midten af dækglasset, fjerne væsken omkring hjernen med en fin pipettespids, og derefter tilføje yderligere 20 - 40 pi anti-fade monteringsmedium (0,2% (vægt / volumen) n-propylgallat i 99,5 % ACS-kvalitet glycerol) over de hjerner.
Bemærk: Mængden af montering medium tilsættes, afhænger af antallet af hjerner undersøgt.- Spred forsigtigt ud hjernerne mens forskyde den viskose monteringsmedium udad. Placer en anden 18 x 18 mm dækglas på toppen af hjerner ved først at sænke objektglasset fra en side, indtil det kommer i kontakt medoverfladen af monterings slip, og derefter langsomt sænke den anden side at minimere hjernen kontakt med luftbobler.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at anvende et afstandsstykke mellem de to dækglas, som volumenet af monteringsmedium og hjernerne skulle give en tilstrækkelig til at adskille de to dækglas plads.- Lad dias at slå sig ned. Fjerne overskydende væske, der kommer ud fra siderne af kilerne med et laboratorium væv.
- For at forhindre dækglas med de monterede hjerner i at falde monteringsglideren under transport, skal du bruge et lille stykke tape til at fastgøre dækglas til montering dias.
Bemærk: Hjerner monteret i mellem siderne kan afbildes straks eller opbevaret ved 4 ° C i op til en uge uden væsentligt tab af fluorescerende signal, uden behov for at anvende nogen tætningsmiddel til at forsegle objektglassene. For langsigtede bevarelse af de farvede hjerner, kan den side af de to sedler forsegles wi'te neglelak og opbevaret i en -20 ° C fryser, selv om farvede hjerner kan miste deres signaler over tid. Dette anbefales ikke.
- Først hente billedet fra siden af hjernen nærmere målet, og derefter forsigtigt flip dækglassene at have prøverne klemt i midten. Dette trin letter modtagelse af billedet på den anden side af det samme hjerne.
- Brug en opretstående sammensatte fluorescerende mikroskop og en 20X objektiv til billedet hele hjernen (eksempler i figur 2) og en 40X objektiv til billedet mindre områder af hjernen, såsom DA neuroner i den parrede Anterior Medial (PAM) klynge region (eksempler i figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer de vigtigste procedurer for voksne hjerne dissektion, som beskrevet ovenfor figur 2 og 3 er repræsentative billeder af 3 dage gamle WT. (Genotype: w 1118) voksen flyve hjerner, som blev costained med et antistof mod tyrosin hydroxylase (TH , farvet røde i figur 2 og hvid i figur 3), en markør der almindeligvis anvendes til at mærke DA neuroner 11, foruden den DNA farvestoffet DAPI at mærke alle cellekerner og et antistof mod Elav protein, en markør for alle differentierede neuroner i gylp (farvet med grønt), som tilsammen afslørede den overordnede struktur af hjernen.
For de primære antistoffer i figur 2 og 3, anvendte vi kanin-anti-TH antistof ved en 1: 200 fortynding og rotte-anti-Elav antistof ved en 1: 100 fortynding, which udarbejdet i 1x PBT med 5% normalt gedeserum for at blokere uspecifik binding. Til sekundære antistoffer, anvendte vi Alexa Fluor 488-konjugeret gede-anti-rotte-antistof og AlexaFluor596-konjugeret gede-anti-kanin-antistof ved en 1: 500 fortynding i 1 x PBT.
Til billedet hjernen, brugte vi en opretstående sammensatte fluorescerende mikroskop udstyret med en apotome funktion til at erhverve Z-stak billeder af hjernen skiver, der dækker hele dybden af det område af interesse i hjernen. For eksempel for at opnå en klar visualisering af den generelle fordeling af DA-neuroner i hele hjernen, anvendte vi et 20X objektiv linse til separat billede de forreste og bageste sider af samme hjerne (figur 2). Dybden af hver side af hjernen afbildet som kan dække alle DA neuroner er i 20 - 25 um i alt. Til pålideligt visualisere og kvantificere DA neuroner i PAM klynge region, som har mindre cellestørrelser og svagere TH signals (se nedenfor), anvendte vi en 40X objektiv. Derudover er der i Z-serien erhvervelse funktion fra kommerciel software, valgte vi en sektion tykkelse på 0,5 - 1 um mellem hver afbildes skive, som har sikret optimal billedkvalitet i en 3D rekonstruktion af PAM klynge region (figur 3c). Tykkelsen af PAM klynge i hjernen, der dækker alle de DA neuroner er omkring 8 - 10 um i alt. Det er vores erfaring, kan apotome funktion reducerer betydeligt støjsignalet i billeddannelse tykke prøver med høj baggrund, såsom et helt hjerne eller PAM klynge region.
Figur 2A-E viser forfra af en hjerne, hvorimod figurerne 2F-J viser den bageste visning af samme hjernen efter spejlvende dækglassene der holder hjerneprøver, som viser et tilsvarende signalintensitet mellem to sider af hjernen for alle de tre afbildede kanaler. Den DA NEURons blev inddelt i forskellige klynger efter den tidlige betegnelse 11, selvom vi her bruger navnet Parret Posterior Medial (PPM) til at omfatte pPM1, PPM2, og PPM3 klynger på den forreste side af hjernen, og navnet Parret Posterior Lateral (PPL ) til dækning af PPL1 og PPL2 klynger fra den bageste side af hjernen, som afbildet i fig 2E og 2J. figur 2E og 2J i hvid show anteriore og posteriore visninger af samme hjerne i stor forstørrelse, afslører forskellige klynger af dA neuroner på begge sider af hjernen. Den hvide stiplede linjer fremhæve fremtrædende PAM og forbundet Anterior Lateral (PAL) klynger i den forreste side af hjernen (figur 2E) samt PPL og PPM klynger i den bageste side af hjernen (figur 2J).
Figur 3A og 3B en re resuméer af kvantificering resultater for nogle af de DA-klynger i w 1118 fluer. Vi tælles DA neuroner skive ved skive og også fra 3D rekonstruerede billeder, som skal minimere upræcis optælling. Vi vurderer, at de tre dage gamle w 1118 fluer har et gennemsnit på 27 DA neuroner samlet i PPM klynge pr hjerne, 16 DA neuroner i PPL klynge pr halvkugle, 5 DA neuroner i PAL klynge pr halvkugle (figur 3A), og 97 DA neuroner i de PAM klynger (figur 3B). Figur 3C er et repræsentativt 3D rekonstruktion af DA-neuroner i PAL og PAM klynger, projiceret fra skiver af stor forstørrelse billeder dækker alle de DA neuroner i denne region. Det fremgår, at sammenlignet med andre klynger såsom PAL, DA neuroner i PAM klynge har relativt mindre cellestørrelser og svagere TH farvende signaler.
"Src =" / files / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
Figur 1:. Grafisk Illustration af Dissektion protokollen for Voksen Drosophila Brain (A) Fluer er placeret med den ventrale side opad, og som thorax hjælp af ikke-dominerende hånd. Kraft blev forsigtigt påført (røde pile) til de pincet til at fremkalde bagud hældning af flue hoved og let udadgående forlængelse af snabel, udsætter den hvide gennemsigtige område nedenfor. (B) Tang fra den dominerende hånd indsættes i den transparente region beneath snabel, opretter en lavvandede indsnit (rød pil). Bemærk, at tangen vi bruger ikke har meget fine spids ender. (C) Tang får lov til at gå fra hinanden gennem sin egen kraft, som angivet ved de røde pile. Den fremdrift ved at åbne tangen fjerner øjne og ydre skelet, udsætter en forholdsvis ren Drosophila hjernen. De fleste af luftrøret fjernes i processen. (
Figur 2:. DA Neuroner Revealed med anti-tyrosinhydroxylase (TH) antistof i Voksen Mand Drosophila B regn (Erhvervet med en 20X Formål) Dette tal omfatter repræsentative billeder af dissekerede voksne hjerner, rekonstrueret ved hjælp af Z-stacked billeder af hjernen regionen interesse opnået med forbindelsen fluorescensmikroskop. (AE) Forreste og (FJ) Posterior udsigt over det samme voksne hjerne; (A & F) Cellekerner blev afbildet ved DAPI-farvning (hvid) og (C & H) neuroner were mærkede af pan-neuronal markør anti-Elav antistoffer (grøn); (B & G) DA neuroner er afsløret af anti-TH-antistoffer (rød). (U & I) Overlay af billeder til DAPI, TH og Elav behandling. (E & J) forstørret billede af hjerneregioner med DA neuroner vises med hvidt. Stiplede linjer fremhæve PAL og PAM klynger i den forreste af hjernen og PPL og PPM klynger i den bageste af hjernen. Skalaen søjle repræsenterer 50 um i alle panelerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Kvantificering af DA neuroner i hjernen hos Male voksen w 1118 fluer (Erhvervet med en 40X Mål). (A & B) Kvantificering af DA neurons af dag tre mænd w 1118 fluer, afsløret af anti-TH farvning. Data er repræsenteret ved knurhår box plots viser minimum og maksimum værdier som outliers; samt den første (Q1), anden (Q2) og tredje (Q3) kvartiler. Den anden kvartil er repræsenteret som middelværdien. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, Q1: 24, gennemsnit: 27, Q2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, Q1: 12, Average: 16, Q2: 18, Max: 25}, og PAL {(n = 24), Min: 2, Q1: 4, gennemsnit: 5, Q2: 5, Max: 10} klynger; (B) PAM klynge {(n = 20) Min: 86, Q1: 94, gennemsnit: 97, Q2: 97, Max: 99}. (C) Et repræsentativt projektion billede, der viser DA neuroner i PAM og PAL klynger af mandlige w 1118 fluer ved 3 d. Scale søjle repræsenterer 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med en stigende interesse i at bruge voksne Drosophila hjernen til at studere humane hjernesygdomme, neuronal kredsløb og højere hjernefunktioner, er det nødvendigt at udvikle enkle og hurtige metoder til at opnå intakte flyve hjerner for hel-mount analyser, hvilket er særligt vigtigt for stor- skalere hjerne-baserede skærme. Vores metode giver en enkel og nem at lære tilgang at dissekere en flue hoved (ofte på mindre end 10 s med erfaring) med velbevaret morfologi, der er i høj grad ryddet for tilknyttede væv. Da de dissekerede hjerner stadig er fæstnet til resten af fluen organer, de normalt synke til bunden af prøverøret hurtigt og er nemme at genkende og indsamle under Vask og farvning trin. Dette minimerer markant prøve tab, der kan være en fremtrædende problem i behandlingen hjernen prøver af bittesmå fysiske størrelser. Dette problem kan være særligt vigtigt for store studier. Hjernen kan let adskilles fra kroppenefter afslutningen af farvningen processen, før monteringen.
Under dissektion, er det vigtigt at placere fluen korrekt, opretholde den rette vinkler ved fjernelse exoskelettet fra fluen hoved, og forsigtigt lægge den korrekte kraft i hvert trin. Det anbefales, at tangen er placeret vinkelret på hinanden for at forhindre halshugning af fluen (figur 1B). Som vist i de repræsentative billeder i figur 2, hjernerne fremstillet ved hjælp af denne protokol giver tilfredsstillende resultater. I dette eksempel har vi fokuseret på DA-neuroner i PAM klynge af voksne hjerner. En Drosophila hjerne i gennemsnit har i alt ca. 280 DA neuroner pr protocerebrum, som er fordelt i forskellige klynger i forskellige områder af hjernen med markante projektion mønstre og funktionelle output 11, 12. Forrige karakterisering af DA neuroner hos voksne Drosophila hjerner, including flyve modeller for humane sygdomsgener såsom i parkin mutanter, i vid udstrækning har fokuseret på PAL, PPL, og PPM klynger, der har relativt store cellestørrelser og fremtrædende ekspression af TH, standard maker anvendes til mærkning DA neuroner 13-18.
Dog er de fleste af DA neuroner i fluen hjernen findes i PAM klynger, med omkring 100 DA neuroner pr klynge. Sammenlignet med celler i andre DA klynger, DA neuroner i PAM klynge viser normalt en mindre grad af tyrosin hydroxylase-ekspression og mindre cellestørrelser. I prøver fremstillet ud fra vores dissektion og farvning protokol, kan DA neuroner i PAM klynge klart visualiseres og filmede i høj kvalitet ved hjælp af en forbindelse, fluorescerende mikroskop, uden konfokal billeddannelse. I betragtning af dets store antal, kan kvantificering af DA-neuroner i PAM klynge af forskellige genetiske baggrunde producere mere pålidelige og reproducerbare resultater. Vi foreslår, at DA neuroner i PAM Cluster repræsenterer en anden nyttig til undersøgelse DA biologi og modellering DA-relaterede lidelser, såsom Parkinsons sygdom.
Det er vores erfaring, at apotome funktion fra mikroskopet vi bruges kan reducere baggrundssignalet betydeligt, især i undersøgelse af prøver med betydelig tykkelse, såsom hele den voksne flue hjernen. Selv konfokal mikroskop kan producere billeder med flere detaljer, højere forstørrelse og bedre kvalitet, er det ofte tidskrævende og dyrt. Dette gælder især for afbildning af et stort antal tykke prøver såsom voksne hjerner, der kræver serie af Z-stack sektion for klart 3D-rekonstruktion og deconvolution analyse. I dette perspektiv den apotome funktionen repræsenterer en hurtig og omkostningseffektivt alternativ til at producere billeder af tilstrækkelig kvalitet (fx billeder i figur 2 og 3).
I hjernen undersøgelser, er det ofte nødvendigt at billeddata celler på begge sides af samme hjerne. F.eks DA neuroner er til stede i klynger fra både de forreste og bageste sider af hjernen. Men på grund af sin tykkelse, efter en hjerne er monteret på slæden, den side væk fra lyskilden (dvs. den side der vender monteringsglideren) giver normalt anledning til svagere signaler og mindre tydelige billeder, når filmede med regelmæssig forbindelse og konfokal mikroskoper. Ved at montere prøverne i mellem de to dækslides, det tillader bekvem flipping af prøverne på den monterede dias og efterfølgende billeddannelse af begge sider af samme hjerne med lignende intensiteter signal. Figur 2 er et eksempel på billeddannende DA neuroner fra begge sider af flyve hjerner ved hjælp af denne metode, som viste relativt sammenlignelig signalering intensitet og billedkvalitet.
Adskillige let at følge tilgange til dissekere voksne flyve hjerner har været pænt beskrevet 9, 10. Vores tilgang giver en alternativ metode, der kan pelsTher forenkle dissektion og farvning processer voksen flyve hjerner. Med flere studier store gennemføres for at kortlægge hele hjernen neuronal kredsløb samt dets molekylære og cellulære bestanddele, det kan forudses, at der kan udvikles automatiserede dissektion og billedteknik for voksne Drosophila hjerner til at realisere højt gennemløb genetiske og narkotika skærme in vivo i denne klassiske genetiske model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi anerkender Mr. Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, og Ms. Danna Ghafir for deres enorme støtte til projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
