Summary
वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क न्यूरोनल सर्किट, उच्च मस्तिष्क काम करता है, और जटिल विकारों के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। एक कारगर तरीका छोटी मक्खी सिर से पूरे मस्तिष्क के ऊतकों काटना करने के लिए मस्तिष्क आधारित अध्ययन की सुविधा होगी। यहाँ हम एक सरल, एक कदम विच्छेदन वयस्क दिमाग की अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान के साथ प्रोटोकॉल का वर्णन।
Abstract
वहाँ ड्रोसोफिला का उपयोग, मानव मस्तिष्क अपक्षयी रोगों मॉडल वयस्क दिमाग में neuronal circuitries नक्शा, और उच्च मस्तिष्क कार्यों की आणविक और सेलुलर आधार का अध्ययन करने में एक बढ़ती रुचि है। अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान के साथ वयस्क दिमाग के एक पूरे माउंट तैयारी इस तरह पूरे मस्तिष्क आधारित अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली हो सकती है। इस प्रोटोकॉल, कम से कम 10 एस में एक वयस्क मक्खी सिर के एक, आसान करने के लिए सीखना एक कदम विच्छेदन दृष्टिकोण का वर्णन करते हुए बाद के प्रसंस्करण की सुविधा के लिए कदम बरकरार शरीर के बाकी हिस्सों से जुड़ी मस्तिष्क रखे हुए हैं। प्रक्रिया सामान्य रूप से मस्तिष्क है कि बाद में इमेजिंग कदम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के साथ जुड़े आंख और सांस की नली के ऊतकों के सबसे हटाने में मदद करता है, और भी विदारक संदंश की गुणवत्ता पर कम मांग रखता है। इसके अतिरिक्त, हम एक सरल विधि है, जो बी के दोनों ओर इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है कि एक coverslip पर मुहिम शुरू की मस्तिष्क के नमूनों की सुविधाजनक flipping के लिए अनुमति देता है का वर्णनइसी तरह के संकेत तीव्रता और गुणवत्ता के साथ बारिश। प्रोटोकॉल का एक उदाहरण के रूप में, हम गुम्मट के वयस्क दिमाग में डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स के एक विश्लेषण पेश (डब्ल्यू 1118) मक्खियों। विच्छेदन विधि के उच्च प्रभावकारिता यह विशेष रूप से ड्रोसोफिला में बड़े पैमाने पर वयस्क मस्तिष्क आधारित अध्ययन के लिए उपयोगी बनाता है।
Introduction
मॉडल जीव ड्रोसोफिला, आमतौर पर फल मक्खी के रूप में जाना जाता है, लंबे समय से अपनी सुरुचिपूर्ण आनुवंशिक उपकरणों, लघु प्रजनन के समय के लिए मूल्यवान है, और अत्यधिक आणविक और सेलुलर रास्ते संरक्षित किया गया। फल मक्खी सफलतापूर्वक बुनियादी संकेत दे रास्ते, बहुकोशिकीय जीवों की patterning तंत्र, साथ ही तंत्र न्यूरोनल विकास, कार्य अंतर्निहित, और रोगों 1,2 टुकड़े करना नियोजित किया गया है। सेल लेबलिंग और इमेजिंग तकनीक के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के साथ, फल मक्खी के मस्तिष्क न्यूरोनल circuitry के ठीक मानचित्रण में और इस तरह सीखने और स्मृति, और circadian ताल 1,3 के रूप में उच्च मस्तिष्क कार्यों की आणविक और सेलुलर आधार विदारक में विशेष रूप से शक्तिशाली हो गया है, 4,5,6,7,8।
ड्रोसोफिला प्रणाली का एक विशेष लाभ अपने अपेक्षाकृत छोटे आकार, पूरे माउंट तैयारी और मस्तिष्क एक नियमित यौगिक या confocal खुर्दबीन का उपयोग की परीक्षा की अनुमति है। थीएस सुविधा इस प्रकार पूरे भीतर दोनों का अध्ययन विषय के लिए एक समग्र दृष्टिकोण और उसका सही ज्यामिति उपलब्ध कराने, एक पूरे के मस्तिष्क के ऊतकों के संदर्भ में neuronal circuitry की विस्तृत शारीरिक और कार्यात्मक विश्लेषण, या यहां तक कि एक न्यूरॉन, सेलुलर और subcellular स्तर पर सक्षम बनाता है, दिमाग। हालांकि, मस्तिष्क के बजाय लघु आकार को देखते हुए यह भी कुशलता से एक वयस्क मक्खी में सुरक्षात्मक बहिःकंकाल सिर मामले से बाहर एक अक्षुण्ण मस्तिष्क के ऊतकों विदारक में एक तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। विभिन्न प्रभावी और अपेक्षाकृत सरल विच्छेदन के तरीकों को विस्तार से वर्णन किया गया है, जो आम तौर पर सावधान शामिल है और कदम वार सिर मामले के हटाने और आंखों सहित जुड़े ऊतकों, श्वासनली, और वसा मस्तिष्क उचित 9, 10। ये microsurgical विच्छेदन तरीकों से अक्सर विच्छेदन संदंश की गुणवत्ता पर नहीं बल्कि कड़े मांगों जगह है, ठीक है अच्छी तरह से गठबंधन सुझाव दिए आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है के साथ संदंश पर निर्भर है। इसके अलावा, के रूप में विच्छेदित दिमाग अक्सर separat हैंशरीर के बाकी हिस्सों से एड, दिमाग को आसानी से, क्योंकि उनके छोटे आकार और प्रसंस्करण के बफर में उनकी पारदर्शिता के बाद धुंधला और कपड़े धोने की प्रक्रिया के दौरान खो दिया जा सकता है। यहाँ, हम वयस्क दिमाग कि विच्छेदित धड़ से जुड़ी दिमाग रहता है के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और आसान करने के लिए जानने के लिए, एक कदम विच्छेदन प्रोटोकॉल का वर्णन। विच्छेदन प्रक्रिया अक्सर आसानी से इस तरह आंख और श्वासनली के रूप में मस्तिष्क से जुड़े ऊतकों के सबसे दूर साफ करता है और अच्छी गुणवत्ता विच्छेदन संदंश के लिए मांग कम कर देता है।
इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट यौगिक सूक्ष्मदर्शी या confocal खुर्दबीन के नीचे ब्रेन इमेजिंग जब मस्तिष्क के पक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत से दूर है कि अक्सर एक कमजोर संकेत और कम स्पष्ट छवियों पूरे माउंट मस्तिष्क की मोटाई के कारण पैदा करता है। यहाँ, हम भी एक साधारण बढ़ते विधि है कि मस्तिष्क के नमूनों की आसान flipping की अनुमति देता है, इसी तरह के संकेत intensi साथ मस्तिष्क के दोनों पक्षों के सुविधाजनक इमेजिंग सक्षम वर्णनTy और गुणवत्ता।
वयस्क मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए इस विधि के आवेदन के लिए एक सबूत की अवधारणा के रूप में, हम आगे डब्ल्यू 1118 मक्खियों के दिमाग में न्यूरॉन्स महंगाई भत्ते की उपस्थिति की जांच की; एक जीनोटाइप है कि अक्सर ट्रांसजेनिक मक्खियों और कई ड्रोसोफिला अध्ययन में wildtype नियंत्रण पैदा करने के लिए माता-पिता की पंक्ति के रूप में इस्तेमाल किया।
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Protocol
1. समाधान ब्रेन विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला के लिए इस्तेमाल
- वयस्क कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव में दिमाग के लिए उड़ान भरने काटना (ACSF): 119 मिमी NaCl, 26.2 मिमी 3 NaHCO, 2.5 मिमी KCl, 1 मिमी नः 2 4 पीओ, 1.3 मिमी 2 MgCl, और 10 मिमी ग्लूकोज। उपयोग करने से पहले, गैस 5% सीओ 2/95 10 के लिए% ओ 2 के साथ aCSF - 15 मिनट और 2.5 मिमी 2 CaCl के साथ कील। एक 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से छान कर ACSF समाधान जीवाणुरहित।
नोट: स्टोर aCSF 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए। दिमाग उड़ना भी एक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान में विच्छेदित किया जा सकता है, हालांकि विच्छेदित दिमाग के अंतिम इमेजिंग गुणवत्ता पर दो विच्छेदन समाधान के प्रभाव की विस्तृत तुलना प्रदर्शन नहीं किया गया है। - 4% paraformaldehyde (पीएफए) लगानेवाला समाधान है, जो सामान्य रूप से aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है के रूप में 1x पीबीएस में तैयार प्रयोग करें।
CAUTION: पीएफए विषैले और संक्षारक है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। - दिमाग से और अंतिम चरण धोने के बाद पीएफए कुल्ला करने के लिए, विच्छेदित दिमाग की immunofluorescent धुंधला दौरान 1x पीबीएस का प्रयोग करें। 10x पीबीएस शेयर समाधान से 1x पीबीएस तैयार (1.37 एम NaCl, 27 मिमी KCl, 100 मिमी ना 2 HPO 4, और 18 मिमी 2 के.एच. पीओ 4)।
- विच्छेदित दिमाग की immunofluorescent धुंधला दौरान बाद के सभी धोने कदम के लिए 1x पीबीएस (1x पीबीटी) में 0.3% बीच 20 का प्रयोग करें।
2. वयस्क मक्खी प्रमुखों की microsurgical विच्छेदन
नोट: विच्छेदन प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र है।
- सीओ 2 के साथ वयस्क मक्खियों anesthetize। 5 s -, संदंश का प्रयोग एक मक्खी को लेने और संक्षेप में 3 के लिए 70% इथेनॉल में यह सूई से अपने छल्ली dewax। यह सुनिश्चित करता है जब aCSF या 1X पीबीएस विच्छेदन समाधान में डूब कि कोई बुलबुले मक्खी छल्ली का पालन करें।
- के तहत एकएक कोण है कि हाथ से अवरुद्ध नहीं किया जाएगा पर एक प्रकाश स्रोत के साथ विदारक माइक्रोस्कोप, मक्खी (1.2x बढ़ाई) की एक स्पष्ट दृष्टिकोण को प्राप्त करने के उद्देश्य लेंस की स्थापना की। पशु स्थिर है और उसके पेट के ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ के रूप में चित्रा 1 ए में दिखाया गया है के साथ ठंड विच्छेदन समाधान में विसर्जित करने के लिए फ्लाई nondominant हाथ से संदंश का प्रयोग करें।
- एक 160 पर संदंश रखें -, विच्छेदन प्लेट के लिए सम्मान के साथ 170 डिग्री के कोण जबकि मक्खी के पेट पर एक छोटा सा बल exerting (चित्रा 1 ए में तीर के रूप में सचित्र)। यह कदम मक्खी स्थिर है और यह 15 से पीछे की ओर सिर को स्थानांतरित करने के लिए मजबूर करेंगे - 25 डिग्री, जबकि ऊपर की ओर सूंड का विस्तार। इस प्रक्रिया में, छल्ली की एक नरम और पारदर्शी क्षेत्र, सूंड नीचे, स्पष्ट हो जाना चाहिए। बढ़ाई बढ़ाने के लिए और इस क्षेत्र पर फोकल हवाई जहाज़ को समायोजित।
नोट: भी कसकर संदंश पकड़ नहीं है, बल्कि सिर्फ पर्याप्त फर्म को स्थिर करने के लिएमक्खी। बहुत अधिक बल के अंदर अंगों समाधान में संबंध विच्छेद करने के लिए प्रेरित करेगा। - , विदारक संदंश ताकि उसके सुझावों के बंद हो जाती हैं, जो संदंश के सुझावों पर एक हल्के प्रतिरोधी बल उत्पन्न होगा प्रेस करने के लिए इतना है कि संदंश खुला वसंत जाएगा पकड़े जब हाथ से दबाव जारी की है प्रमुख हाथ का प्रयोग करें। , संदंश मक्खी धारण करने के लिए लंबरूप संदंश स्थिति के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
- पियर्स सूंड नीचे छल्ली के नरम और पारदर्शी क्षेत्र के माध्यम से विच्छेदन संदंश के बंद टिप्स, के रूप में चित्रा 1 बी में लाल तीर से यह साफ। यह बहुत गहरा है कि यह मस्तिष्क को छू लेती है संदंश घुसना करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। मस्तिष्क उचित दिखाई दे रहा हो जाना चाहिए। nondominant हाथ से मक्खी की एक स्थिर समझ बनाए रखें।
- जल्दी लेकिन तेजी से, अपने स्वयं के बल द्वारा विच्छेदन संदंश के सुझावों जारी है और दूर करने के लिए आंसू इस रिलीज से गति पर भरोसा करते हैं टीवह बहिःकंकाल उड़ सिर के आसपास। एक अक्षुण्ण मस्तिष्क उचित दृष्टिगोचर हो जाना चाहिए (तुरंत चित्रा 1C में नीचे forcep की नोक ऊपर सफेद ऊतक) जारी forcep टिप्स (चित्रा 1C में दिखाया गया जावक लाल तीर के रूप में सचित्र) की गति को मार्गदर्शन करने के लिए एक काल्पनिक रेखा का पालन करें। यह धीरे बहिःकंकाल हटाने और मस्तिष्क से मस्तिष्क से जुड़े आंख और श्वासनली की सबसे जाएगा। उचित समय और बल को खोलने के लिए बहिःकंकाल अन्वेषक के अनुभव पर निर्भर हो जाएगा लागू होता है।
नोट: यह विच्छेदन के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम है। यह प्राकृतिक उद्घाटन संदंश की गति से उत्पन्न बल पर भरोसा करने के लिए बहिःकंकाल दूर करने के लिए, जबकि उजागर मस्तिष्क छोड़ने शरीर के बाकी के साथ जुड़ा रहता महत्वपूर्ण है। - प्रमुख हाथ में संदंश का प्रयोग सावधानी से इस तरह की सांस की नली कि सफेद फाइबर संरचनाओं के रूप में प्रकट होता है के रूप में बचे हुए गौण ऊतकों, दूर करने के लिए remainiएनजी मस्तिष्क से जुड़ी। खींच या मस्तिष्क उचित क्षति के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
3. दिमाग की Immunofluorescent धुंधला
- 60 मिनट - 40 के लिए 4% पीएफए के लगभग 1 एमएल में उनके संबद्ध torsos के साथ विच्छेदित मस्तिष्क के नमूने को ठीक करें।
नोट: इस और बाद के चरणों के लिए, एक nutator पर ट्यूब या नमूनों के साथ प्लेटों रखने ठीक से समाधान में नमूने मिश्रण करने के लिए। - नीचे समाधान ऊपर pipetting और 3 बार से 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ कुल्ला। सावधान दिमाग दूर aspirate के लिए नहीं हो।
- 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीटी के साथ 5 बार धोएं। ऊष्मायन के दौरान nutator पर नमूने रखें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर / उचित कमजोर पड़ने हे पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते एन।
- अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी हटाने, और 1x पीबीटी साथ नमूने 5 बार धो लें। प्रत्येक धोने के बीच में 1x पीबीटी समाधान में 10 मिनट - 5 के लिए नमूने छोड़ दें। ऊष्मायन के दौरान nutator पर नमूने रखें।
- सेते धोयासुझाव कमजोर पड़ने और ऊष्मायन के समय के साथ उचित माध्यमिक एंटीबॉडी में नमूने हैं।
- नमूने प्रत्येक धोने के बीच एक 10 मिनट ऊष्मायन के साथ 1x पीबीटी साथ छह बार धोएं।
यह कदम नमूना से nonspecifically बाध्य माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। - 10,000 30 मिनट के लिए 1x पीबीटी समाधान में 1 मिलीग्राम / एमएल 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के कमजोर पड़ने: एक 1 में सेते हैं। DAPI एक डीएनए डाई कि डीएनए के एटी क्षेत्रों को बांधता है और मस्तिष्क के समग्र आकृति विज्ञान प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला।
- एक विच्छेदन डिश के लिए नमूने स्थानांतरण, और संदंश का उपयोग कर एक विच्छेदन डिश में शरीर से दिमाग अलग।
- धुंधला और कपड़े धोने के कदम के बाद, दोनों के बीच coverslips में दिमाग के माउंट और एक बढ़ते स्लाइड के शीर्ष पर coverslips जगह है। इस रास्ते में, मस्तिष्क के नमूने आसानी से फ़्लिप किया जा सकता है ताकि मस्तिष्क के दोनों पक्षों ने एक समान संकेत तीव्रता के साथ imaged किया जा सकता है।
- एक बढ़ते स्लाइड के शीर्ष पर एक 18 x 18 मिमी coverslip रखें। एक ब्लेड के साथ एक विंदुक टिप के उद्घाटन चौड़ा और 18 x 18 मिमी coverslip पर 1x पीबीएस समाधान में दिमाग के हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
- coverslip के बीच पर दिमाग की जगह, एक ठीक विंदुक टिप के साथ दिमाग के आसपास तरल निकालने, और फिर जोड़ने के एक और 20 - 40 विरोधी फीका बढ़ते मध्यम के μL (0.2% (w / v) एन-propyl 99.5 में gallate % एसीएस ग्रेड ग्लिसरॉल) दिमाग पर।
नोट: मध्यम जोड़ा बढ़ते राशि की जांच की दिमाग की संख्या पर निर्भर करता है।- जबकि बाहर की तरफ चिपचिपा बढ़ते मध्यम विस्थापित धीरे दिमाग से बाहर फैल गया। पहले एक तरफ से स्लाइड को कम से दिमाग के शीर्ष पर एक दूसरे 18 x 18 मिमी coverslip रखें जब तक इसके साथ संपर्क में आता हैबढ़ते पर्ची की सतह, और फिर धीरे-धीरे दूसरे पक्ष हवा के बुलबुले के साथ मस्तिष्क संपर्क को कम करने के लिए कम।
नोट: बढ़ते मध्यम की मात्रा के रूप में, दो coverslips के बीच में एक स्पेसर का उपयोग करने के लिए और दिमाग एक अंतरिक्ष दो coverslips अलग करने के लिए पर्याप्त प्रदान करना चाहिए की कोई जरूरत नहीं है।- स्लाइड बसने की अनुमति दें। अत्यधिक तरल है कि एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ निकल जाता है की तरफ से बाहर आने के लिए निकालें।
- परिवहन के दौरान बढ़ते स्लाइड गिरने से मुहिम शुरू दिमाग के साथ coverslips रोकने के लिए, टेप का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग बढ़ते स्लाइड के लिए coverslips देते हैं।
नोट: दिमाग के बीच स्लाइड तुरंत imaged किया जा सकता है या फ्लोरोसेंट संकेत के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित, स्लाइड सील करने के लिए किसी भी सीलेंट का उपयोग करने के लिए एक आवश्यकता के बिना में मुहिम शुरू की। सना हुआ दिमाग की लंबी अवधि के संरक्षण के लिए, दो पर्चियों के पक्ष w सील किया जा सकताith नेल पॉलिश और में संग्रहीत एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, हालांकि दाग दिमाग समय के साथ उनके संकेतों को खो सकता है। यह अनुशंसित नहीं है।
- सबसे पहले, मस्तिष्क उद्देश्य के करीब की ओर से छवि के अधिग्रहण, और फिर ध्यान coverslips फ्लिप नमूने बीच में बैठा है। यह कदम एक ही मस्तिष्क के दूसरे पक्ष की छवि को प्राप्त करने की सुविधा।
- एक ईमानदार यौगिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और छवि के लिए एक 20x उद्देश्य लेंस पूरे मस्तिष्क (चित्रा 2 में उदाहरण) और ऐसे बनती पूर्वकाल औसत दर्जे (पीएएम) क्लस्टर क्षेत्र में डीए न्यूरॉन्स के रूप में मस्तिष्क की छवि छोटे क्षेत्रों को एक 40x उद्देश्य का उपयोग करें (उदाहरण चित्रा 3 में)।
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Representative Results
जैसा कि ऊपर वर्णित चित्रा 1, वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन के लिए मुख्य प्रक्रियाओं को दिखाता है 2 आंकड़े और 3 3 दिन पुरानी गुम्मट के प्रतिनिधि छवियाँ हैं। (जीनोटाइप: डब्ल्यू 1118) वयस्क दिमाग है, जो tyrosine hydroxylase के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ costained थे उड़ (गु चित्रा 2 में लाल रंग में रंग और चित्रा 3) में सफेद, एक मार्कर सामान्यतः दा न्यूरॉन्स 11 लेबल करने के लिए, डीएनए डाई DAPI के अलावा सभी सेल नाभिक और elav प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी, सभी भेदभाव न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया मक्खी में, जो एक साथ मस्तिष्क के समग्र संरचना का पता चला (हरे रंग में रंग)।
एक 1 पर 200 कमजोर पड़ने और चूहे विरोधी elav एंटीबॉडी: आंकड़े 2 और 3 में प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, हम एक 1 पर खरगोश विरोधी वें एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया 100 कमजोर पड़ने, whiCH 5% सामान्य बकरी सीरम के साथ 1x पीबीटी में तैयार किए गए अविशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए। 1x पीबीटी में 500 कमजोर पड़ने: माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, हम एक 1 एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित बकरी-विरोधी चूहा एंटीबॉडी और AlexaFluor596 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया।
छवि को दिमाग, हम एक ईमानदार यौगिक फ्लोरोसेंट मस्तिष्क स्लाइस कि मस्तिष्क में ब्याज के क्षेत्र की पूरी गहराई को कवर के Z ढेर छवियों को प्राप्त करने के लिए एक Apotome समारोह के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया। उदाहरण के लिए, पूरे मस्तिष्क में डीए न्यूरॉन्स की सामान्य वितरण की एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए, हम करने के लिए अलग से छवि एक ही मस्तिष्क के पूर्वकाल और पीछे पक्षों (चित्रा 2) एक 20x उद्देश्य लेंस का इस्तेमाल किया। मस्तिष्क के प्रत्येक पक्ष की गहराई imaged कि सभी दा न्यूरॉन्स कवर कर सकते हैं के बारे में 20 है - 25 माइक्रोन कुल में। मज़बूती से कल्पना और पीएएम क्लस्टर क्षेत्र में डीए न्यूरॉन्स, जो छोटे सेल आकार और कमजोर वें si है योंgnals (देखें नीचे), हम एक 40x उद्देश्य लेंस का इस्तेमाल किया। 1 माइक्रोन प्रत्येक imaged टुकड़ा के बीच है, जो पीएएम क्लस्टर क्षेत्र (चित्रा 3 सी) के एक 3 डी पुनर्निर्माण में इष्टतम छवि गुणवत्ता सुनिश्चित की - इसके अतिरिक्त, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर से जेड श्रृंखला अधिग्रहण समारोह में, हम 0.5 के एक वर्ग की मोटाई का चयन किया। 10 माइक्रोन कुल में - मस्तिष्क कि सभी दा न्यूरॉन्स कवर में पीएएम क्लस्टर की मोटाई के बारे में 8 है। हमारे अनुभव में, Apotome समारोह में काफी इस तरह के एक पूरे मस्तिष्क या पीएएम क्लस्टर क्षेत्र के रूप में उच्च पृष्ठभूमि, साथ मोटी नमूने इमेजिंग में शोर संकेत को कम कर सकते हैं।
आंकड़े 2A-ई, एक मस्तिष्क का अग्र दृश्य दिखाने जबकि आंकड़े 2 एफ-जम्मू coverslips कि मस्तिष्क के नमूने, जिसके लिए मस्तिष्क के दोनों पक्षों के बीच संकेत तीव्रता का एक समान स्तर को प्रदर्शित पकड़ flipping के बाद ही मस्तिष्क के पीछे दृश्य दिखाने सभी तीन imaged चैनल। डीए Neurons, जल्दी पदनाम 11 निम्नलिखित विभिन्न समूहों में वर्गीकृत किया गया है, हालांकि हम यहां नाम बनती पोस्टीरियर औसत दर्जे (पीपीएम) का उपयोग PPM1, PPM2, और मस्तिष्क का अग्र पक्ष में PPM3 समूहों, और नाम बनती पीछे पार्श्व (पीपीएल शामिल करने के लिए के रूप में आंकड़े 2 ई और 2J। आंकड़े 2 ई और सफेद शो पूर्वकाल और उच्च बढ़ाई में एक ही मस्तिष्क के पीछे विचारों में 2J में चित्रित), मस्तिष्क के पीछे की ओर से PPL1 और PPL2 समूहों को कवर करने, महंगाई भत्ते के विभिन्न समूहों का खुलासा मस्तिष्क के दोनों किनारों पर न्यूरॉन्स। सफेद धराशायी लाइनों प्रमुख पाम और मस्तिष्क (चित्रा 2 ई) के साथ-साथ पीपीएल और मस्तिष्क (चित्रा 2J) के पीछे पक्ष में पीपीएम समूहों के पूर्वकाल पक्ष में बनती पूर्वकाल पार्श्व (पाल) समूहों पर प्रकाश डाला।
आंकड़े 3 ए और 3 बी एक डब्ल्यू 1118 मक्खियों में डीए समूहों में से कुछ के लिए मात्रा का ठहराव परिणामों का सारांश रहे हैं। हम दा न्यूरॉन्स टुकड़ा द्वारा टुकड़ा और 3 डी से भी छवियों, जो imprecise गिनती कम करना चाहिए खंगाला गिना। हम अनुमान है कि 3 दिन पुरानी डब्ल्यू 1118 मक्खियों समग्र मस्तिष्क प्रति पीपीएम क्लस्टर में 27 दा न्यूरॉन्स के एक औसत है, गोलार्द्ध प्रति पीपीएल क्लस्टर में 16 दा न्यूरॉन्स में गोलार्द्ध प्रति पाल क्लस्टर (चित्रा 3 ए) 5 दा न्यूरॉन्स, और पीएएम समूहों (चित्रा 3 बी) में से प्रत्येक में 97 दा न्यूरॉन्स। चित्रा -3 सी पाल और पीएएम समूहों में डीए न्यूरॉन्स, उच्च बढ़ाई इस क्षेत्र के सभी दा न्यूरॉन्स को कवर छवियों के स्लाइस से अनुमान के एक प्रतिनिधि 3D पुनर्निर्माण है। यह स्पष्ट है कि इस तरह के रूप में पाल अन्य समूहों की तुलना में, पीएएम क्लस्टर में डीए न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत छोटे सेल आकार और कमजोर वें धुंधला संकेत है।
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चित्रा 1:। वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क के लिए विच्छेदन प्रोटोकॉल की चित्रमय चित्रण (ए) मक्खियों ऊपर की तरफ उदर पक्ष के साथ तैनात है, और छाती गैर प्रमुख हाथ का उपयोग करके आयोजित कर रहे हैं। सेना धीरे मक्खी सिर और सूंड की मामूली जावक विस्तार के पिछड़े झुकने के लिए प्रेरित करने के लिए, नीचे सफेद पारदर्शी क्षेत्र को प्रकाश में लाने संदंश करने के लिए लागू किया गया था (लाल तीर)। (बी) के प्रमुख हाथ से संदंश सूंड नीचे पारदर्शी क्षेत्र में डाला जाता है, एक उथले चीरा (लाल तीर) बनाने। ध्यान दें कि संदंश हम का उपयोग बहुत अच्छी टिप समाप्त होता नहीं है। (सी) संदंश, के रूप में लाल तीर द्वारा संकेत अपने स्वयं के बल के माध्यम के अलावा आने की अनुमति दी जाती है। संदंश खोलने के द्वारा उत्पन्न गति, आंखों और बहिःकंकाल को हटा एक अपेक्षाकृत साफ ड्रोसोफिला मस्तिष्क को उजागर। श्वासनली की सबसे प्रक्रिया में हटा रहे हैं। (
चित्रा 2:। दा न्यूरॉन्स वयस्क पुरुष ड्रोसोफिला बी वर्षा (एक 20x उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत) में विरोधी tyrosine hydroxylase (ध) एंटीबॉडी के साथ पता चला यह आंकड़ा विच्छेदित वयस्क दिमाग की छवियों प्रतिनिधि भी शामिल है, के मस्तिष्क क्षेत्र के Z-खड़ी छवियों का उपयोग खंगाला यौगिक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ प्राप्त ब्याज। (एई) पूर्वकाल और (FJ) एक ही वयस्क मस्तिष्क के पीछे विचारों; (ए एंड एफ) सेल नाभिक DAPI धुंधला (सफेद) और (सी एंड एच) न्यूरॉन्स डब्ल्यू द्वारा imaged थेअरे अखिल neuronal मार्कर विरोधी elav एंटीबॉडी (हरा) द्वारा लेबल; (बी एंड जी) दा न्यूरॉन्स विरोधी वें एंटीबॉडी (लाल) द्वारा पता चला रहे हैं। (डी और मैं) DAPI, वें और elav उपचार के लिए छवियों के ओवरले। (ई एंड जे) सफेद में दिखाया गया डीए न्यूरॉन्स के साथ मस्तिष्क क्षेत्रों के बढ़े हुए देखने। धराशायी लाइनों मस्तिष्क और मस्तिष्क के पीछे में पीपीएल और पीपीएम समूहों के पूर्वकाल में पाल और पीएएम समूहों पर प्रकाश डाला। पैमाने पर पट्टी पैनल के सभी 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. दा न्यूरॉन्स की मात्रा डब्ल्यू 1118 मक्खियों नर वयस्क के दिमाग में (एक 40x उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत)। (ए और बी) दा n की मात्राडब्ल्यू 1118 मक्खियों के दिन 3 पुरुष eurons, विरोधी वें धुंधला द्वारा पता चला। डेटा गलमुच्छा बॉक्स न्यूनतम और outliers के रूप में अधिकतम मान दिखा भूखंडों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं; के रूप में अच्छी तरह से पहले (क्यू 1) के रूप में, दूसरा (Q2) और तीसरे (Q3) चतुर्थांश। दूसरी चतुर्थक मतलब मूल्य के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। (ए) पीपीएम {(एन = 28) न्यूनतम: 21, Q1: 24, औसत: 27, Q2: 30, मैक्स: 32}, पीपीएल {(एन = 26) मिन: 10, Q1: 12, औसत: 16, Q2: 18, मैक्स: 25} {और पाल (एन = 24), मिन: 2, Q1: 4, औसत: 5, Q2: 5, मैक्स: 10} समूहों; (बी) पीएएम क्लस्टर {(एन = 20) मिन: 86, Q1: 94, औसत: 97, Q2: 97, मैक्स: 99}। (सी) एक प्रतिनिधि प्रक्षेपण 3 डी में पुरुष डब्ल्यू 1118 मक्खियों के पाम और पाल समूहों दा न्यूरॉन्स दिखा छवि। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
मानव मस्तिष्क रोग, न्यूरोनल सर्किट, और उच्च मस्तिष्क कार्यों का अध्ययन करने के लिए वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क का प्रयोग करने में एक बढ़ती रुचि के साथ, यह पूरे माउंट विश्लेषण करती है, जो बड़े के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के लिए बरकरार मक्खी दिमाग प्राप्त करने के लिए सरल और त्वरित तरीकों को विकसित करने के लिए आवश्यक है पैमाने पर मस्तिष्क आधारित स्क्रीन। हमारे विधि एक सरल और आसान करने के लिए सीखना एक मक्खी सिर काटना करने के लिए दृष्टिकोण (अक्सर अनुभव के साथ कम से कम 10 सेकेंड में) अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान के साथ कि मोटे तौर पर जुड़े ऊतकों की मंजूरी दे दी है प्रदान करता है। विच्छेदित दिमाग अभी भी उड़ शरीर के बाकी से जुड़े होते हैं, वे आमतौर पर जल्दी नमूना ट्यूब के नीचे डूब और कपड़े धोने और धुंधला चरणों के दौरान समझते हैं और इकट्ठा करने के लिए आसान कर रहे हैं। यह काफी नमूना नुकसान है कि छोटे शारीरिक आकार के मस्तिष्क के नमूने प्रसंस्करण में एक प्रमुख मुद्दा हो सकता है कम करता है। यह समस्या बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है। मस्तिष्क आसानी से शरीर से अलग किया जा सकता हैधुंधला प्रक्रिया के पूरा होने के बाद बढ़ते से पहले।
विच्छेदन के दौरान, यह सही ढंग से मक्खी की स्थिति के लिए, जब उड़ सिर से बहिःकंकाल हटाने उचित कोण बनाए रखने के लिए, और धीरे हर कदम प्रदर्शन में उचित बल लागू महत्वपूर्ण है। यह सिफारिश की है कि संदंश आदेश मक्खी (चित्रा 1 बी) के कत्ल को रोकने के लिए एक-दूसरे के लंबवत रखा जाता है। चित्रा 2 में प्रतिनिधि छवियों में दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार दिमाग संतोषजनक परिणाम का उत्पादन। इस उदाहरण में, हम वयस्क दिमाग के पीएएम क्लस्टर में डीए न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया। औसत में एक ड्रोसोफिला मस्तिष्क protocerebrum प्रति के बारे में 280 दा न्यूरॉन्स, जो विशिष्ट प्रक्षेपण पैटर्न और कार्यात्मक उत्पादन 11, 12 के साथ मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में अलग-अलग समूहों में वितरित कर रहे हैं के कुल की है। वयस्क ड्रोसोफिला दिमाग, includi में डीए न्यूरॉन्स का पिछला लक्षण वर्णन, पीपीएल, और पीपीएम समूहों है कि अपेक्षाकृत बड़े सेल आकार और वें, मानक लेबलिंग दा न्यूरॉन्स 13-18 के लिए इस्तेमाल किया निर्माता के प्रमुख अभिव्यक्ति एनजी ऐसे Parkin म्यूटेंट में के रूप में मानव रोग जीन के मॉडल के लिए उड़ान भरने में काफी हद तक पर पाल ध्यान केंद्रित किया है।
हालांकि, मक्खी के मस्तिष्क में डीए न्यूरॉन्स के बहुमत क्लस्टर प्रति के बारे में 100 डीए न्यूरॉन्स के साथ, पीएएम समूहों में पाए जाते हैं। अन्य डीए समूहों में कोशिकाओं की तुलना में, पीएएम क्लस्टर में डीए न्यूरॉन्स सामान्य रूप से tyrosine hydroxylase अभिव्यक्ति और छोटे सेल आकार के एक छोटे स्तर दिखा। हमारे विच्छेदन और धुंधला प्रोटोकॉल से तैयार नमूनों में, पीएएम क्लस्टर में डीए न्यूरॉन्स स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है और एक यौगिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग उच्च गुणवत्ता में imaged, confocal इमेजिंग के बिना। इसकी बड़ी संख्या को देखते हुए, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के पीएएम क्लस्टर में डीए न्यूरॉन्स की मात्रा का ठहराव अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों का उत्पादन हो सकता है। हमारा सुझाव है कि पीएएम clus में डीए न्यूरॉन्सआतंकवाद डीए जीव विज्ञान का अध्ययन और ऐसे पार्किंसंस रोग के रूप में महंगाई भत्ते से संबंधित विकारों, मॉडलिंग के लिए एक और उपयोगी प्रणाली प्रतिनिधित्व करते हैं।
हमारे अनुभव में, माइक्रोस्कोप हम इस्तेमाल काफी पृष्ठभूमि संकेत कम कर सकते हैं, विशेष रूप से इस तरह पूरे वयस्क मक्खी के मस्तिष्क के रूप में महत्वपूर्ण मोटाई के साथ नमूने, जांच में से Apotome समारोह। हालांकि confocal खुर्दबीन अधिक विवरण, उच्च वृद्धि और बेहतर गुणवत्ता के साथ छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, यह अक्सर समय लेने वाली और महंगा है। इस तरह के वयस्क दिमाग स्पष्ट है कि 3 डी पुनर्निर्माण और deconvolution विश्लेषण के लिए Z ढेर खंड की श्रृंखला की आवश्यकता के रूप में मोटी नमूनों की एक बड़ी संख्या में इमेजिंग के लिए विशेष रूप से सच है। इस परिप्रेक्ष्य में, Apotome समारोह में एक तेजी से और लागत प्रभावी पर्याप्त गुणवत्ता की छवियों का उत्पादन करने के लिए वैकल्पिक का प्रतिनिधित्व करता है (उदाहरण के लिए, आंकड़े 2 और 3 में चित्र)।
मस्तिष्क के अध्ययन में, यह दोनों एसआई पर छवि कोशिकाओं को अक्सर आवश्यक हैएक ही मस्तिष्क की des। उदाहरण के लिए, डीए न्यूरॉन्स मस्तिष्क के दोनों पूर्वकाल और कूल्हों पक्षों से समूहों में मौजूद हैं। हालांकि, इसकी मोटाई के कारण, के बाद एक मस्तिष्क स्लाइड पर मुहिम शुरू की है, प्रकाश स्रोत से दूर पक्ष (यानी की ओर बढ़ते सामना करना पड़) आम तौर पर कमजोर संकेतों और कम स्पष्ट छवियों को जन्म जब imaged नियमित यौगिक और confocal का उपयोग कर देता है सूक्ष्मदर्शी। दो कवर स्लाइड्स के बीच में नमूने बढ़ते द्वारा, यह मुहिम शुरू की स्लाइड और इसी तरह के संकेत तीव्रता के साथ ही मस्तिष्क के दोनों पक्षों के बाद इमेजिंग पर नमूने के सुविधाजनक flipping अनुमति देता है। चित्रा 2 के दोनों पक्षों से इमेजिंग दा न्यूरॉन्स का एक उदाहरण है इस विधि है, जो अपेक्षाकृत तुलनीय सिगनल तीव्रता और इमेजिंग गुणवत्ता दिखाया का उपयोग कर दिमाग उड़।
वयस्क मक्खी दिमाग विदारक के लिए कई आसान का पालन करने के दृष्टिकोण अच्छी तरह से किया गया है 9, 10 में वर्णित है। हमारा दृष्टिकोण एक वैकल्पिक तरीका है कि फर कर सकते हैं प्रदान करता हैवहाँ वयस्क का विच्छेदन और धुंधला प्रक्रियाओं दिमाग उड़ सरल। साथ अधिक बड़े पैमाने पर अध्ययन पूरे दिमाग न्यूरोनल circuitry के साथ-साथ अपनी आणविक और सेलुलर घटक बाहर नक्शा करने के लिए आयोजित किया जा रहा है, यह निकट है कि स्वचालित विच्छेदन और इमेजिंग दृष्टिकोण वयस्क ड्रोसोफिला दिमाग उच्च throughput आनुवंशिक और दवा स्क्रीन का एहसास करने के लिए विकसित किया जा सकता है इस शास्त्रीय आनुवंशिक मॉडल में vivo में।
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Acknowledgments
हम इस परियोजना के लिए उनकी अपार समर्थन के लिए श्री Enes Mehmet, सुश्री Kiara Andrade, सुश्री पिलर रोड्रिगेज, क्रिस क्वोक, और सुश्री Danna Ghafir स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
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