Summary
성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간의 뇌 퇴행성 질환 모델 성인 뇌에서 신경 회로들을 매핑하고, 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초 공부 초파리 사용에 관심이 증대되고있다. 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 전체 마운트 준비는 전체 뇌 기반 연구를위한 중요하지만, 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 이후의 처리 단계를 용이하게하기 위해 본체의 나머지에 부착 된 그대로의 뇌를 유지하면서,이 프로토콜은, 이하 10 초에서 성인 플라이 머리 쉬운-내용 원스텝 절개 방법을 설명한다. 이 절차는 일반적으로 나중에 묘화 공정을 방해 할 수있는 뇌와 관련된 눈 기관 조직의 대부분을 제거하는 것을 돕고, 또한 해부 포셉의 품질에 덜 요구 놓는다. 또한, 우리는 (B)의 양쪽을 이미징 중요 커버 슬립에 장착 뇌 샘플의 편리 반전을 가능하게하는 간단한 방법을 설명비슷한 신호 강도 및 품질 비. 프로토콜의 예로서, 우리는 WT 성인 뇌에서 도파민 (DA) 신경 세포의 분석을 제시한다 (1,118와트) 날아간다. 절개 방법의 높은 효능은 초파리에서 대규모 성인 뇌 기반 연구에 특히 유용합니다.
Introduction
일반적으로 과일 파리로 알려진 모델 생물 초파리는 긴 우아한 유전 도구, 짧은 생식 번 평가하고, 높은 분자 및 세포 경로를 보존하고있다. 초파리 성공적 기본 신호 경로 다세포 유기체의 패터닝 메커니즘뿐만 아니라, 신경 발달 기능의 기초가되는 메커니즘 질병 1,2- 해부하는데 이용되어왔다. 셀 라벨 및 이미징 기술의 최근 발전과 함께, 초파리의 뇌는 신경 회로의 미세 매핑 및 학습과 기억, 그리고 활동 일주기 1,3와 같은 높은 뇌 기능의 분자 및 세포 기초를 해부 특히 강력한되고있다 4,5,6,7,8.
초파리 시스템의 하나의 특별한 장점은 일정한 화합물 또는 공 초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 전체 뇌 실장 준비 및 시험 수는 상대적으로 작은 크기이다. 티S 기능 따라서 전체 내에서 연구 된 환자의 전체적인 관점 그 정확한 형상을 모두 제공하는 전체 뇌 조직의 맥락에서, 세포 및 세포 내 수준의 신경 회로의 상세한 해부학 및 기능 분석 또는 단일 뉴런을 활성화 뇌. 그러나, 뇌의 미니어처 크기보다는 주어진 또한 효율적 성인 플라이에 보호 외골격 헤드 케이스로부터 온전한 뇌 조직 해부의 기술적 과제를 제시한다. 다양한 효과적이고 상대적으로 단순한 박리 방법은 일반적주의 포함하고 단계적 헤드 케이스를 제거하고 눈을 포함한 관련 조직, 기관, 지방을 9,10. 이러한 미세 수술 절개 방법 적절한 뇌로부터의 상세히 설명되었지만 자주 쉽게 손상 될 수있는 미세 잘 정렬 된 팁 집게에 의존 해부 포셉의 품질에 다소 엄격한 요구를 배치합니다. 또한, 같은 해부 뇌는 종종 해부하다신체의 나머지 에드 뇌 쉽게 그들의 작은 크기 및 프로세싱 버퍼 투명성의 연속 염색 및 세척 과정 중에 손실 될 수있다. 여기, 우리는 몸통에 부착 된 해부 두뇌를 유지 성인의 뇌에 대한 비교적 간단하고 배우기 쉬운 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다. 해부 과정은 종종 쉽게 눈과기도로 뇌 관련 조직의 대부분을 멀리 지우고 좋은 품질의 해부 포셉에 대한 수요를 감소시킨다.
형광 화합물 현미경 또는 공 초점 현미경으로 뇌를 영상화 할 때 또한, 멀리 형광 광원으로부터 뇌의 측면은 종종 인해 전체 마운트 뇌의 두께로 약한 신호와 적은 선명한 이미지를 생성합니다. 여기서는 유사한 신호 intensi와 뇌의 양측의 편리한 촬상있게 뇌 샘플 쉽게 반전을 허용하는 간단한 장착 방법을 서술타이 및 품질.
개념 증명 성인의 뇌를 연구하는이 방법의 응용 프로그램에 대한, 우리는 또한 1118 파리 w의 뇌에서 DA 뉴런의 존재를 조사; 종종 유전자 파리 많은 초파리 연구 야생형 제어를 생성하기위한 부모 선으로 사용되는 유전자형.
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Protocol
뇌 해부 및 면역 형광 염색에 사용 1. 솔루션
- 성인 인공 뇌척수액에서 머리를 비행 해부 (ACSF) : 119 mM의 NaCl을, 26.2 밀리미터의 NaHCO3, 2.5 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 NaH 2 PO 4, 1.3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 포도당. 사용하기 전에, 가스 5 % CO 구십오분의이 10 %의 O 2와 ACSF - 2.5 mM의 CaCl2를 15 분, 스파이크. 0.22 ㎛의 멤브레인 필터로 여과하여 용액 ACSF 멸균.
참고 : 저장 ACSF를 4 ° C에서 세균 오염을 방지 할 수 있습니다. 해부 뇌의 최종 이미지 품질에 두 박리 용액의 효과의 상세한 비교가 수행되지 않은 비록 플라이 뇌 또한, 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 절개 될 수있다. - 일반적으로 분주 및 -20 ° C에 저장되어있는 정착액 솔루션으로 1X PBS에서 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용합니다.
CautioN : PFA는 독성과 부식성 및 취급시주의해야한다. - 해부 뇌의 면역 염색하는 동안 뇌에서 마지막 세척 단계 후 PFA를 씻어 1X PBS를 사용합니다. 10 배 PBS 원액에서 1X PBS를 준비 (1.37 M의 NaCl, 27 mM의 KCl을, 100 밀리미터 나 2 HPO 4, 18 mM의 KH 2 PO 4).
- 해부 뇌의 면역 염색 동안 모든 후속 세척 단계 1X PBS (1X PBT)에서 0.3 % 트윈 20을 사용합니다.
성인 플라이 헤드 2. 미세 수술 해부
주 : 박리 과정이도 1에 도시되어있다.
- CO 2와 함께 성인 파리를 마취. 5 초 - 집게를 사용하여 비행을 선택하고 짧게하면 3 70 % 에탄올에 침지하여 표피를 왁스 제거. 이 ACSF 또는 1X PBS의 해부 용액에 침지 할 때 기포가 비행 표피에 부착 없음을 보장합니다.
- 아래손에 의해 차단되지 않습니다 각도에서 광원 현미경을 해부, 파리 (1.2X 배율)의 명확한 뷰를 달성하기 위해 대물 렌즈를 설정합니다. 동물을 고정하고도 1a에 도시 된 바와 같이, 그것의 복부가 위쪽으로 향하도록 추위 해부 솔루션으로 파리를 체험하기 위해 쓰지 않는 손으로 집게를 사용합니다.
- 160에서 집게를 유지 - 파리의 복부에 작은 힘을 발휘하면서, 해부 접시에 대해 170 ° 각도 (그림 1A에서 화살표로 도시). 이 단계는 플라이 및 고정 (15)에 의해 후방으로 헤드를 이동하도록 강제 - 25 ° 위쪽 코를 확장하는 동안. 이 과정에서, 표피의 소프트 및 반투명 영역은 코 아래에 명백해질 것이다. 배율을 증가시키고이 지역에 초점면을 조정합니다.
참고 : 너무 단단히 집게를 잡지 마십시오,하지만 충분히 아니라 그냥 회사 안정비행. 너무 많은 힘은 내부 장기 용액에 파열의 원인이됩니다. - 유지 손에서 압력이 해제 될 때 집게가 열려 봄 않도록, 포셉의 조언에 가벼운 저항하는 힘을 생성합니다 그것의 끝이 폐쇄되도록 해부 집게를 눌러 지배적 인 손을 사용합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 비행을 들고 집게에 수직으로 집게를 놓습니다.
- 피어스 그림 1B에서 빨간색 화살표로 도시 된 바와 같이 코 아래에있는 표피의 부드럽고 반투명 영역을 통해 해부 포셉의 폐쇄 팁. 너무 깊이는 뇌에 접촉하는 집게를 관통하지 않는 것이 중요합니다. 적절한 뇌는 볼 수있게한다. 비 우세 손으로 파리의 안정적인 권력을 유지한다.
- 신속하지만 꾸준히, t 자신의 힘에 의해 해부 포셉의 팁을 해제하고 멀리 눈물이 릴리스에서 모멘텀에 의존그는 외골격 플라이 머리 주변. 볼이되어야 적절한 손상되지 않은 뇌 (즉시 그림 1C에서 바닥 forcep의 끝 위의 흰색 조직) (그림 1C에 도시 바깥쪽으로 빨간색 화살표로 도시)를 출시 forcep 팁의 모멘텀을 안내하는 가상 선을 따르십시오. 이 부드럽게 외골격을 제거하고 뇌에서 뇌 관련 눈과 기관의 가장 것입니다. 적절한 타이밍과 힘은 외골격은 연구자의 경험에 의존 할 것이다 열 적용했다.
참고 :이 해부하는 동안 가장 중요한 단계입니다. 이는 노출 된 뇌 떠나는 것은 신체의 나머지에 부착 된 상태로 남아 외골격을 제거 개구 포셉 운동량으로부터 발생하는 자연의 힘에 의존하는 것이 중요하다. - 조심스럽게 백색 섬유 구조로 표시되는 기관으로 남은 액세서리 조직을 제거하는 지배적 인 손에 집게를 사용 remainiNG는 뇌에 연결합니다. 당기거나 적절한 뇌 손상되지 않도록주의하십시오.
뇌의 3 면역 형광 염색법
- 60 분 - 40 4 % PFA의 약 1 mL에 관련 흉상과 함께 해부 뇌 샘플을 수정합니다.
참고 :이 이후의 단계는 제대로 용액에 시료를 혼합하는 nutator에 샘플 튜브 또는 플레이트를 유지합니다. - 아래로 3 번 용액을 위로 피펫 팅에 의해 1X PBS 1 mL로 씻어. 떨어져 머리를 대기음하지 않도록주의하십시오.
- 5 분마다 1 배 PBT와 5 회 반복한다. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오.
- 4 ° C에서 / 적절한 희석 O에서 일차 항체와 N을 품어.
- 다음 날, 차 항체를 제거하고 1X PBT와 샘플을 5 회 반복한다. 각 세척 사이에 1 배 PBT 용액에 10 분 - 5 샘플을 남겨주세요. 배양하는 동안 nutator에 샘플을 보관하십시오.
- 세척을 품어제안 된 희석 및 배양 시간에 적절한 보조 항체의 샘플.
- 각 세척 사이에 10 분 배양과 1X PBT와 샘플을 여섯 번 씻으십시오.
이 단계는 샘플에서 비특이적 결합 이차 항체의 제거를 위해 중요하다. - 30 분 동안 1X PBT 용액 1 ㎎ / ㎖ 4 ', 6'- diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 10,000 희석 1 부화. DAPI는 DNA의 AT 영역에 결합하고, 뇌의 전반적인 형태를 나타 내기 위해 사용될 수있는 DNA 염료이다.
- 1X PBS로 3 회 씻어.
- 전송 해부 접시에 샘플, 그리고 집게를 사용하여 절개 접시에 시체에서 머리를 분리합니다.
- 염색 및 세척 단계 후, 둘 사이의 커버 슬립의 두뇌를 탑재하고 장착 슬라이드의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 뇌의 양쪽이 동일한 신호 강도로 이미징 될 수 있도록 이러한 방법으로, 뇌 샘플 용이 대칭 될 수있다.
- 장착 슬라이드의 상단에 18 X 18mm의 coverslip에 배치합니다. 블레이드와 피펫 팁의 개구를 넓히고 18 X 18mm의 커버 슬립 상 1X PBS 용액에 뇌를 전송하도록 사용.
- 안티 - 페이드 장착 매체의 40 μL (0.2 % (99.5에서 w / v)의 n- 프로필 갈 레이트 - 다른 (20), 커버 슬립의 중간에 두뇌를 놓습니다 미세 피펫 팁과 뇌 주변의 액체를 제거하고 추가 뇌 % 이상 ACS 등급 글리세롤).
주 : 배지 첨가 실장 양 검사 뇌의 수에 의존한다.- 바깥쪽으로 점성 장착 매체 변위 동안 부드럽게 머리를 확산. 그것은에 닿을 때까지 제 일측에서 상기 슬라이드를 하강시킴으로써 뇌의 상단에 제 18 X 18mm의 커버 슬립을 배치장착 미끄러짐 표면은 천천히 기포와 뇌의 접촉을 최소화하기 위해 다른 쪽을 낮추는.
주 : 장착 매체의 볼륨으로 두 커버 슬립 사이에 스페이서를 사용하고 뇌 두 커버 슬립을 분리하기에 충분한 공간을 제공해야 할 필요가 없다.- 슬라이드가 정착하도록 허용합니다. 실험실 조직과 슬립의 측면에서 나오는 과도한 액체를 제거합니다.
- 운송시 장착 슬라이드를 탈락 탑재 된 두뇌와 커버 슬립을 방지하기 위해 장착 슬라이드로 된 커버를 부착하는 테이프의 작은 조각을 사용합니다.
주 : 뇌에 장착 된 슬라이드를 즉시 묘화 또는 슬라이드를 밀봉하는 밀봉 제를 사용할 필요없이, 형광 신호의 현저한 손실없이 1 주 4 ℃에서 보존 될 수 사이. 스테인드 뇌 장기 보존 두 슬립의 측 w를 밀봉 할 수있다i 번째 네일 폴란드어 및 저장 -20 ° C의 냉동고, 스테인드 뇌가 시간이 지남에 따라 자신의 신호를 잃을 수도 있지만. 이 권장되지 않습니다.
- 우선, 목적에 가까운 뇌 측으로부터 화상을 취득하고 신중 중간에 끼워진 샘플을 갖도록 플립 커버 슬립. 이 단계는 같은 뇌의 다른 쪽의 화상을 취득 용이하게한다.
- (예를 똑바로 화합물 형광 현미경 및 이미지에 20 배 대물 렌즈 전체 뇌 (그림 2의 예) 및 한 쌍의 전방 내측 (PAM) 클러스터 지역에서 DA 뉴런과 뇌의 이미지 작은 지역에 40X 목표를 사용하여 그림 3).
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Representative Results
상술 한 바와 같이 그림 1, 성인 뇌 해부를위한 주요 절차를 보여 2 및도 3은 3 일짜리 WT의 대표 이미지입니다. (유전자형가 : 1,118 원) 성인 티로신 하이드 록에 대한 항체와 costained 된 머리를 비행 (TH를 그림 2에서 빨간색으로 색깔과 그림 3) 흰색, 마커는 일반적으로 모든 분화 된 신경 세포의 모든 세포 핵 및 Elav 단백질에 대한 항체, 마커에 라벨을 붙이기 위해 DNA 염색 DAPI 이외에, DA 뉴런 (11) 레이블을 사용 파리에서 함께 뇌의 전체 구조를 공개하는 (녹색 색).
1 200 희석 및 랫트 항 - Elav 항체 :도 2 및도 3에 일차 항체를 들어, 우리는 (1)에서 토끼 항 TH 항체를 사용하여 100 희석, WHICH는 비특이적 결합을 차단하는, 5 % 정상 염소 혈청, 1X PBT 제조 하였다. 1X PBT 500 희석 이차 항체, 우리는 1 알렉사 형석 488 결합 염소 - 항 - 생쥐 항체 AlexaFluor596 결합 염소 항 - 토끼 항체를 사용 하였다.
뇌 영상에, 우리는 뇌의 관심 영역의 전체 깊이를 커버 뇌 조각 Z 스택 이미지를 획득하는 함수 apotome 갖춘 직립 화합물을 형광 현미경을 사용 하였다. 예를 들어, 전체 뇌 DA 신경의 일반적인 분포의 명확한 시각화를 얻기 위해 우리는 별도로 화상 같은 뇌의 전방 및 후방 측면 (도 2) 20 배 대물 렌즈를 사용했다. 25 μm의 총 - 뇌의 각면의 깊이는 모든 DA 신경을 포함 할 수있는 약 20 군데. 확실하게 작은 셀 크기와 약한 TH의시를 가지고있는 PAM 클러스터 지역에서 DA 뉴런을 시각화하고 정량화하기gnals (아래 참조), 우리는 40X 대물 렌즈를 사용했다. PAM에 클러스터 영역 (도 3C)의 3D 재구성 최적의 이미지 품질을 확보 각 묘화 슬라이스와 1 ㎛, - 또한, 상용 소프트웨어에서 Z 계 수집 기능에서, 우리는 0.5의 단면 두께를 선택했다. 10 μm의 총 - 모든 DA 신경 커버 뇌 PAM 클러스터의 두께는 약 8이다. 우리의 경험에서, apotome 기능이 크게 이러한 뇌 전체 또는 PAM 클러스터 영역으로 높은 배경, 두꺼운 샘플을 이미징의 노이즈 신호를 줄일 수 있습니다.
도 2F-J가 뇌의 양쪽 사이에서 신호 강도의 비슷한 수준을 표시 뇌 샘플을 보유하고있는 커버 슬립을 틀지 후 동일한 뇌의 후방보기를 표시하는 반면,도 2A-E는 뇌의 앞쪽보기를 표시 모든 세 군데 채널. 검찰의 neur기능은 초기 지정 11 다음 다른 클러스터로 그룹화 된 우리는 PPM1, 최고 ppm2, 뇌의 전방 측 PPM3 클러스터 및 후방 측면을 짝 이름 (PPL을 포함하는 후방 내측 (PPM) 쌍으로 이름을 사용하여 여기에 있지만, 흰색 쇼 전방 및 고배율에서 같은 뇌의 후방 뷰도 2E 및 2J.도 2E 및 2J에 도시 된 바와 같이) DA의 다른 클러스터를 공개, 뇌의 후방 측으로부터 PPL1 및 PPL2 클러스터를 커버하는 뇌의 양쪽 뉴런. 백색 라인은 뇌 (도 2e)뿐만 아니라 PPL 뇌 (도 2J)의 후방 측의 PPM 클러스터의 전방 측에 띄는 PAM 페어링 전방 측면 (PAL) 클러스터를 강조 점선.
도 3a 및도 3b A를 w 1118 파리에서 DA 클러스터의 일부에 대한 정량 결과의 요약 재. 우리는 DA 뉴런은 조각으로 슬라이스 또한 3D에서 부정확 한 계산을 최소화해야 이미지를 재구성었다. 우리는 3 일 된 w 1118 파리는 전체 뇌 당 PPM 클러스터에서 27 DA 뉴런의 평균을 것으로 추정, 반구 당 PPL 클러스터의 16 DA 뉴런, 반구 당 PAL 클러스터 (그림 3A)에서 5 DA 뉴런, 그리고 PAM 클러스터 (그림 3B) 각각 97 DA 뉴런. 그림 3C는이 지역의 모든 DA 뉴런을 포함 고배율 이미지의 조각에서 투영 된 PAL 및 PAM 클러스터에서 DA 뉴런의 대표 3D 재구성이다. 이는 예컨대 PAL 다른 클러스터에 비해 PAM 클러스터 DA 신경 비교적 작은 셀 크기 및 약한 TH 염색 신호를 가지고 있다는 것이 명백하다.
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그림 1 :. 성인 초파리 뇌의 해부 프로토콜의 그래픽 그림 (A) 파리는 위쪽 복부 측면에 배치하고, 비 지배적 인 손을 사용하여 흉부에 의해 유지된다. 힘은 부드럽게 아래 흰색 투명 영역을 노출, 플라이 헤드와 코의 약간 바깥쪽으로 확장의 역 경사를 유도하기 위해 집게에 (빨간색 화살표)을 적용 하였다. 지배적 인 손에서 (B) 집게는 얕은 절개 (빨간색 화살표)를 창조하는 코 아래에 투명 영역에 삽입됩니다. 우리가 사용하는 집게는 아주 좋은 팁 끝을 필요는 없습니다. 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이 (C) 집게는, 자신의 힘을 통해 떨어져 올 수 있습니다. 포셉을 열어 생성 된 모멘텀이 상대적으로 깨끗한 초파리 뇌를 노출, 눈과 외골격을 제거합니다. 기관의 대부분은 그 과정에서 제거된다. (
그림 2 :. DA 뉴런의 (a 20X 목적으로 취득) 성인 남성 초파리 B의 비 안티 - 티로신 하이드 록 (TH) 항체와 함께 공개이 그림은 해부 성인 뇌의 대표 이미지를 포함,의 뇌 영역의 Z - 스택 이미지를 사용하여 재구성 화합물 형광 현미경으로 얻은 관심. (AE) 전방 및 (FJ) 같은 성인 뇌의 후방보기; (A & F) 세포 핵은 DAPI 염색 (흰색)와 w (C & H) 신경 세포에 의해 촬영되었다감수 팬 신경 마커 방지 Elav 항체 (녹색)에 의해 표시; (B & G) DA 뉴런은 안티 TH 항체 (적색)에 의해 공개됩니다. (D & I) DAPI, TH 및 Elav 처리를위한 이미지 오버레이. (E & J) 흰색에 도시 DA 뉴런과 뇌 영역의 확대도. 점선은 뇌의 뒤쪽에서 뇌와 PPL 및 PPM 클러스터의 전방에서 PAL 및 PAM 클러스터를 강조 표시합니다. 스케일 바는 모든 패널에 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(A 40X 목적으로 취득) 1118 파리 w 남성 성인의 두뇌 그림 3. 정량 DA 뉴런의. (A & B) DA (n)의 정량안티 TH 염색에 의해 밝혀 1118 파리 w 3 일 남성의 eurons. 데이터 아웃 라이어로서 최소 및 최대 값을 나타내는 박스 휘스커 플롯에 의해 표현된다; 뿐만 아니라 첫 번째 (Q1)로, 두 번째 (Q2)와 세 번째 (Q3)는 분위수. 제 분위수는 평균값으로 표현된다. (A) PPM {(N = 28) 최소 : 21 Q1 : 24, 평균 : 27, Q2 : 30, 최대 : 32}, PPL {(N = 26) 최소 : 10, Q1 : 12, 평균 : 16 Q2 : 18, 최대 : 25}, 및 PAL {(N = 24), 최소 : 2, Q1 : 4, 평균 : 5, Q2 : 5, 최대 : 10} 클러스터; (B) PAM 클러스터 {(N = 20) 최소 : 86, Q1 : 94, 평균 : 97, Q2 : 97, 최대 : 99}. 3 일에 1118 파리 w 남성의 PAM 및 PAL 클러스터에서 DA 뉴런을 보여주는 (C) 대표 투사 이미지입니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간의 뇌 질환, 신경 회로, 및 높은 뇌 기능을 연구하기 위해 성인 초파리 뇌 사용에 대한 관심이 증가, 대형 - 특히 중요 전체 마운트 분석을위한 완전한 비행 뇌를 얻었다 간단하고 빠른 방법을 개발하는 것이 필요하다 뇌 기반의 화면을 확장 할 수 있습니다. 우리의 방법은 간단하고 배우기 쉬운 플라이 머리를 해부하는 방법을 (자주 경험 미만 10 초에) 잘 보존 된 형태와 크게 관련 조직의 해제가 제공합니다. 해부 뇌 여전히 플라이 본체의 나머지에 부착 될 때, 그들은 일반적으로 신속하게 샘플 튜브의 바닥에 가라 세탁 염색 단계에서 인식하고 수집하기 쉽다. 이것은 상당히 작은 물리적 크기의 뇌 샘플을 처리에서 눈에 띄는 문제가 될 수있는 샘플 손실을 최소화 할 수 있습니다. 이 문제는 대규모 연구에 특히 중요 할 수있다. 뇌 용이 본체로부터 분리 될 수있다장착 전에 염색 공정의 종료 후.
절개 동안, 올바르게 플라이를 위치 즉시 헤드로부터 외골격을 제거 할 때 적절한 각도를 유지하고, 부드럽게 각 단계를 수행하기에 적절한 힘을 발휘하는 것이 중요하다. 집게는 플라이 (도 1b)의 잘린 것을 방지하기 위해 서로에 대해 수직으로 배치되는 것이된다. 도 2에 대표적인 사진에 도시 된 바와 같이,이 프로토콜을 이용하여 제조 된 뇌는 만족스러운 결과를 생성한다. 이 예에서 우리는 성인 뇌의 PAM 클러스터의 DA 뉴런에 초점을 맞추었다. 평균에서 초파리 뇌는 특유의 투영 패턴과 기능 출력 11, 12와 뇌의 다른 지역에서 서로 다른 클러스터에 배포됩니다 protocerebrum 당 약 280 DA 뉴런의 객실을 선택할 수 있습니다. 성인 초파리 뇌, includi을에서 DA 뉴런의 이전 특성을NG는 파킨 돌연변이과 인간 질병 유전자의 모델을 비행, 크게 PAL에 초점을 맞추고있다, 비교적 큰 셀 크기와 TH, 라벨 DA 뉴런 13-18에 사용되는 표준 메이커의 눈에 띄는 표현이 PPL 및 PPM 클러스터.
그러나, 플라이 뇌 DA 신경 세포의 대부분이 클러스터 당 약 100 DA 신경 더불어 PAM 클러스터에서 발견된다. 다른 DA 클러스터의 셀에 비해, PAM 클러스터 DA 신경 일반적 티로신 수산화 효소 발현 및 작은 셀 크기의 더 작은 레벨을 나타낸다. 공 촛점 이미지없이 우리 해부 및 염색 프로토콜로부터 제조 된 샘플에서, PAM 클러스터의 DA 신경 명확하게 가시화 될 수 있고, 화합물을 형광 현미경을 사용하여 고품질의 이미지화. 그 많은 감안할 때, 서로 다른 유전 적 배경의 PAM 클러스터의 DA 뉴런의 정량은보다 안정적이고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 제안 그 PAM의 CLUS에서 DA 뉴런터가 DA 생물학을 공부하고 파킨슨 병과 같은 DA-관련 질환을 모델링하기위한 또 다른 유용한 시스템을 나타냅니다.
우리의 경험에서, 우리는 크게 특히 전체 성인 플라이 뇌 상당한 두께의 샘플을 검사에서 배경 신호를 줄일 수 있습니다 사용되는 현미경에서 apotome 기능. 공 초점 레이저 주사 현미경 자세히 높은 배율 나은 품질 이미지를 생산할 수 있지만, 종종 시간 소모적이고 비용이 많이 든다. 이는 분명 3D 재구성 및 컨벌루션 분석 Z 스택 부의 시리즈 요구 성인 뇌으로 두꺼운 많은 샘플을 이미징 특히 그러하다. 이러한 관점에서, apotome 기능이 충분한 품질의 이미지를 생성하기 위해 신속하고 비용 효율적인 대안을 나타낸다 (예를 들어,도 2 및도 3의 이미지).
뇌의 연구에서는 모두 화상 SI에서 세포 종종 필요같은 뇌의 데. 예를 들면, DA 신경은 뇌의 앞쪽과 뒤쪽 양쪽에서 클러스터에 존재한다. 뇌 슬라이드 상에 장착 한 후에 촬상 그러나 인해 두께로 떨어진 광원으로부터의 측면 (즉, 장착 슬라이드 대향면)은 일반적으로 정규 화합물 및 공 촛점을 사용하여 약한 신호 적은 선명한 화상을 일으킨다 현미경. 두 커버 슬라이드 사이에 시료를 장착함으로써, 상기 장착 슬라이드 유사한 신호 세기와 같은 뇌의 양쪽의 후속 영상에 샘플 편리 반전 할 수있다.이 그림의 양쪽에서 촬상 DA 뉴런의 예 상대적으로 비교 신호 강도 및 이미지 품질을 보여 주었다이 방법을 사용하여 머리를 비행.
성인 비행 뇌를 해부에 대한 몇 가지 쉬운 다음과 접근 방법이 잘되어 9, 10을 설명하고있다. 우리의 접근 방식은 모피 할 수있는 다른 방법을 제공합니다THER 성인의 해부 및 염색 과정이 뇌를 조종 단순화합니다. 더 큰 규모의 연구가 전체 뇌 신경 회로뿐만 아니라, 분자 및 세포 성분을 매핑하도록 수행되고, 자동 해부 및 촬상 방법은 높은 처리량 유전자 의약품 스크린을 실현 성인 초파리 뇌에서 개발 될 수 있음을 예견 이 고전적인 유전자 모델에서 생체있다.
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Acknowledgments
우리는 프로젝트에 자신의 엄청난 지원 씨 ENES 메 흐멧, 미스 키아라 엔드 레데, 미스 필로드 리 게스, 크리스 곽, 그리고 양 다나 Ghafir을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
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