Summary
Se describe un método que usa irradiación periférica dirigida a inducir un comportamiento a la fatiga como en ratones. La dosis de irradiación no letal seleccionado conduce a una reducción de una semana de duración de la actividad voluntaria rueda de funcionamiento.
Abstract
la fatiga relacionada con el cáncer (CRF) es una condición penosa y costosa que a menudo afecta a los pacientes que reciben tratamientos contra el cáncer, incluyendo la terapia de radiación. Aquí se describe un método que utiliza la irradiación periférica dirigida a inducir un comportamiento similar a la fatiga en ratones. Con blindaje apropiado, la irradiación se dirige a la región pélvica / abdominal inferior del ratón, evitando el cerebro, en un esfuerzo para modelar el tratamiento de radiación recibida por los individuos con cáncer pélvico. Entregamos una dosis de irradiación que es suficiente para inducir un comportamiento a la fatiga como en ratones, medida por la actividad voluntaria rueda de funcionamiento (VWRA), sin causar morbilidad obvia. Desde rueda para correr es un comportamiento normal, voluntaria en ratones, su uso debe tener poco efecto de confusión en otras pruebas de comportamiento o medidas biológicas. Por lo tanto, la rueda de funcionamiento se puede utilizar como una medida de resultado factible en la comprensión de las correlaciones conductuales y biológicos de la fatiga. CRF es una afección compleja con el co frecuentesmorbilidades, y probablemente tiene causas relacionadas tanto con el cáncer y sus distintos tratamientos. Los métodos descritos en este documento son útiles para investigar los cambios inducidos por la radiación que contribuyen al desarrollo de la IRC y, más en general, para explorar las redes biológicas que pueden explicar el desarrollo y la persistencia de un comportamiento periférica provocada, pero centralmente impulsado similar a la fatiga .
Introduction
La fatiga relacionada con el cáncer (CRF) es una condición penosa y costosa que a menudo afecta a los pacientes que reciben tratamientos contra el cáncer 1. La fatiga es ni proporcional a la actividad reciente ni aliviado por el reposo, y se asocia con una amplia variedad de trastornos relacionados con el estado de ánimo, la motivación, la atención y la cognición 2. Las causas biológicas de CRF son desconocidos, aunque se ha demostrado en muchos casos que se correlaciona con los niveles de inflamación y citoquinas, también en algunos casos con los niveles de hemoglobina y la función de varios sistemas hormonales (ver SALIGAN et al. 3 para una revisión de biológica estudios de CRF).
Los estudios controlados utilizando modelos animales son necesarios para comprender el comportamiento y la biología asociada a esta enfermedad compleja. Mientras que, el 6 de grasa 4 o 5 relacionada con la quimioterapia relacionada con el tumorigue se ha estudiado en modelos de roedores, la etiología de la IRC-puede ser un tratamiento específico. Para investigar CRF relacionados con la terapia de radiación, nuestro grupo ha desarrollado recientemente un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación 7. En contraste con los modelos existentes que implican CRF cerebral o irradiación corporal total 8, 9, este modelo explora cómo un cambio en el comportamiento impulsado centralmente, como la fatiga, puede ser provocada por un procedimiento de irradiación dirigida periféricamente.
El procedimiento aquí descrito está diseñado para modelar la radioterapia se administra a pacientes con cáncer pélvico, usando protección de plomo para apuntar la región pélvica / abdominal inferior con irradiación. Sin embargo, mediante la modificación de la protección de plomo o su colocación con respecto a los animales de experimentación, este procedimiento podría ser adaptado para modelar irradiación de otras partes del cuerpo. Voluntaria actividad rueda de funcionamiento (VWRA) se utiliza para medir la fatiga behavio similarr; porque es un comportamiento voluntario y normal 10, se debe permitir el uso simultáneo de otras pruebas de comportamiento y biológicos. Hemos encontrado que la irradiación periférica es suficiente para reducir VWRA en ratones sin causar morbilidad abierta 7. Los futuros experimentos con este modelo pueden ayudar a revelar efectos de la irradiación periférica en la señalización biológica inmune y otros, así como los cambios aguas abajo en el sistema nervioso central que puede producir déficits asociados con CRF.
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Protocol
Declaración de Ética: Este estudio fue aprobado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Todos los investigadores que participan en el manejo de animales y medición de los resultados del estudio fueron debidamente capacitados por la Oficina de NIH de Cuidado y Uso de Animales y el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre murino Fenotipificación Core. Todos los aspectos de la experimentación con animales, la vivienda y las condiciones ambientales utilizados en este estudio fueron en cumplimiento de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 11.
1. Vivienda y los animales de experimentación
NOTA: Casa de sexo masculino ratones C57BL / 6 (aproximadamente cinco semanas de edad a la llegada) de forma individual durante todo el experimento y proporcionar acceso ad libitum a comida y agua. Todas las jaulas se mantienen en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con la fase de la luz a partir de las 6 am y fase oscura a las 6 pm.
- Identificar los ratones y asignarlos a ventilar norma individuald jaulas de ratón. Espere 24 horas después de que el procedimiento de identificación para la recuperación.
NOTA: Tatuaje de la cola se recomienda como un medio de identificación para eliminar la posibilidad de que una etiqueta de oreja puede quedar atrapada en una rueda para correr. Tatuar un número en la cola de cada ratón, con el número en la cola coincide con el número escrito en la jaula del ratón. - Permitir que los ratones se aclimaten a sus jaulas durante al menos tres días más, el manejo de cada ratón suavemente durante un período de tres minutos por día.
2. rueda corriente Aclimatación y Línea de Base
- Introducir a los ratones a jaulas individuales VWRA, cada uno equipado con una rueda para correr conectada a un contador electrónico para el registro continuo.
NOTA: Todos los contadores de ruedas se conectan a un ordenador a través de una única interfaz USB (consulte la Lista de Materiales). El software del ordenador calcula el número de rotaciones de la rueda, la distancia recorrida, y la velocidad media a través de cada intervalo de tiempo designado de la duratio total especificadonorte. Una vez que la grabación se detiene, los datos se guardan automáticamente tanto como texto y hojas de cálculo. - Iniciar la grabación de VWRA a través de la interfaz de programas de computación. Establecer intervalos de grabación a una hora y la duración de al menos cinco días. VWRA seguir grabando durante al menos cinco días.
NOTA: Al final de la etapa 2.2, todos los ratones deben lograr una cantidad relativamente constante de la actividad diaria de la rueda en marcha. Si no es así, identificar y excluir cualquier valor atípico. - Detener VWRA grabación a través de la interfaz del software, y volver a los ratones a sus jaulas estándar descritas en el paso 1.1 (jaulas sin ruedas corriendo).
- Selección aleatoria de los ratones en cualquiera de los controles irradiados o grupos irradiados.
3. La irradiación
Nota: Realice los siguientes pasos para todos los ratones en ambos grupos, una vez al día durante tres días consecutivos. Tratar los ratones en el mismo orden cada día.
- Anestesiar a cada ratón mediante inyección intraperitoneal deuna mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) mezcla.
- Confirmar la anestesia con una pizca dedo del pie y el uso de pomada en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Transferir el ratón anestesiado en un dispositivo de protección de plomo. Organizar el ratón en el blindaje de modo que sólo se expone la región pélvica / abdominal inferior.
NOTA: El blindaje se compone de dos de plomo "cajas", con un espacio abierto entre estrecha en que permite la exposición de radiación a una pequeña región, dirigida del ratón (véase la Figura 1). - Use cinta adhesiva médica para asegurar la base de la cola del ratón en posición dentro del blindaje.
NOTA: El paso 3.4 es opcional, pero al hacerlo puede ayudar a asegurar que la posición del ratón no cambia durante el siguiente paso. - Transporte el dispositivo de protección en el irradiador, asegurándose de que la posición de los animales en el blindaje se mantiene.
- Si el ratón está en el grupo de irradiación, entregar 800 cGy a dostasa de e de aproximadamente 110 cGy / min. Si el ratón está en el grupo control simulado de la irradiación, deje el puntero del ratón en el irradiador inactivo durante el tiempo equivalente.
Nota: Los valores irradiator óptimas dependerán del dispositivo en particular. La tasa de dosis de 110 cGy / min suministrado desde una fuente de cesio 137 es la tasa de dosis central del irradiador utilizado aquí. El tiempo de exposición se ajustó para alcanzar la dosis total deseada de 800 cGy. - Retire el ratón del irradiador y el blindaje, y luego devolverlo a su estado original jaula, las normas mencionadas en el paso 1.1.
- Monitorear continuamente el ratón hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
4. Medición de fatiga inducida por radiación
- En el día después de la finalización de tres días sucesivos de la irradiación, la transferencia de los ratones a sus jaulas VWRA individuales descritos en el paso 2.1.
- Record VWRA, como se describe en el paso 2.2, con la excepción aquí de ajustar la grabaciónduración de más de 15 días. Al final de los 15 días, detener manualmente VWRA grabación a través de la interfaz de software.
NOTA: Los datos de cada período de registro se guardan automáticamente como hojas de cálculo, cada uno de los cuales incluye la rotación, la distancia y las mediciones de velocidad para todos los animales (columnas) y en todos los intervalos (filas) a lo largo de la duración de la grabación. Al final del experimento, hay dos hojas de cálculo generadas por el software de grabación: una para el VWRA pre-irradiación, y uno para el VWRA post-irradiación.
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Representative Results
Tres lotes de ratones se realizaron mediante el protocolo descrito anteriormente. Hubo un total de 16 farsa y 20 irradiadas (2.400 cGy, 3 x 800 / día cGy) ratones. Después de tres días consecutivos de la irradiación, el grupo irradiado demostraron una reducción significativa en comparación con VWRA simulado (mixtas ANOVA de medidas repetidas: efecto principal del tratamiento de irradiación, F 1,13 = 19,233, p <0,001). El efecto fue significativo durante los primeros siete días después de la irradiación (simples efectos principales, p <0,05 con corrección de Bonferroni), con la distancia media más baja VWRA que ocurre en el tercer día después de la radiación (Figura 2A). En los días 25 y 26, no hay datos se recogieron debido a otras pruebas de comportamiento.
La Figura 2B muestra la distribución de la variación de VWRA de antes a después de la irradiación. Mientras que la mayoría de los ratones ensayados mostraron síntomas de fatiga-como (a i reducciónn actividad rueda corriente), hubo un pequeño número de ratones que mostraron poco cambio o incluso un aumento en VWRA (Figura 2B, inferior parcela). Debido a esta variabilidad, los experimentos con muestras de pequeño tamaño no pueden capturar el comportamiento a fatiga similar.
Figura 1: Aparato de entrega de blindaje. El blindaje, que fue desarrollado en la empresa, se monta como dos cajas idénticas. Los ratones se colocan con sólo su región pélvica expuesta en el espacio entre las cajas de plomo. (A) Una fotografía del blindaje en su envase. Las cajas de plomo están rodeados por la espuma de poliestireno para mantenerlos en su posición, que está rodeado por el recipiente de plexiglás de diámetro 10,5 pulgadas que fue diseñado para el irradiador. (B) Esquema de la protección de plomo. El blindaje de plomo se compone de bloques gruesos de 1 pulgada de plomo aroscilado como dos cajas. Cada cuadro se compone de cuatro piezas: las piezas superior e inferior son 4,25 "x 3" x 1 ", mientras que las piezas laterales son ~ 0,5" x 3 "x 1". Cuando está montado, las dimensiones exteriores de cada cuadro son 4,25 "x 3" x 3 ", y hay un 1" brecha entre ellos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Daily Voluntario rueda corriente Distancia. (A) la distancia total promedio de carreras por los ratones cada día (n = 16 control, 20 irradiado). Los ratones fueron irradiados en los días 14, 15 y 16. En los días 25 y 26, pero no los datos fueron recolectados debido a otras pruebas de comportamiento. Las barras de error muestran el error estándar de la media. * P <0,05. (B) Histogramas de los cambios en VWRA, define aquí como la media de la tres días inmediatamente antes de la irradiación (días 11 - 13) menos la media de los tres días inmediatamente después de la radiación (días 17 - 19). Los números positivos indican una reducción en VWRA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito un protocolo mediante el uso de la irradiación periférica dirigida a inducir una reducción de VWRA en ratones sin confundir la morbilidad o la mortalidad. Es importante destacar que un dispositivo de pantalla simple permite la irradiación en este protocolo para dirigirse a una región deseada consistente, imitando los tratamientos de radiación recibidas por los pacientes con cáncer pélvico. En contraste con los modelos existentes que implican CRF cerebral o irradiación corporal total 8, 9, este modelo explora cómo un procedimiento de irradiación dirigida periféricamente puede afectar el comportamiento de fatiga impulsado centralmente. En nuestros resultados representativos, se muestra que la irradiación periférica entregado de esta manera es suficiente para producir el comportamiento a fatiga-como con una completa recuperación más o menos una semana después.
Como medida de la fatiga, VWRA permite la evaluación simple y objetivo de la distancia y la velocidad de 24 h por día, lo que requiere la formación y el experimento mínimo tiempo. Es lo que haceE exigen los ratones en jaulas individuales de vivienda, por lo que el espacio del establecimiento de un posible factor limitante. Mientras que la vivienda individual puede afectar el comportamiento del ratón, que puede dar lugar a la ansiedad o hiperactividad 12 13, existe evidencia de que rueda para correr puede reducir estos efectos negativos 14. Comportamiento de marcha de la rueda también se ha demostrado que tienen menos variabilidad intra-ratón y una mayor reproducibilidad que otras evaluaciones de la actividad física 15. Sin embargo, es posible que la fatiga física puede ser capturado de forma más selectiva por medios distintos de la actividad voluntaria, ya que la actividad voluntaria puede depender de la motivación o factores distintos a la fatiga estrictamente físico 16. Experimentos adicionales serían necesarios para hacer tal determinación.
Sin embargo, hay varios puntos dentro del protocolo que son críticos para el éxito. Es importante que los ratones se les permite tiempo para recuperaránr a su llegada a una nueva instalación, manejo y que se llevará a cabo durante este período como se ha señalado. Estos procedimientos reducen el estrés y la ansiedad, que puede afectar a la actividad voluntaria 17. El mantenimiento de la anestesia completa durante el proceso de irradiación también es fundamental, no sólo por estar limitado dentro de espacios cerrados (el blindaje de plomo) puede ser un factor de estrés significativo para los animales 18, sino también para evitar la exposición innecesaria de otros órganos / tejidos de la irradiación. Por tanto, es importante asegurarse de que la dosis del anestésico es adecuado para la edad y cepa de ratones antes de comenzar la porción de irradiación de este protocolo. Además, la aclimatación de los ratones a la ejecución de las ruedas durante un mínimo de cinco días es crítica para obtener el comportamiento estable antes de los datos de irradiación y adecuados para el análisis.
Para solucionar los números VWRA inusuales, las jaulas VWRA deben ser monitorizados regularmente para detectar posibles problemas. para example, si la ropa de cama se vuelven apilados sobre o directamente debajo de la rueda, o si las ruedas de rodadura no son lo suficientemente limpia, esto puede poner resistencia al giro de la rueda y reducir las mediciones del nivel de actividad. Además, dado que se presenta con mayor rueda de funcionamiento durante las horas de oscuridad 7, VWRA puede ser sensible a las fluctuaciones en el ciclo de luz, y se debe tener cuidado para mantener los ciclos de luz normal e ininterrumpida.
Este protocolo se puede acomodar el uso de diferentes niveles de irradiación. Por ejemplo, describimos tres días de dosificación con 800 cGy en este protocolo, pero hemos visto niveles ligeramente inferiores de la fatiga utilizando tres días de 600 cGy dosis 7. Los efectos de una dosis de irradiación en particular dependerán de la cepa de ratones 19, la tasa de dosificación del irradiador 20, el fraccionamiento a través de múltiples día 21, y es probable que el tamaño de la región exposed debajo de la protección. Las dosis únicas de 1.000 cGy de irradiación de todo el cuerpo se han utilizado en ratones C57 / BL6 sin aumento de la mortalidad 22, pero se deben tomar precauciones para asegurar que las altas dosis de radiación no producen signos de morbilidad.
Además de la dosis de radiación, otros varios pasos pueden ser modificados para adaptarse a la experimento a la mano. Modificando el blindaje de plomo o la colocación del animal en el blindaje, estos métodos podrían ser adaptados para apuntar otras regiones del cuerpo con la irradiación. Sin embargo, los cambios en el dispositivo de pantalla deben ser validados con la dosimetría para asegurar que la irradiación no penetra en el área protegida. Este protocolo también podría ser adaptado para incorporar una amplia variedad de medidas de comportamiento, como la actividad de la carrera voluntaria no impediría experimentos de comportamiento que son más física o mentalmente exigente. Por ejemplo, el CRF se produce a menudo junto con déficits cognitivos 3; futuroexperimentos podrían explorar el papel que la radioterapia puede desempeñar en esta asociación. La presencia de actividad rueda corriente debe tenerse en cuenta a la hora de realizar las pruebas de comportamiento adicionales, como VWRA puede afectar a la fisiología y el comportamiento de muchas maneras 16.
Con dosis de irradiación de 800 cGy o menos, los ratones no debe necesitar cuidado especial después de recuperarse de la anestesia. Sin embargo, el procedimiento de irradiación y la fatiga resultante pueden potencialmente interactuar con otras intervenciones, como las pruebas de comportamiento adicionales o tratamientos farmacéuticos. Los animales deben ser monitorizados estrechamente en los días inmediatamente después de la irradiación cada vez que la alteración o adición a este procedimiento descrito. Las diferentes cepas de ratones también pueden mostrar una sensibilidad diferente a la irradiación 19, por lo que se recomienda precaución cuando se utiliza cepas distintas de C57BL / 6.
Mientras que esta técnica está diseñada para representar la radiación enfatiga producido, es sólo un componente de la CRF concepto complejo. CRF es una condición que es probable que tenga numerosas causas y se produce en los pacientes que tienen cáncer y, a menudo reciben múltiples tratamientos. Por tanto, una comprensión de CRF puede requerir conjuntos de experimentos con ratones portadores de tumores y con otros tratamientos tales como la quimioterapia o terapia hormonal. La incorporación de estas variables en los ensayos biológicos y de comportamiento permitirá a los investigadores a identificar sus contribuciones a esta condición compleja. El modelo de ratón descrito aquí puede ayudar a entender el papel específico de la radiación en la IRC y desarrollar terapias potenciales.
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Disclosures
Esta investigación fue apoyada por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Investigación en Enfermería, Institutos Nacionales de Salud.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Michele Allen del National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) por compartir generosamente su experiencia en métodos de fenotipado murinos y por su asistencia técnica en curso, así como para timothy Hunt, de NHLBI para ayudarnos a desarrollar el dispositivo de protección. Este estudio es apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Investigación en Enfermería del NIH, y parte de la prueba de validación es apoyado por una beca de la Oncology Nursing Society Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River | Strain code 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse) | |
| Ketamine HCl | Putney | 100 mg/mL stock solution | |
| Xylazine HCl | Lloyd Laboratories | 100 mg/mL stock solution | |
| Rodent Tattoo System | AIMS | ATS-3 | http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system |
| Lead Shielding Apparatus | (custom made) | One-inch thick lead shielding arranged as two boxes with a one-inch thick gap between them for targeted irradiation | |
| Plexiglass shielding container | (custom made) | Plexiglass container filled with styrofoam. Styrofoam cutouts hold the lead shielding in place. | |
| GammaCell 40 Exactor | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html | |
| RAD Disk Ultra | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_rad.html | |
| Mouse Single Activity Wheel Chamber | Lafayette Instrument Company | #80820 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980 |
| Activity Wheel Counter for Computer Monitoring | Lafayette Instrument Company | #86061 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052 |
| Modular Cable for Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86051-7 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046 |
| USB Computer Interface for Activity Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86056A | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047 |
| Activity Wheel Monitor Software | Lafayette Instrument Company | #86065 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053 |
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