Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Legionella pneumophila ytre membran Blemmer: Isolering og analyse av deres Pro-inflammatorisk potensialet på Makrofager

doi: 10.3791/55146 Published: February 22, 2017

Summary

Her beskriver vi rensing av Legionella pneumophila (L. pneumophila) ytre membranblærer (OMVS) fra flytende kulturer. Disse rensede vesikler blir så brukt for behandling av makrofager for å analysere deres pro-inflammatorisk potensial.

Introduction

Bakterier kan skille ut virulensfaktorer via ulike mekanismer 1. Foruten de kjente sekretoriske systemer kan gram-negative bakterier utveksle informasjon og leverer virulensfaktorer via yttermembran vesikler (OMVS), som er små, sfæroide vesikler 10-300 nm i diameter og med en bilayered membranstruktur. De blir utskilt i en rekke vekstmiljøer (flytende kultur, fast kultur, og biofilm) og i alle vekstfaser 2, 3. OMVS er et viktig virkemiddel for transport (for eksempel for proteiner, adhesinene, giftstoffer og enzymer, samt for LPS, som finnes på OMV overflaten) 4. Den intraluminale lasten er beskyttet fra proteolytisk nedbrytning, slik at det er i stand til å virke over lange avstander, og vesiklene kan finnes i kroppsvæsker og fjerntliggende organer 5, 6,"xref"> 7, 8. De kan ikke bare bli gjenkjent og tas opp av eukaryote celler 9, 10, men dessuten er de i stand til å lette binding av bakterier og deres invasjon i vertsceller 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) er en Gram-negativ bakterie som kan slippe OMVS. I den menneskelige lunge, det smitter primært alveolære makrofager, selv om dens naturlige verts er ferskvann amøber 11. En L. pneumophila infeksjon kan forårsake legionellose, en alvorlig form for lungebetennelse 12. Den blokkerer phagosome-lysosome fusjon i vertscellen. Det rekrutterer også vertsorganeller, der en replikering nisje, den legionella-holdige vakuole (LCV), er dannet 13, 14. Lysosomal degradering er hemmet ikke bare av effektor protein translocation via type IV sekresjon system, men også ved utgivelsen av OMVS 15.

Rensingen av OMVS fra bakteriekulturer er nødvendig for å analysere deres effekt på mottakercellene. Tidligere studier fokusert på proteininnholdet i L. pneumophila OMVS og på påvirkning av vesiklene på alveolære epitelceller 16, men senere studier med human lungevev transplantasjoner vist at L. pneumophila OMVS er tatt opp av alveolære makrofager 17.

Som OMVS nåværende patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs) og andre bakterielle antigener, de kan ha en innvirkning på infeksjon av eukaryote celler og modulere vertens immunrespons 18. L. pneumophila OMVS raskt smelter med vertscellemembraner, og dessuten de aktiverer membran TLR2 19. Som det er kjent at L. pneumophILA OMVS stimulere makrofager og epiteliale celler i et pro-inflammatorisk måte 16, 17, analyserte vi virkningen av OMVS på infeksjonsprosessen i humane og murine makrofager.

Her beskriver vi en protokoll for dyrking av L. pneumophila i flytende kultur for å isolere de utskilte OMVS av differensialultrasentrifugering og for å vurdere effekten av vesiklene på eukaryote vertsceller, enten direkte eller etter en infeksjon.

Protocol

1. Forbered Medium og agarplater

  1. Forbered en liter buljong medium (Yeb). Oppløs 10 g ACES og 10 g gjærekstrakt i 900 ml destillert vann. Juster pH til 6,9 med KOH (5 N). Tilsett 10 ml av L-cystein (0,4 g i 10 ml destillert vann) og 10 ml av Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g i 10 ml destillert vann). Fyll opp til 1 liter med destillert vann og filtrerer sterilisere løsningen (porestørrelse 0,22 um) til. Oppbevar ved 4 ° C.
  2. Forbered bufret kull gjærekstrakt (BCYE) agar plater. Oppløs 10 g ACES og 10 g gjærekstrakt i 900 ml destillert vann. Juster pH til 6,9 med KOH (5 N). Tilsett 15 g agar og 2,5 g aktivert trekull. Fyll opp til 1 liter med destillert vann og autoklav.
    1. Tilsett 10 ml av L-cystein (0,4 g i 10 ml destillert vann) og 10 ml av Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g i 10 ml destillert vann, begge deler sterilisert ved filtrering gjennom 0,22 umporer) til avkjølt BCYE (ca. 50 ° C). Hell plater og oppbevar ved 4 ° C.

2. Dyrke L. pneumophila

  1. Spre L. pneumophila-stammen Corby (villtype, WT) på BCYE agarplater og inkubere dem ved 37 ° C i 3 dager. Inokuler 10 ml av Yeb ved en OD 600 på 0,3 med L. pneumophila fra forkulturen plate; inkubere bakteriene ved 37 ° C på en roterende rister (150 rpm) i 6 timer.
  2. Bekrefte renheten av den flytende kultur ved å spre 100 ul av suspensjonen på en blodagar plate. Inkuber over natten ved 37 ° C.
  3. Legge til den gjenværende flytende kultur til 90 ml av frisk Yeb medium og inkuberes på en roterende rister (37 ° C og 150 rpm) for å oppnå en OD 600 på 3,0 til 3,5, noe som tar omtrent 16 til 20 timer.

3. Utarbeide og kvantifisere L. pneumophila OMVS

MERK: Utfør alle av følgende sentrifugeringstrinns under sterile betingelser og ved 4 ° C.

  1. Sentrifuger den flytende kultur ved 4000 xg i 20 minutter for å klumpe bakteriene. Overfør supernatanten til friske sentrifugerør, forkaste den bakterielle pellet, og gjenta sentrifugering (4000 xg i 20 min). Gjenta dette trinnet en gang.
  2. Sterilfilter den gjenværende supernatanten to ganger (porestørrelse 0,22 um). Overfør den bakteriefrie supernatant til ultrasentrifuge-rør og ultrasentrifugering ved 100.000 xg i 3 timer.
  3. Dekanter supernatanten og kast den. Resuspender pellet OMV i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) og ultrasentrifuge (100 000 xg i 3 timer) for å fjerne kontaminerende proteiner og LPS.
  4. Kast supernatanten og resuspender pelleten i OMV 500 ul steril PBS. Serie 20 ul på en blodagar plate og på en BCYE agar-plate for å utelukke bakteriell forurensning av de fremstilte vesiklene. Inkuber blodagarplate over natten og BCYE agar plate i 3 dager (begge ved 376, C).
  5. Kvantifisere protein beløpet hentet fra OMV forberedelse på en bicinchoninic syre analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Konsentrasjonen av 100 ml av L. pneumophila kultur er vanligvis 1 pg / pl. Oppbevar forberedt og tallfestede OMVS ved -20 ° C.

4. Pre-treat Makrofager

  1. Forbered THP-1 celler.
    MERK: THP-1 er et monocyttisk cellelinje avledet fra en leukemipasient.
    1. Legg 2x10 5 THP-1-celler per 24 brønner og skille dem ved tilsetning av 20 nM forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) til makrofaglignende celler. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C.
    2. Erstatte mediet med 500 ul friskt medium og inkuberes i ytterligere 24 timer; den optimale mediet for THP-1-celler er sammensatt av RPMI 1640 med høy glukose supplert med 10% føtalt kalveserum.
  2. Isolere murin benmarg-avledede makrofager (mBMDM), som beskrevet i Refererhet 20.
  3. Unn THP-1-avledet makrofager eller mBMDM med OMVS.
    1. Tine OMVS fremstilt i trinn 3 og legge dem i henhold til deres proteinmengden (0,1, 1, og 10 ug / ml) til den humane eller murine makrofager. Inkuber makrofager med OMVS ved 37 ° C i minst 20 timer. Bruk supernatanten for ELISA eller gå videre med trinn 5.

5. infisere Makrofager og vurdere Bakteriell Replication med en kolonidannende Unit (CFU) analyse

  1. Bruk L. pneumophila fra trinn 2.1, forbehandlet THP-1 celler eller mBMDM fra trinn 4.3, og ikke forbehandles makrofager som kontroller (2x10 5/24 brønner). Ikke utveksle mediet.
  2. Infisere THP-1-celler med L. pneumophila Corby WT og mBMDM med et flagellin-manglende mutant av L. pneumophila Corby (begge med en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 brønner) og inkuberes i 24 og 48 timer, henholdsvis. Forbered both L. pneumophila Corby (WT eller flagellin-mangelfull mutant) som beskrevet i trinn 2.1.
  3. Lyse av cellene i sitt medium ved tilsetning av saponin (sluttkonsentrasjon: 0,1%) og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter.
  4. Resuspender bakterier ved pipettering og overfører suspensjonen til en reaksjonsbeholder. Forbered serielle fortynninger av L. pneumophila holdige medier i sterile PBS.
  5. Serie 50 ul av de nødvendige fortynninger på BCYE agarplater og inkuberes i 3 dager ved 37 ° C.
  6. Visuelt telle dannet kolonier. Beregn CFU ligning 1 Normalisere CFU teller resultatet til ikke forbehandlet men infiserte makrofager, som er satt til 100%.

Representative Results

Det eksperimentelle oppsettet for å fremstille L. pneumophila OMVS og for å analysere deres innflytelse på pro-inflammatorisk respons av makrofager etter infeksjon er vist i figur 1. Den pro-inflammatoriske potensialet av de fremstilte OMVS kan analyseres på PMA-differensierte THP-1-celler, som er vist i figur 2. THP-1-celler reagere med en tids- og doseavhengig økning av IL-8 og IL-6-sekresjon. I tillegg kan innvirkningen av forskjellige TLR'ene for L. pneumophila OMV gjenkjennelse analyseres ved hjelp av mBMDM fra forskjellige genetiske bakgrunner, overensstemmende med CXCL1 ELISA i figur 3. mBMDM fra WT mus utskilt CXCL1 etter OMV stimulering, mens mBMDM TLR2 / 4 - / - utskilles vesentlig mindre. For å studere virkningen av L. pneumophila OMVS på bakteriell replikasjon i THP-1-makrofager, cellene ble pre-inkubert med OMVS og deretter i tillegg infisertmed L. pneumophila (figur 4 A). Den pre-stimulering av THP-1-avledede makrofager reduserer først det bakterielle replikasjon etter 24 timer for infeksjon, men det fører til en dobling i CFU teller på det senere tidspunkt (48 timer pi). Virkningen av Toll-lignende reseptor (TLR) signalering på OMV erkjennelse etter infeksjon av makrofager kan vurderes ved mBMDM, som vist i figur 4 b. Bakterie replikering øker med ti ganger i mBMDM fra WT dyr etter OMV pre-inkubasjon, mens TLR2 - / - og TRIF / MyD88 - / - celler ikke viser denne økningen i L. pneumophila replikering.

Figur 1
Figur 1: Eksperimentell prosedyre. (A) L. pneumophila Corby WT fra 10 cm BCYE agarskåler blir anvendt for å inokulere et lite flytende kultur (10 ml), som blir overført til 90 ml friskt Yebmedium etter 6 timer. Et lite volum er også utplatet på en blodagar plate for å kontrollere renheten. Bakterier ble inkubert ved 37 ° C frem til tidlig stasjonær fase (OD600 = 3,0-3,5). (B) Den flytende kultur ble sentrifugert og sterilfiltrert for å fjerne bakteriene. Den Legionella-fri supernatant blir deretter ultrasentrifugert for å oppnå en pellet OMV, som blir resuspendert i PBS og ultrasentrifugert igjen. De isolerte vesikler resuspenderes, sjekket for renhet, og kvantifisert for den proteinmengden. Målestokk representerer 2,5 cm. (C) Menneske eller murine makrofager stimulert med kvantifiserte OMVS. Cellekultursupernatanten kan brukes for ELISA, eller makrofager kan være infisert med L. pneumophila for å bestemme bakteriell replikasjon av CFU-analyse på 10-cm BCYE agarplater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Pro-inflammatorisk aktivering av THP-1-celler av L. pneumophila OMVS. (A) Her blir monocytisk THP-1 cellelinje anvendt som en modell for alveolare makrofager. PMA-differensierte THP-1-cellene ble behandlet med økende doser av L. pneumophila OMVS (0,01-25 pg / ml) i 24 og 48 timer henholdsvis. Den cellefrie supernatant ble anvendt for IL-8 ELISA. Middelverdiene for tre uavhengige eksperimenter ± SEM er vist. THP-1-celler reagerte på så lite som 0,01 mikrogram / ml L. pneumophila OMVS med sterk IL-8-sekresjon, som var tids- og doseavhengig. (B) L. pneumophila OMVS (0,1-10 ug / ml) ble anvendt for å stimulere PMA-differensierte THP-1-celler. Supernatanten ble oppsamlet etter 24 og 48 timers inkubering, og det frigjorte IL-6 ble målt i supernatanten via ELISA. Middelverdiene for tre uavhengige eksperimenter ± SEM er vist. THP-1-celler som utskilte store mengder av IL-6, selv med den laveste dosen av OMVS (0,1 ug / ml). Sekresjonen av IL-6 økte med økende OMV doser og med langvarig inkubasjonstider. Statistikk: Mann-Whitney test; * P <0,05 og ** p <0,01 sammenlignet med den tilsvarende 0 ug / ml OMV. Gjengitt med tillatelse fra Reference 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Den pro-inflammatoriske aktivering av makrofager, avhenger av TLR2 / 4. mBMDM fra WT og TLR2 / 4 - / - mus ble inkubert med L. pneumophila OMVS (0,1 eller 1 pg / ml). CXCL1 sekresjon ble analysert ved ELISA etter 24 og 48 timer henholdsvis. Demiddelverdier ± SEM av tre uavhengige eksperimenter er vist. mBMDM fra WT mus svarte med en doseavhengig CXCL1 sekresjon etter L. pneumophila OMV inkubasjon. TLR2 / 4 - / - mBMDM utskilte signifikant mindre CXCL1 sammenlignet med WT mBMDM, og dette sekresjon økte ikke doseavhengig. Statistikk: Mann-Whitney test; * P <0,05 sammenlignet med den tilsvarende 0 ug / ml OMV; #p <0,05 sammenlignet med en like behandlet WT prøven. Gjengitt med tillatelse fra Reference 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: L. pneumophila OMV preinkubasjon øker bakteriell replikasjon i makrofager. (A) differensierte THP-1-cellene ble pre-inkubert med OMVS (0,1, 1 eller 10 μ; G / ml) eller LPS / IFN-γ (200 ng / ml hver) eller forble ubehandlet for kontroll. Etter pre-inkubering (20 h), ble THP-1-celler infisert med L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) i 2, 24 og 48 timer henholdsvis. THP-1-celler ble lysert ved tilsetning av saponin, og bakteriene ble sådd ut på BCYE agarplater. CFU ble beregnet i forhold til 0 ug / ml OMV etter hvert tidspunkt. Stolpene representerer gjennomsnittsverdier ± SEM av tre uavhengige forsøk, hvert utført i teknisk duplikater. Det var ingen forskjell i bakterieopptak (2 timer etter infeksjon (pi)) i forhold til ikke pre-behandlede celler. Endringer i bakteriell replikasjon ble bestemt etter 24 og 48 timer, henholdsvis. LPS / IFN-γ forbehandlede THP-1 celler viste en reduksjon i bakteriemengde 24 timer pi Det ble også observert en doseavhengig for L. pneumophila OMV forbehandlede celler. På senere tidspunkt (48 h pi), OMV pre-behandlet THP-1 celler viste en dobling i L. pneumophila regrammet, mens LPS / IFN-y forbehandlede makrofager viste en ytterligere reduksjon av bakteriemengde. Statistikk: Mann-Whitney test; * P <0,05 og ** p <0,01 sammenlignet med den tilsvarende 0 ug / ml OMV. (B) mBMDM fra mus med forskjellige genetiske bakgrunner (WT, TLR2 - / -, og TRIF / MyD88 - / -) ble pre-inkubert med 0,1 ug / ml L. pneumophila OMVS i 20 timer og ble deretter infisert med et flagellin- mangelfull mutant av L. pneumophila Corby (MOI 0,5) i 48 timer. mBMDM ble lysert ved tilsetning av saponin, og den Legionella ble sådd ut på BCYE agarplater. CFU ble beregnet i forhold til 0 ug / ml OMV, indikert ved den heltrukne linje. Stolpene representerer gjennomsnittsverdiene ±± SEM av tre uavhengige eksperimenter, hver utført i duplikater. mBMDM fra WT mus viste en økning i L. pneumophila replikering etter OMV forbehandling. TLR2 - / - makrofager viste signifikant redusert - / - mBMDM. Statistikk: Mann-Whitney test; p <0,05 sammenlignet med WT prøven. Gjengitt med tillatelse fra Reference 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

De OMVS av bakterielle patogener og virkningen av disse membranvesikler på sine målcellene blir nå nøye studert. For eksempel, Clostridium perfringens-avledede OMVS indusere cytokin sekresjon i makrofager, kan B-lymfocytter aktiveres ved OMVS fra Borrelia burgdorferi, og Helicobacter pylori -released membranvesiklene kan virke på mage epitelceller 21, 22, 23. L. pneumophila, en intracellulær patogen som kan forårsake en alvorlig form for atypisk lungebetennelse, også utgivelser OMVS som er i stand til å aktivere lunge epitelceller og makrofager 16, 19. Her presenterer vi en detaljert protokoll for småskala isolering av L. pneumophila OMVS fra flytende kultur å studere potensielle rolle OMVS i lungebetennelse. Det er viktig å arbeide under sterile conditioner og for å utelukke forurensning fra andre bakterier for å oppnå en ren L. pneumophila-avledede OMV preparat. Isoleringen av OMVS omfatter et filtreringstrinn gjennom 0,22 um porer for å hindre forurensning av det oppnådde OMV pellet med L. pneumophila, selv om dette reduserer utbyttet OMV, siden de største OMVS går tapt ved denne filtreringstrinn.

Videre har vi testet responsen av menneskelige og murine makrofager til de isolerte vesikler og infiserte celler med L. pneumophila å nærmere tilnærmet situasjonen i Legionella lungebetennelse, hvor OMVS frigis inne i LCV av ekstracellulære bakterier 15. De anvendte OMV doser er beregnet i henhold til den frie OMV mengde i et in vitro infeksjon av humane makrofager etter 24 timers inkubering (beskrevet i referanse 20). For stimuleringen av andre mottakercellene eller in vivo-forsøk,andre OMV doser kan være nødvendig og må etableres. Analysen av effekten av L. pneumophila OMVS representerer et opprykk til protokollen beskrevet av Jager og Steinert 24.

Her, PMA-differensierte THP-1-celler som tjener som en modell for alveolære makrofager på grunn av den begrensede tilgjengelighet av primære humane materiale. Tilsetningen av PMA skiller de monocytiske THP-1-celler til makrofaglignende celler 25. Videre er de en velkjent modell cellelinje for L. pneumophila studerer 26. I tillegg til denne human monocyttisk cellelinje, blir mBMDM celler anvendt. mBMDM er allment akseptert for studier av effekten av L. pneumophila 27, 28, 29. Muligheten for å bruke genetisk knockouts for ulike TLRs eller andre proteiner gjør dem til et verdifullt verktøy for å studere OMV effekter. i order å redusere mengden av mus per eksperiment, blir mBMDM brukt i stedet for alveolære makrofager på grunn av begrensningene av makrofager. Nøkkel eksperimenter kan kreve alveolære makrofager for validering.

Foruten den her beskrevne protokoll fra ultrasentrifugering for å rense OMVS, er det mulig å utføre en tetthetsgradient sentrifugering, som er inkludert i protokollen ved Chutkan et al. 30. Dette kan forbedre renheten av det oppnådde OMV fremstillingen og redusere mengden av ko-renset proteinaggregater, flagellin, og LPS. Renheten av det oppnådde OMV preparat kan bli analysert ved transmisjonselektronmikroskopi eller ved nanopartikkel sporing analyse som et tilleggstrinn i kvalitetskontroll. Dette kan gi en ekstra midler for kvantifisering, utover protein måling prosedyren som presenteres her. Eventuelt kan LPS-konsentrasjonen bli analysert av en Limulus amebocyttlysat test. Hvis OMV utbyttet er lavt, enytterligere konsentrasjonstrinn via sentrifugalkreftene filtre kunne utføres, noe som ikke ble gjort her. Dersom utbyttet var lavere enn forventet, ble OMVS forkastet.

Som en del av den pågående arbeidet med å belyse biologiske mekanismer og funksjoner bak OMVS, kan påvirkning av ulike stressforhold på OMV produksjon testes. Nutrient deprivasjon, kan endringer i rugetemperatur, eller eksponering for skadelige stoffer har en innvirkning på OMV sekresjon 31. Mulige spenningsforholdene er omtalt i protokollen ved Klimentova og Stulik 32. Videre kan hyper- eller hypovesiculating L. pneumophila mutanter bli generert. De forskjellige OMV preparatene kan deretter bli analysert i smitteforsøk med makrofager, eksplanter humane lungevevet (som beskrevet i referanse 17), eller til og med i in vivo-modeller. I tillegg til rollen som OMVS i medfødte immunsignalisering, deres innflytelse i bakteriell kommunikasjonkan rettes eksperimentelt. Videre kan effekten av ulike medfødte immunsignalkaskader bli analysert ved anvendelse av murine knockout-celler eller genereringen av CRISPR / Cas9 svekninger i humane cellelinjer. Denne grunnleggende forskning i OMVS vil bistå i utviklingen av nye vaksinestrategier, som allerede finnes for hjernehinnebetennelse B overført av Neisseria meningitidis 33.

Med start fra den protokollen på OMV isolering og karakterisering, kan man anvende dette for andre Gram-negative bakterier og andre vertsceller; den bare trenger å bli justert til veksten av bakterier i flytende kultur. Protokollen publisert av Chutkan et al. gir detaljert informasjon om generering av OMVS fra Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa 30. Kulturen bør ikke nå sen stasjonær fase for å unngå økning i lyserte bakterier og forurensende proteiner og membraner. I tillegg er OMV dosen som brukes for stimulering av vertscellene må bestemmes i henhold til mengden av OMVS tilstede under in vivo-infeksjoner, samtidig som det sikrer en lav hastighet på cytotoksisitet. På denne måten, den patologiske rolle OMVS, deres innvirkning på inter-arter kommunikasjon, og vert-patogen interaksjoner kan undersøkes.

For ytterligere å studere rollen til L. pneumophila OMVS i lungebetennelse, er standardiserte OMV preparater med tilstrekkelig kapasitet og sammenlignbare smitteforsøk nødvendig. Denne protokollen vil bidra til å standardisere isoleringsprosedyrer og for å utvide OMV studier med andre Gram-negative bakterier og andre vertsceller. Videre vil forskning ha nytte av den detaljerte in vitro kunnskap, som kan brukes til å forlenge eksperimenter til in vivo-innstillinger. I fremtiden kan denne protokollen bli utvidet til isolering av OMVS fra primær biologisk materiale, slik som serum eller bronchoalveolar Lavalder væske, for å få innsikt i sammensetningen av OMVS utgitt under fysiologiske forhold. Dette vil bidra til å avgjøre viktige parametre for OMV sammensetning og å forstå egenskapene til in vitro dannede OMVS.

Acknowledgments

Vi takker Prof. Dr. Markus Schnare for å gi oss med TLR2 - / - og TLR2 / 4 - / - mus og Prof. Dr. Carsten Kirschning for TRIF / MyD88 - / - mus. Deler av dette arbeidet ble finansiert av Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys - FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), og Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medisinsk RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), alt til BS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 82.1473
70 Ti rotor Beckman Coulter Incorporation (California, USA) 337922
ACES Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9138.2
activated charcoal Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) X865.2
agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5210.2
Columbia agar with 5% sheep blood Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) 254005
cuvettes Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 67.742
ELISA (human) BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine) DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5632.1
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 10270-106
Heracell 240i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 40830469
Heraeus Multifuge X3R Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 75004515
Inoculation loop  Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 86.1567.010
KOH Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 6751.1
L. pneumophila Corby --- --- kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA --- --- kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cystein Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM --- --- kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS Biochrom GmbH (Berlin, Germany) L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000) Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) SHKE6000
RPMI 1640 high glucose Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 11875-093
saponin Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9622.1
Ultrospec 10 Biochrom Ltd (Cambridge, England) 80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm) Corning Incorporated (new York, USA) 431096
THP-1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) 88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 2363.2
Pierce BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 23225

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7, (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74, (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181, (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19, (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154, (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65, (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275, (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29, (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437, (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23, (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12, (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13, (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74, (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76, (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82, (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78, (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12, (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304, (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61, (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71, (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73, (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11, (3), 1004704 (2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195, (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. Novartis.com. Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016).
<em>Legionella pneumophila</em> ytre membran Blemmer: Isolering og analyse av deres Pro-inflammatorisk potensialet på Makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).More

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter