هنا، نحن تصف تنقية البكتيريا المستروحة (L. المستروحة) حويصلات الغشاء الخارجي (OMVS) من الثقافات السائلة. ثم يتم استخدام هذه الحويصلات تنقيته لعلاج الضامة لتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
البكتيريا يمكن أن تفرز عوامل الفوعة عبر آليات مختلفة 1. إلى جانب أنظمة إفرازية المعروفة، يمكن أن البكتيريا سالبة الجرام تبادل المعلومات وتسليم عوامل الفوعة عبر الحويصلات الخارجية غشاء (OMVS)، التي هي صغيرة، الحويصلات كروي 10-300 نانومتر في القطر ومع هيكل غشاء bilayered. تفرز أنهم في مجموعة متنوعة من بيئات النمو (ثقافة السائل والثقافة الصلبة، والأغشية الحيوية) وفي جميع مراحل النمو 2 و 3. OMVS هي وسيلة هامة من وسائل النقل (على سبيل المثال، للبروتينات، adhesins، والسموم، والإنزيمات، وكذلك لLPS، التي وجدت على سطح OMV) 4. البضائع داخل اللمعة محمي من تدهور بروتين، لذلك هو قادرة على العمل لمسافات طويلة، والحويصلات يمكن العثور عليها في سوائل الجسم وأعضاء بعيدة 5، 6،"XREF"> 7، 8. أنها لا يمكن إلا أن يكون معترف بها وتناولها من قبل الخلايا حقيقية النواة 9، 10، ولكن علاوة على ذلك، فهي قادرة على تسهيل الربط من البكتيريا وغزوهم في الخلايا المضيفة (4). البكتيريا المستروحة (L. المستروحة) هو نوع من البكتيريا سالبة الجرام التي يمكن أن يطلق OMVS. في رئة الإنسان، فإنه يصيب في المقام الأول الضامة السنخية، على الرغم من المضيف الطبيعي والاميبات المياه العذبة 11. عدوى المستروحة L. يمكن أن يسبب مرض المحاربين "، وهو شكل حاد من الالتهاب الرئوي 12. فهو يمنع الانصهار يبلوع-يحلول في الخلية المضيفة. انها تجند أيضا العضيات المضيف، حيث يتم تشكيل مكانة تكرارها، والبكتيريا المحتوية فجوة (LCV) و 13 و 14. تدهور الليزوزومية هو تحول دون ليس فقط من قبل هيئة تنظيم الاتصالات البروتين المستجيبnslocation عن طريق نظام إفراز النوع الرابع، ولكن أيضا من قبل الافراج عن OMVS 15.
مطلوب تنقية OMVS من الثقافات البكتيرية لتحليل تأثيرها على خلايا المتلقي. وأظهرت دراسات سابقة ركزت على محتوى البروتين من L. المستروحة OMVS وحول تأثير الحويصلات في الخلايا الظهارية السنخية 16، ولكن دراسات لاحقة مع زرع أنسجة الرئة الإنسان التي تتخذ L. المستروحة OMVS من قبل البلاعم السنخية 17.
كما OMVS الحالية الأنماط المرتبطة الممرض الجزيئية (PAMPs) وغيرها من المضادات البكتيرية، لأنها قد يكون لها تأثير على إصابة الخلايا حقيقية النواة وتعدل المضيف الاستجابة المناعية 18. L. المستروحة OMVS تندمج بسرعة مع أغشية الخلية المضيفة وعلاوة على ذلك، فإنها تفعيل غشائي TLR2 19. كما هو معروف أن L. pneumophرابطة القانون الدولي OMVS تحفيز الضامة والخلايا الظهارية بطريقة الموالية للالتهابات 16، 17، قمنا بتحليل تأثير OMVS على عملية العدوى في الضامة الإنسان والفئران.
هنا، نحن تصف بروتوكول لزراعة L. المستروحة في الثقافة السائلة لعزل OMVS التي يفرزها تنبيذ فائق الفرق وتقييم أثر الحويصلات في الخلايا المضيفة حقيقية النواة، إما مباشرة أو بعد الإصابة.
ويجري حاليا دراسة مكثفة لOMVS من مسببات الأمراض البكتيرية وتأثير هذه الحويصلات الغشاء على الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، -derived المطثية الحاطمة OMVS تحفز إفراز خلوى في الضامة، الخلايا الليمفاوية B يمكن تفعيلها من خلال OMVS من بوريليا burgdorferi، وهيليكوباكتر بيلوري -released يمكن الحويصلات الغشاء يعمل على الخلايا الظهارية المعدة 21 و 22 و 23. L. المستروحة، وهو ممرض داخل الخلايا التي يمكن أن تحفز على شكل حاد من الالتهاب الرئوي اللانمطي، كما يطلق OMVS التي تكون قادرة على تنشيط الرئة الخلايا الظهارية والضامة 16 و 19. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة على نطاق صغير من L. المستروحة OMVS من ثقافة السائل لدراسة الدور المحتمل للOMVS في الالتهاب الرئوي. ومن الأهمية بمكان أن يعمل تحت كونديت معقمةالأيونات واستبعاد احتمال حدوث تلوث من البكتيريا الأخرى من أجل الحصول على L. المستروحة النقي -derived إعداد OMV. وتشمل عزلة OMVS خطوة الترشيح من خلال المسام 0.22 ميكرون من أجل منع التلوث من بيليه OMV تم الحصول عليها مع L. المستروحة، على الرغم من أن هذا يقلل من العائد OMV، منذ يتم فقدان أكبر OMVS بهذه الخطوة الترشيح.
وعلاوة على ذلك، نحن اختبار رد الضامة الإنسان والفئران لتلك الحويصلات معزولة والخلايا المصابة مع L. المستروحة لتقريب أكثر عن كثب الوضع في البكتيريا الالتهاب الرئوي، حيث يتم الافراج OMVS داخل LCV بواسطة البكتيريا خارج الخلية 15. وقد تم تقدير الجرعات OMV يعملون وفقا لكمية OMV الحرة في العدوى في المختبر الضامة الإنسان بعد 24 ساعة من الحضانة (كما هو موضح في مرجع 20). لتحفيز خلايا المستفيدة الأخرى أو في التجارب المجراة،قد تكون جرعات OMV أخرى ضرورية ويجب أن تنشأ. تحليل تأثير L. المستروحة OMVS يمثل التقدم للبروتوكول وصفها جاجر وشتاينرت 24.
هنا، سلطة النقد الفلسطينية المتباينة THP-1 خلايا بمثابة نموذج لالضامة السنخية بسبب قلة توافر المواد البشرية الأساسية. إضافة سلطة النقد الفلسطينية تفرق في الوحيدات THP-1 الخلايا إلى خلايا تشبه البلاعم 25. وعلاوة على ذلك، فهي معروفة خط الخلية نموذج للام المستروحة يدرس 26. وإلى جانب هذا الخط خلية الوحيدات الإنسان، وتستخدم خلايا mBMDM. تحظى بقبول واسع mBMDM لدراسة آثار L. المستروحة 27، 28، 29. إمكانية استخدام بالضربة القاضية الجينية لTLRs مختلفة أو غيرها من البروتينات جعلها أداة قيمة لدراسة آثار OMV. في أوردإيه لخفض كمية من الفئران في التجربة، وتستخدم mBMDM بدلا من البلاعم السنخية بسبب القيود المفروضة على الضامة. قد يتطلب التجارب الرئيسية الضامة السنخية للمصادقة.
وبالإضافة إلى بروتوكول الموصوفة هنا لتنبيذ فائق لتنقية OMVS، فمن الممكن لإجراء الطرد المركزي التدرج الكثافة، والتي يتم تضمينها في البروتوكول من قبل Chutkan وآخرون. 30. هذا يمكن أن تحسن نقاء إعداد OMV التي تم الحصول عليها وتقليل كمية-تنقية شارك المجاميع البروتين، فلاجيلين، وLPS. نقاء إعداد OMV التي تم الحصول عليها يمكن تحليلها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ أو عن طريق تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر كخطوة تكميلية في مراقبة الجودة. هذا يمكن أن توفر وسيلة إضافية للالكمي، ما وراء إجراء قياس البروتين المقدمة هنا. اختياريا، وتركيز LPS يمكن تحليلها من خلال اختبار المحللة الليمول خلية أميبية الشكل. إذا كان العائد OMV منخفض، وهوخطوة تركيز إضافية عبر مرشحات الطرد المركزي يمكن أن يؤديها، والذي لم يحدث هنا. إذا كان العائد أقل من المتوقع، وتجاهل OMVS.
وكجزء من الجهود الجارية لتوضيح الآليات والوظائف البيولوجية وراء OMVS، يمكن اختبار تأثير ظروف الإجهاد المختلفة على إنتاج أو.ام.في. الحرمان من المواد الغذائية، والتغيرات في درجات الحرارة الحضانة، أو التعرض لعوامل ضارة قد يكون لها تأثير على OMV إفراز 31. وتناقش ظروف الإجهاد ممكنة في البروتوكول من قبل Klimentova وStulik 32. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتولد فرط أو hypovesiculating L. المسوخ المستروحة. ويمكن بعد ذلك بتحليل الاستعدادات OMV مختلفة في التجارب الإصابة الضامة، إإكسبلنتس أنسجة الرئة الإنسان (وصفه في مرجع 17)، أو حتى في النماذج في الجسم الحي. وإلى جانب دور OMVS في إشارات المناعية الفطرية، نفوذهم في الاتصال البكتيرييمكن معالجتها بشكل تجريبي. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل تأثير مختلف أجهزة الطرد المركزي إشارات المناعية الفطرية عن طريق استخدام خلايا خروج المغلوب الفئران أو توليد كريسبر بالضربة القاضية / Cas9 في خطوط الخلايا البشرية. وهذه البحوث الأساسية في OMVS يساعد في وضع استراتيجيات لقاح الجديدة، والتي توجد بالفعل لالتهاب السحايا B ينتقل عن طريق إلتهاب السحايا النيسيري 33.
بدءا من بروتوكول بشأن العزلة OMV والتوصيف، يمكن للمرء أن تطبيق هذا إلى غيرها من البكتيريا سالبة الجرام والخلايا المضيفة الأخرى؛ فإنه يحتاج فقط إلى تعديل لنمو البكتيريا في الثقافة السائل. ونشرت من قبل Chutkan آخرون البروتوكول. يوفر معلومات مفصلة عن توليد OMVS من الإشريكية القولونية والزائفة الزنجارية 30. يجب الثقافة لا تصل إلى مرحلة ثابتة في وقت متأخر من أجل تجنب الزيادات في البكتيريا هي lysed والبروتينات تلويث وذاكرةالأغشية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الجرعة OMV تستخدم لتنشيط الخلايا المضيفة يجب أن يتم تحديدها وفقا لكمية من OMVS حاضرا أثناء الالتهابات في الجسم الحي، في حين لا يزال ضمان انخفاض معدل السمية الخلوية. وبهذه الطريقة، ودور المرضية من OMVS، يمكن دراسة تأثيرها على التواصل بين الأنواع، والتفاعلات المضيف الممرض.
لمزيد من الدراسة دور L. المستروحة OMVS في الالتهاب الرئوي، وهناك حاجة الاستعدادات OMV موحدة مع عوائد كافية وتجارب العدوى قابلة للمقارنة. وهذا البروتوكول يساعد على توحيد إجراءات العزل وتوسيع نطاق الدراسات OMV للبكتيريا سالبة الجرام الأخرى وإلى الخلايا المضيفة الأخرى. وعلاوة على ذلك، سوف تستفيد البحوث من التفصيل في معرفة المختبر، والتي يمكن استخدامها لتوسيع التجارب إلى الإعدادات في الجسم الحي. في المستقبل، يمكن تمديد هذا البروتوكول إلى عزل OMVS من المواد البيولوجية الأساسية، مثل المصل أو LAV الشعبىالسائل العمر، لاكتساب نظرة ثاقبة تكوين OMVS صدر في ظل الظروف الفسيولوجية. وهذا سوف يساعد على تحديد المعايير الأساسية لتكوين OMV وفهم خصائص في المختبر OMVS -generated.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الأستاذ الدكتور ماركوس Schnare لتزويدنا TLR2 – / – وTLR2 / 4 – / – الفئران والأستاذ الدكتور كارستن Kirschning لTRIF / MyD88 – / – الفئران. وقد تم تمويل أجزاء من هذا العمل Bundesministerium FÜR بيلدنج اوند Forschung (ه: miRSys الحيوي – FKZ 0316175B، ه: ميد CAPSYS – FKZ 01X1304E، http://www.bmbf.de/)، الألمانية للبحوث (SFB / TR-84. http://www.sfb-tr84.de/)، وHessisches Ministerium FÜR Wissenschaft اوند كونست (LOEWE RNomics الطبية – FKZ 519/03 / 00.001- (0003)، http://www.proloewe.de/medicalrnomics)، كل لBS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |