Summary
这个协议描述在哺乳动物表达系统中生产的治疗性抗体的。所描述的方法包括制备载体DNA，稳定转染和人胚肾293细胞系的无血清适应的，设置大规模培养和纯化使用亲和层析组成。
Introduction
治疗性抗体的成功将继续推动大量投资进入的抗体开发为下一代疗法的浪潮开始。抗体市场预期由抗体片段1，抗体-药物偶联物2，双特异性抗体3和工程化抗体具有有利性质4重塑。另一类获得医药感兴趣的是生物仿制药。生物仿制药抗体是“高度相似”复制这种已经获得监管部门的批准治疗性抗体产品。拟议的生物仿制药必须是就其结构，功能，动物毒性，临床安全性和有效性，人体药代动力学（PK），药效学（PD）和免疫原性5,6鼻祖抗体相媲美。
批准ř生物仿制药的抗体的茨一直缓慢由于在产品的最终质量的严格限制。确切的制造过程，如通过对最终的处理步骤的特定细胞系和培养条件可以保持专有的。更重要的是，抗体的制造固有涉及程度可变性的可加至生产高度类似产品的挑战。全面理化和生物物理表征和比较是相当困难的，但许多研究表明生物仿制药的抗体的特性出现在文献7，8，9。
产生治疗性抗体便从哺乳动物宿主细胞用携带的基因的各抗体的载体的转染。载体设计，细胞系和培养条件是建立前的关键考虑因素PRESSION系统。
抗体的DNA序列可以从药物银行（www.drugbank.ca），IMGT（www.igmt.org）或研究的出版物，包括专利中采购。例如，曲妥单抗的序列，可通过药物银行（DB编号：DB00072）。可变区的氨基酸序列可经历基因设计和优化用于合成在所需宿主物种。它是没有修饰的氨基酸序列制成的生物仿制药抗体重要。一旦合成，抗体基因可亚克隆到所选择的合适的载体。
人IgG抗体由两条相同的重链和两个相同的轻链组成。两条链的紧密调节表达是用于在哺乳动物细胞10的异源抗体蛋白的最佳生产的关键。帧内以及链间二硫键必须形成和一些翻译后修饰的需要成为在蛋白质的生物合成过程中troduced。许多载体是已专为表达抗体基因（参考材料表）可用。这些特定抗体 - 载体通常表示为重链和轻链，以便仅在每个链的可变区所需要克隆的恒定区。
有两个独立的构建体（共转染）细胞的转染是用于输送重和轻链编码基因的最常见的方法。也就是说，每个基因通过其自身的启动子被组装的内质网前驱动和转录为单独的抗体链。另一方面，多顺反子载体具有掺入内部核糖体进入位点（IRES）元件，使多个基因作为与由mRNA 11的内部区域允许翻译单一的mRNA转录物的表达。在这种情况下，重链和轻链编码基因被连接在一个arrangEMENT同时实现抗体链10,12的共表达。
而瞬时转染细胞产生足够的蛋白来执行的实验的数量有限，已经经过选择基因组整合稳定转染的细胞系可以提供更高的产量。较高的蛋白质的量允许为涉及体外表征检测开发，并能提供在考虑抗体质量为下游应用的指示，如克隆细胞系和铅候选选择。
本文的目的是描述在哺乳动物表达系统中产生的治疗性抗体的稳定表达和纯化。事实上，这种方法可以适用于一生物仿制药抗体的表达。该方法可用于抗体的初始特性继续到关键的，尽管是费时STE之前确定一个理想的克隆用于大规模生产的PS。此外，这种方法可用于表达其它蛋白质，而不只是抗体。
下面的详细方案描述的治疗性抗体曲妥单抗的表达。这包括制备载体DNA随后在HEK-293细胞系和抗体蛋白质的纯化稳定转染通过自动化色谱法的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：合适的哺乳动物表达载体，必须使用该协议。这里，使用含有两个表达盒的单个构建体（ 即重链和轻链表达由单独的启动子驱动）。曲妥单抗重和轻链先前克隆到载体中。这个载体是从安德鲁Beavil的礼物，通过一个不以营利为目的质粒库13获得。
1.恢复和载体DNA的规模化发展
注：载体DNA收到大肠杆菌 XL-1蓝色株软琼脂穿刺培养;载体携带潮霉素抗性。
- 将无菌接种刺伤或循环进入穿刺培养，然后连胜75微克准备了卢里亚BERTANI（LB）琼脂平板上的软琼脂/ ml潮霉素的单菌落。孵育在37℃的板18-24小时。
- 接种单个菌落到5ml了不起肉汤（TB）的含有75微克/毫升潮霉素。 INCU大怒的文化，在37℃，18〜24小时，225转摇晃。
- 使用过夜培养轻轻用200μl80％甘油混和并冷冻在-80℃下混合800微升培养以制备载体DNA的甘油。
- 将100μl过夜培养物加至100毫升结核病含75微克/一个挡板摇瓶中（ 即 1/1000稀释）ml潮霉素。孵育在37℃下培养18至24小时，以225 rpm振摇。
- 过夜培养后，提取和纯化根据与以下异常的midi / MAXI制备试剂盒的制造商的说明将DNA;期间与水（pH 7.0-8.5）中的最后一步，洗脱或重悬的DNA。
- 检查浓度与由吸光度读数的DNA纯度在260和280nm，然后储存的DNA在-20℃。
注：可选的（强烈推荐）：DNA序列使用载体特异性引物，以确认身份。
2。 HEK-293细胞的稳定转染
- 生长并保持根据在补充有在锥形瓶中的0.1％的非离子表面活性剂的无血清培养基的标准协议HEK-293细胞（悬浮细胞）。保持在2×10 5个细胞/ ml传代培养每第四天。培养细胞在37℃，5％的CO 2和120rpm的旋转。
注：细胞应已在培养不少于4天，不超过4周前，转染。生长在含有血清的培养基单层的HEK-293细胞也可以用于此过程。 - 在转染前一天，种子的HEK-293细胞以3×10 5个细胞/在12孔平板的孔中毫升2-毫升Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）中的补充有10％热灭活的胎牛血清（ FBS）。在转染日，检查细胞达到80-90％汇合
- 稀释转染媒体DNA和聚乙烯亚胺（PEI）分别然后混合在一起。
- 稀释300微升转染媒体每孔1.25微克载体DNA（15微克的12口井）。在室温下孵育5分钟。
- 稀释的1mg / ml的PEI溶液2.5微升（30μl的12口井， 即 1：PEI的2比的DNA）在300微升转染培养基。在室温下孵育5分钟。
- 稀释的DNA添加至稀释的PEI，轻轻混合并在室温下孵育15分钟。
- 加入50μl的DNA / PEI混合物滴加至板的各孔中。轻轻摇动平板分发然后转染混合物放置板在37℃，5％CO 2的24小时。
- 加50微克/ ml潮霉素，每孔B和返回板37℃，5％CO 2的10天。
注意：通过第10天，未转染的细胞将死亡和拆卸从板的表面上，而稳定地转染的细胞将是可行的，并附着到板上。 - 在水井更换介质1/4体积的无血清培养基和3/4体积的DMEM补充有10％FBS（ 注：0.5 ml无血清培养基+ 1.5的10ml DMEM = 7.5％的最终血清浓度），并孵育4天。
- 用补充有10％FBS（ 即 1毫升无血清培养基+ 1的10ml DMEM = 5％的最终血清浓度）1/2体积的无血清培养基和1/2体积的DMEM替换在孔中的媒体并孵育4天。
- 用补充有10％FBS（ 即 1.5毫升无血清培养基+ 0.5的10ml DMEM = 2.5％的最终血清浓度）3/4体积的无血清培养基和1/4体积的DMEM替换在孔中的媒体并孵育4天。
- 用2ml补充有0.1％的非离子表面活性剂（即0％的最终血清浓度）的无血清培养基的更换在孔中的媒体并孵育4天。
注：保持无血清适应过程中50μg/ ml的潮霉素B的选择性细胞上的压力。适应于无血清培养基的细胞从孔表面分离，并且可以第一组ñ停牌。参见步骤2.1培养条件与50微克的额外补充/ ml潮霉素B. - 使用移液管，轻轻在12孔板和池细胞悬浮培养物混合到一个单独的管中。
- 使用血细胞计数器，枚举汇集细胞和种子在30毫升无血清培养基中一个锥形烧瓶中，在2×10 5个细胞/ ml。培养细胞在37℃，5％的CO 2和120rpm的旋转。亚文化，每第四天扩大。
- 继续扩大培养规模到所需细胞密度为1×10 7个细胞，以获得10小瓶/小瓶在液氮冷冻保存。冻结细胞在含有10％二甲基亚砜（DMSO）的无血清培养基。
注：空调含有抗体媒体可以在每个传代培养收获确认蛋白质生产或用于优化纯化条件。收获条件培养基和维护传代细胞，离心在文化300 XG 5分钟，然后用0.22微米的过滤器过滤消毒上清液。过滤的上清液可保持在4℃下1-2周或-20℃下长期储存。
3.大规模抗体生产批量从长满文化
注：抗体的生产可以从步骤2.11，其中现有的单元格扩展到基于批处理长满培养体积上所需的细胞密度是设置应遵循的。否则，已经从冷冻解冻细胞开始在该阶段，一旦扩大到合适的细胞密度和体积。各种培养补充剂可用于优化抗体生产;利用蛋白胨，增加抗体产量是表现在这个协议。
- 种子细胞在两个Erlenmeyer烧瓶的100ml无血清培养基2×10 5个细胞/ ml（以比较从非补充和营养补充培养抗体的产量）。文化在37 ℃，5％CO 2的
- 24小时后，加入胰蛋白胨为0.5％的终浓度向营养补充培养。均衡与无血清培养基未补充的文化音量。
- 从第8天，进行使用血球监测细胞生存力每日培养物的细胞计数。收获培养上清一次细胞存活率小于80％。
- 收获上清液通过培养物离心以3000 xg离心15分钟，然后通过0.22微米的过滤器过滤，消毒上清液（含有抗体）。存储上清在4℃（短期），或在-20°C（长期）冻结。
4.抗体纯化通过亲和层析法使用自动化快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统
注：以下步骤一般可以适用于大多数的自动化系统。纯化可在室温下或在4℃下（如果FPLC系统被保持在阴凉室）中进行。可以进行一系列的侦察测试，以找出最佳纯化条件包括适当的列矩阵，结合缓冲液，洗脱缓冲液和pH值，以确保从条件培养基纯化的抗体的最大恢复（参见结果部分）。最优条件取决于被纯化的抗体或蛋白质。纯化了一个自动化FPLC系统上进行。纯化用5ml的蛋白A柱在室温下进行。
- 使用超纯水制备下列缓冲液和调整到推荐pH值，然后通过0.22微米的过滤器进行过滤。
- 0.14 M氯化钠，0.0027米氯化钾，0.01M 的 Na 2 HPO 4和0.001摩尔KH 2 PO 4：通过混合下列制备1升磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4的（结合缓冲液）的。过滤缓冲区之前必要时进行调整pH值。
- 制成500毫升之0.1M甘氨酸 - 盐酸pH值2.7（洗脱缓冲液）的。过滤的buff前调节pH值呃。
- 准备50ml的摩尔Tris pH值9.0（和缓冲液）的。
- 确保计算机是由系统电源和通讯连接。设备应在软件“系统控制”模块可见。确保UV单元被设定在280nm波长。可选的：如果连接，也可以使用校准pH计。
- 沉浸A，B和采样泵的入口管超纯水冲洗系统。清除泵用注射器是否有空气管道或空气的系统中的一个怀疑。通过系统控制器或经由自动化的方法，通过手工操作用水冲洗该系统。观察到压力，导电性，UV280跟踪和pH保持一致，并且该列中的压力限制不超过根据制造商的规范。
注：异常可能表明空气或堵塞应该在继续之前加以解决系统。 - 在系统控制器模块，从1开始的流速毫升/分钟通过手动在任何负载泵A（绕过样品环）或注射（通过样品环）的位置，开始连接列。在列位置入口断开系统管道和删除连接到柱入口塞子。
- 允许水从系统管滴流在塔的顶部则系统管道连接到柱上。具有柱的入口和与水滴入口配件溢流确保无气泡的连接。
- 连接柱子出口的下游出口，并确认所有的配件都紧紧系住。与列现在连接至系统，如在列规范概述不超过最大压力极限和流量限制。
- 用的水5倍柱体积（CV）的洗涤塔。如果有必要，继续洗柱，直到UV280跟踪已趋于稳定。
- 沉浸A的入口管结合缓冲液，B在洗脱缓冲液和结合缓冲器T采样泵Ø平衡系统在正确的缓冲区。使用PumpWash通过手动操作缓冲填充进气管。
- 在软件的“方法编辑器”模块中，使用该方法的向导设置为，目的是要使用的柱的亲和色谱法。
注：自动化系统FPLC配方法预先填充推荐的设置（ 即流量和压力限制），并运行基于选定净化柱（制造商，矩阵和大小）的步骤。- 使用蛋白质A亲和层析以下运行步骤：
- 平衡系统用5CV结合缓冲液，并收集到流出液废物容器。
- 负载样品上柱（体积要加载手动指定的方法），并收集流过到一个单独的容器中。
- 洗系统用5CV的结合缓冲液，并收集流过到一个单独的容器中。
- 用5CV isocrat柱洗脱IC分离使用洗脱缓冲液，并收集纯化抗体样品由馏分收集器部分。
- 平衡系统用5CV结合缓冲液，并收集到流出液废物容器。
- 使用蛋白质A亲和层析以下运行步骤：
- 一旦该方法已经设置，指定的条件培养基的体积要施加到列和保存方法。
注：在该方法中指定的体积应比实际体积，以避免样品运行期间引入空气少5-10毫升。在这个协议中指定的卷是90-120毫升。 - 浸没样品泵管到含有经调节的培养基的容器中。
- 准备一个单独的容器通过指定的出口管收集样品流出液。
注：收集在运行或柱的结合能力过程中发生错误的情况下的流过液是很重要的超过需要的流过液被重新应用到列或外净化epeated。 - 在馏分收集器准备收集管。加入100微升每毫升体积分数和缓冲的。在FPLC系统将自动洗脱馏分进入收集管中。
- 在软件的“系统控制”模块，打开方法来运行。
注：该方法运行在一系列的包括检查的方法中，馏分收集器安装程序的变量和定义的结果的文件名和存储位置的页面启动。 - 点击START开始运行。运行可以在“系统控制”模块中进行监控。
- 在净化运行完成后，检查所生成的色谱系统软件的“评估”模块中。
- 将所有含蛋白质的分数到一个单独的管，缓冲交换和使用离心过滤装置与切断30 kDa的分子量在PBS集中。根据制造商的执行离心步骤说明。
- 使用根据制造商的说明双金鸡宁酸测定法（BCA）测定抗体浓度。
- 如果另一个净化运行是要执行，主要在结合缓冲液，并重复采样泵管步骤4.9-4.14。
- 在纯化轮次的完成，沉浸A，B和样品泵的入口管在超纯水中，并如在步骤3中进行清洗系统和柱。
- 淹没A，B和泵管在20％乙醇，重复洗涤程序对系统和列存储。
- 断开从下游出口列和替换柱塞，然后在入口断开柱和更换塞子，重新连接管连接到该系统。储存在4℃下的列。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用生物层干涉（BLI）转染HEK-293细胞的稳定生产单抗的结果确认， 如图1中。通过测量IgG抗体标准和蛋白质的生物传感器（ 图1A）之间的结合率产生的IgG的标准曲线。粗制上清液样品类似地测量，那么其浓度从标准曲线（ 图1B）内插。上清液的浓度测得为大约25微克/毫升双周（从传代培养收集50毫升取样）的无血清适应之后和之前为长满分批培养建立的细胞。
在每个传代培养后收集无血清适应被合并并用于优化纯化条件上清液; 如图2中进行的结合和洗脱缓冲液的侦察图2A中根据UV280信号描绘。一旦蛋白A柱达到平衡，增加UV280信号代表样品装载;此增加是由于上清液流过穿过柱（含有在此波长吸收紫外光未结合的蛋白），而抗体已经通过柱捕获。一旦样品已完成加载，UV280信号返回到基线任何剩余的未绑定的蛋白质被冲走。 pH值降低到最适pH以释放由列捕获的抗体，通过用洗脱抗体分馏并由馏分收集器收集的增加UV280信号描绘发生溶出。整个样品运行的基础上，在而系统压力缓冲器盐浓度电导率的变化应保持相对恒定。最佳洗脱，pH值和缓冲液首先被球探（ 图2B）;有人指出，抗体埃尔在任一使用0.1M甘氨酸盐酸或柠檬酸降低pH值布式更有效地关闭列。然而，在pH低于2.7有在洗脱图谱没有进一步的改善。此外，用0.1M甘氨酸盐酸洗脱峰时与在相似的pH值（ 图2B）0.1M柠檬酸相比出现较少变宽。接着，用0.1M甘氨酸-盐酸pH值2.7的缓冲，以优化结合缓冲液条件（ 图2A）。不同结合缓冲液的上洗脱的影响也进行了比较（ 图2A）。据观察，pH 7.4的PBS和20mM磷酸钠pH 7具有可比洗脱曲线，而另外3 M氯化钠的磷酸盐钠缓冲液（以增强抗体结合到列）是不利的。由于易于PBS缓冲液制备的，pH 7.4的PBS，被选定为未来的纯化的结合缓冲液。
批次的纯化的色谱图长满文化前进水库示于图3;胰为辅的文化进行比较，未补充的文化。有人指出，加入胰蛋白的补充文化导致了在装样一步增加的UV280信号，相比未补充的文化。该胰补充的文化产生了3.8毫克和未补充的文化1.7毫克曲妥珠单抗的基础上，更换缓冲液和浓缩后回收的蛋白质。纯化的抗体的质量控制是通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证实， 如图4。曲妥珠单抗在类似抗体型材未补充和胰胨 - 补充条件的结果在非还原和还原条件下生长。正如预期的那样，一个突出的波段大约150 kDa的确认正确折叠的抗体;其他带代表的抗体的片段化的形式，二硫键断裂的结果，一方法诱导artefac吨。同样地，在50两个频带和大约25 kDa的确认抗体重和轻链的存在下，分别。
图1：通过使用生物层干涉（BLI）稳定转染的HEK-293细胞的蛋白质生产的确定。 （A）中，通过测定的IgG抗体标准结合率对蛋白的生物传感器120秒（灰色），随后加入PEI转曲妥单抗的粗上清液样品产生标准曲线（PEI-TMAB;黑色）。在粗上清液中抗体蛋白（打开黑色圆圈）的（B）的浓度通过绘制IgG抗体标准浓度对结合速率从标准曲线（闭黑圈）内插。 请点击此处查看该F的放大版本 igure。
图2：洗脱色谱分离纯化，并结合缓冲液筛选实验。 （A）纯化的步骤是根据UV280信号（蓝色，绿色或黑色线）描绘;样品上样到柱上，随后用柱洗至从柱洗去未结合的蛋白质，然后结合的蛋白质的溶出。 pH值（红线），电导率（棕色线）和系统压力（灰线）的测量是在整个运行监控。三缓冲液以获得最佳的列曲妥珠单抗结合，并洗去未结合的蛋白质，最大限度地洗脱产量测试。 （B）的0.1M甘氨酸-盐酸（pH值2.5-3.3）和0.1M柠檬酸（pH值2.5-3.5）缓冲液中测试了来自蛋白质曲妥单抗的最佳洗脱列。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图3：曲妥珠单抗的纯化色谱图（TMAB）批次长满没有补充生长或辅以胰文化。稳定转染的HEK-293细胞以2×10 5个细胞/ ml，培养8天或者未补充的设置（120毫升;黑线）或补充有0.5％胰蛋白胨（90毫升;绿线）。收获后，上清液用pH 7.4的PBS（结合缓冲液）和0.1M甘氨酸-HCl pH值2.7（洗脱缓冲液）纯化。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：通过SDS-PAGE分析纯化的曲妥珠单抗。大约2微克单抗从未补充纯化的（ - ）或胰蛋白胨补充的（+）的培养物中由10％SDS-PAGE非还原或还原条件下进行采样。凝胶染色用考R-250。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议细节的转染，稳定表达和治疗性抗体的纯化在HEK-293细胞。抗体基因的稳定表达是在产生用于治疗性抗体的开发和制造的抗体产生细胞系的第一步。而中国仓鼠卵巢（CHO）细胞仍然是治疗性蛋白质的选择的表达平台，HEK-293细胞系获得突出的实现，在这些细胞中产生的蛋白质是天然存在的人类蛋白质更匹配，在后方面-translational修改和功能14,15。
哺乳动物细胞系包括CHO（ 例如 ，CHO-DG44及CHO-K1），以及非免疫球蛋白分泌鼠B细胞系NS0和SP2 / 0是主要在生物制药生产中使用。基于这些细胞系的表达系统基于选择进程内S弯由此高生产克隆被诱导，并通过增量加入特定选择药物16,17的选择。因此，对于一个稳定的克隆选择过程可以是艰巨和费时。相比于这些现有的方法中，HEK-293细胞系鲁棒高效率transfects。选择过程被简化，很容易适应于无血清悬浮培养，使其成为适用于实验室规模生产蛋白质18的一个理想的表达系统。
稳定转染的一个限制是，其中蛋白质的实际量可以制造并在实验中使用的时间。尝试和解决这个问题，目前的协议描述了一个培养步骤，可以3-6周转的内实现大量蛋白质。批长满培养（大规模生产）提供了产生大量的机会抗体在体外实验表征中含铅量高达克隆细胞系和铅候选人的挑选安装。这具有超过瞬时转染，这可能需要更高量的DNA和试剂的明显的优势。此外，由于表达只是暂时的，并通过转染效率测定蛋白质产率不从批次可重复的。
胰蛋白胨在这个协议中的另外提供了蛋白表达的增加的产量。胰转染培养物的加成先前已表明，以改善蛋白质合成19,20。在胰蛋白胨补充培养导致了40毫克/升与的14毫克/升的未补充培养物（ 图3）改进的曲妥单抗抗体产量。的SDS-PAGE验证：（1）抗体被正确产生;和（2）在加入胰蛋白胨的基于玉米没有改变结构在非还原和还原条件（ 图4）的抗体频带的型坯。加入胰蛋白胨的培养物是可选的，特别是用于实现更高的蛋白产量。其他补充剂已被认为增加蛋白质的表达，如丁酸钠和丙戊酸21，22，23。
该协议的第一个检查点是蛋白是由被转染的细胞系产生的确认。这个步骤可用于选择稳定的转化的选择性压力的两周期间之后进行的任何时间。许多方法可以用于证实蛋白质生产包括生物层干涉测量（ 图1）或IgG的ELISA法的类似的方法。或者，免疫印迹可使用抗IgG检测抗体，以确定在粗上清液中抗体的蛋白质进行或纯化样品。
其他研究人员已经表明，更高的转染效率是在含有血清的培养基24使用贴壁细胞来实现的。从动物来源补充剂的存在是不希望的生物制药生产。因此，顺序适应无血清培养基是在需要的耐心和细胞活力的仔细监测该协议的关键步骤。在这个协议中建议的4天的周转周期是一个导向，因此，如果在一定的血药浓度会遇到的问题，它建议在细胞中的前一比进行传代培养2-3次，以无血清培养基含有血清的前下一个比继续。之前设置分批培养和细胞的冷冻保存，考虑到大多数细胞系后在100％的无血清培养基3继代视为已完全适应。
之一的在纯化阶段中最关键的步骤是叔他侦察最佳条件和缓冲液，以确保该抗体的柱的有效结合，然后完全洗脱出柱（ 图2）。在每个传代培养所收集的条件培养基是用于此目的的。在这种情况下，柠檬酸的pH 3.5的洗脱缓冲液通常推荐用于蛋白A亲和层析是不适于从柱曲妥珠单抗的溶出。使用在不同pH两种不同的洗脱缓冲液的侦察实验清楚地表明，即使在pH值的窄范围内进行测试，洗脱的程度受到影响（ 图2B）。
在纯化后的抗体级分的下游处理而言，该抗体可使用脱盐柱或者通过手动或自动操作缓冲液交换。可替代地，也可以使用透析膜。最终蛋白质浓度可以由其他蛋白质定量方法，包括测量来确定在含有基于该抗体的消光系数啤酒朗伯定律推导浓度280nm的吸光度信号的。
该协议已经由HEK-293细胞的稳定转染成功生产曲妥单抗的抗体蛋白。抗体纯化和表征确认的完整性。在这个协议中，详细说明的DNA制备的步骤，稳定转染之后无血清适应，大规模生产和自动纯化可以转移到生产其它蛋白质。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
- European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
