Introduction
CF er forårsaket av mutasjoner i cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) genet som koder for en epitelial anion kanal. CF påvirker om lag 85 000 mennesker over hele verden en. Over 2000 CFTR mutasjoner er blitt identifisert ( www.genet.sickkids.on.ca ). Dette mangfoldet delvis forklarer et bredt spekter av observerte sykdoms fenotyper ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Seks klasser av CFTR mutasjoner er definert på grunnlag av deres virkning på CFTR protein ekspresjon og funksjon: (I) ingen syntese, (II) svekket handel, (III) defekt kanal gating, (IV) endret konduktans, (V) reduserte nivåer av vanlig fungerende CFTR, og (VI) svekket celleoverflaten stabilitet fire. Selv om felles CFTR mutasjoner er godt studert, CFTR funksjon og relasjon med klinisk status forbli poorly forstått på nivå med den enkelte, spesielt for den store gruppen av sjeldne "orphan" mutasjoner ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
Nylig, narkotika har blitt utviklet som målrette CFTR protein i en mutasjonsspesifikk måte. To klasser av CFTR protein-måls narkotika er nå i klinisk bruk, og har forskjellige moduser av handlingen. Potensiatorer, så som VX-770, forbedre den åpne sannsynlighet for apikalt-lokaliserte mutant CFTR, og virker direkte på deres tilsetning til celler 5. Korrektur, slik som VX-809, gjenopprette smugling av endoplasmatiske retikulum-lokaliserte misfolded CFTR og krever pre-inkubasjon med celler før effekten er observert seks. CFTR-potensiator, VX-770, er blitt registrert for fag med G551D mutasjon 7, 8, så vel som for andre åtteCFTR gating mutasjoner, inkludert S1251N 9; sammen, er disse mutasjonene båret av 5% av CF-individer. Andre kliniske forsøk har indikert at VX-770, kombinert med korrigeringsanordningen VX-809, har begrenset ennå betydelige virkninger på lungefunksjonen og fører til en reduksjon i forverring priser fag homozygote for mutasjonen F508del båret av 45-50% av pasientene 10, 11.
Vanlige kliniske forsøk for å identifisere medikament responsive fag innenfor de resterende 50% av CF-pasienter er kostbare og tidkrevende, og er ikke gjennomførbare for personer med ekstremt sjeldne CFTR genotyper. Novel, kostnadseffektive, tilpassede metoder er avgjørende for å matche det økende antall CFTR modulatorer til enkeltpersoner som frakter alle typer CFTR mutasjon. Til nå har rettssaken inkludering av pasientgrupper som bærer spesifikke CFTR mutasjoner vært ledet av studier med mutant CFTR genet transfeksjon i heterologous cellesystemer, etterfulgt av elektrofysiologiske studier i Ussing-kammere 5, 6, 12. På grunn av mangel på tilstrekkelige CF dyremodeller, narkotika effektstudier i luft-væske-grensesnittet differensiert bronkiale epitelceller avledet fra CF lunge eksplantering materialer har blitt brukt for legemiddelutvikling 13, 14, 15. Men den begrensede tilgjengeligheten av lunge eksplantering vev og invasiv undersøkelse innhente bronkial celler fra individer uten sluttstadiet sykdom hemme analysen av mindre vanlige CFTR mutasjoner og forebygge narkotikatesting i en personlig måte. For å overvinne disse begrensningene, "lett tilgang" vev, for eksempel tykktarms organoids, nese Airway celler, og luftveis celler avledet fra induserte pluripotente stamceller, blir nå undersøkt for personlige medikamentelle behandlinger.
16, 17. For den humane tykktarm / endetarm, involverer dyrkningsforholdene definerte vekstfaktorer (epithelial vekstfaktor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), og Noggin) kombinert med små molekyler (nikotinamid, A83-01, og SB202190) i en basalmembran matrise. Under disse betingelser, enkelt stamceller eller små vevsfragmenter vokse ut i lukket, cystisk, 3D-strukturer dannet av høyt-polarisert epitel med sin basal side er rettet mot utsiden. Alle celletyper vanligvis vises i sine normale forhold og posisjoner. Organoids kan utvides over lange tidsperioder etter ukentlig mekanisk ødeleggelse og re-plating. De er genetisk og fenotypisk stabil og kan lagres, slik at langvarig utvidelse og bio-bank 17. De er mottagelig foralle standard celle-biologiske / genetiske manipulasjoner og analytiske teknikker utviklet for 2D cellelinjer 18.
Vi har nylig vist at CFTR funksjon lett kan måles i kolorektale organoids i en forskolin-indusert svelling (FIS) assay 19, 20. Når de utsettes for forskolin (Fsk) eller, alternativt, til koleratoksin, organoids raskt øke sin cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) nivåer, noe som igjen resulterer i åpningen av kanalen 19 CFTR. Organoids fra friske individer, eller fra individer med CFTR mutasjoner assosiert med restfunksjon, vil deretter hovne som en konsekvens av ion og vann transport til organoid lumen, in vitro tilsvarer sekretorisk diaré. FIS responsen av kolorektale organoids ble tidligere vist å være fullt ut CFTR-avhengige, som angitt ved organoids avledet fra CFTR-null individer ennd ved bruk av spesifikke farmakologiske CFTR-hemmere 19. Store fagspesifikke datasett kan utledes innenfor flere uker etter å ha tatt en biopsi.
For FIS analysen beskrevet i detalj her, organoids dyrkes fra endetarms biopsier som kan fås i alle aldre og med bare begrenset ubehag 21. Organoids passeres ukentlig av mekanisk avbrudd i enkelt krypter som lett forsegle og danner nye organoids. For å kjøre FIS-analysen, ~ 30-80 av disse forstyrret små organoids er belagt i hver brønn av en 96-brønns plate 19. På dagen for analysen, blir organoids farget med calcein grønn, en fluorescerende celle-gjennomtrengelige fargestoff som det kan beholdes i levende celler, legge til rette for levende avbildning. Deretter Fsk, noe som øker intracellulært cAMP og derved aktiverer CFTR, tilsettes for å stimulere organoid hevelse. Potensiatorer som virker på apikal CFTR tilsettes samtidig wed forskolin, mens korrektur som gjenoppretter CFTR menneskehandel legges 24 timer før tilsetting av Fsk. Den organoid svelling er kvantifisert ved en automatisert bildeanalyse som beregner den relative økning i det totale areal av alle fluorescerende gjenstander for hvert tidspunkt ved tilsetning forskolin.
3D organoid hevelse gir fordeler og ulemper i forhold til eksisterende elektro CFTR avlesninger i 2D kultivert Airway celler i Ussing-kammere. En stor fordel er at gjennomstrømningen av den svellende analysen. Celler dyrkes og analyseres ved hjelp av en enkelt type dyrkingsmedium, og en erfaren tekniker kan kultur opptil 25 organoid prøver på en ukentlig basis, mens kvantifisering av ca 1200 datapunkter per uke i 12 pasientprøver. Vi konvensjonelt skriver en enkelt eksperimentell tilstand ved like eller tredoble målinger per plate og gjenta slike målinger på tre uavhengige inkubasjon tidspunkter. Totalt, ca 300-500 single organoid strukturer er deretter målt per eksperimentell tilstand, noe som fører til svært nøyaktige målinger av CFTR-funksjon med begrenset teknisk variasjon. Dette presisjons tillater oss å klart definere forskjeller i rest funksjon og respons til CFTR modulatorer og tillater oss å lett plukke opp genetiske bakgrunn effekter mellom pasienter bærer identiske CFTR mutasjoner 19, 22, 23, 24, 25. Datakvalitet lett kan vurderes fra mikroskop bilder. Mens FIS er fullt CFTR-avhengig, er det en indirekte effektmål for CFTR-funksjon, dens utlesning forårsaket av kobling av ione-transporten til fluid-transport. Dette i motsetning til direkte målinger CFTR funksjon i Ussing kamre, som måler transepitelial ion strømninger 26. Ussing kamre tillater velger stimulering av apikale eller basolateral compartments (som organoid analysen ikke tillater); av permeabilizing basolaterale membraner, kan den apikale CFTR-avhengig anion sekresjon selektivt målt 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All eksperimentering ved hjelp av menneskelig vev beskrevet her ble godkjent av etisk komité ved University Medical Center Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). Informert samtykke til vev innsamling, produksjon, lagring og bruk av organoids er innhentet fra pasienter ved Wilhelmina barnesykehus (WKZ) -UMCU.
| Utstyr | Konsum | Verktøy |
| Laminar Flow hette | 15 og 50 ml koniske rør | Zeiss LSM 800 - Zen 2 (blå utgave) programvare for å måle bilder |
| CO 2 inkubator | mikrofugerør | Microsoft Excel program |
| Cellekultur Mikroskop (lys / optisk mikroskop) | 0,22 mikrometer filtre | |
| sentrifuger | serologiske pipetter | |
| Rolling Shaker | Mikropipette filter tips | |
| 4 ° C rom eller 4 ° C kjøleskapet for inkubator | cryovials | |
| CoolCell Cell Frysing Container | ||
| serologisk Pipettor | ||
| Micropippette (1000, 200 og 20 ul) | ||
| Viaflo Gjenta pipette | ||
| (Live celle) konfokalmikroskop | ||
| Datamaskin | ||
| Flytende nitrogen tank | ||
| Multichannel (200 mL) |
1. Klar Reagenser for Kultur
- Basal Medium Forberedelse
MERK: Basal medium (BM) viser til Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium Hams Nutrient Blanding F-12 (Ad-DF) supplert med 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic syre (HEPES), glutamin og penicillin / streptomycin (Pen / Strep).- I en 500 ml Ad-DF medium flaske, tilsett 5 ml 200 mM glutamin, 5 ml av 1 M HEPES, og 5 ml av pennen / strep-løsninger (10.000 U / ml, 10 000 ug / ml).
- Oppbevares BM i kjøleskap ved 4 ° C i minst 4 uker.
- Wnt-3A kondisjonerte Medium Forberedelse
MERK: Wnt-3A-kondisjonert medium er gjort i huset using cellelinjen L-Wnt-3A i henhold til produsentens instruksjoner.- For høsting av Wnt-3A-kondisjonert medium, samle mediet utsatt til cellene i en uke og spinne den nede i 5 min ved 450 xg å fjerne flytende celler.
- Filtrer Wnt-3A-kondisjonert medium gjennom et 0,22 mikrometer filter og del den i 40 ml porsjoner i 50 ml koniske rør. Lagre dem ved 4 ° C i minst 4 måneder uten tap av aktivitet.
- Teste aktiviteten av Wnt-3A-kondisjonert medium i et TOP / FOP analyse ved bruk av humane embryonale nyre (HEK) -293-celler transfektert med topp- og FOP-luciferase og tk Renilla og målt med en Renilla -luciferase analysesettet ifølge produsentens instruksjoner.
MERK: TOP-luciferase er en reporter plasmid som inneholder vill-type TCF bindende regioner. Hvis Wnt-3A-kondisjonert medium er aktiv, den kanoniske Wnt signal aktivert. Beta-catenin translocates inn i kjernen til å knytte viddh TCF / LEF transkripsjonsfaktorer og aktiverer transkripsjon av luciferase reporter, indusere en økning i relativ luciferaseaktivitet når substratet blir tilsatt. Den FOP-luciferase er brukt som en negativ kontroll, fordi den TCF bindende regioner oppstrøms for luciferase-genet er mutert.
- Colon Medium Forberedelse
MERK: Utarbeide og fortynne alle vekstfaktorer og reagenser i henhold til produsentens anbefalinger. Bruk liten størrelse porsjoner en unngå fryse-tine sykluser. Funksjonelle vekstfaktorer er avgjørende for resultatene.- Forbered kolon medium (CM) ved å supplere BM med 1x B27, 1,25 mM N-acetylcystein, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastrin, 10 mM nikotinamid, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 mikrometer A83-01 , 10 uM SB202190, og 100 pg / ml av en antimikrobiell for primære celler.
- Del CM inn i porsjoner og fryse dem ved -20 ° C i opptil 4 måneder. Tine porsjoner for å forberede fullt kolonmedium (FCM) ved tilsetning av 50% Wnt-3A-conditoned medium til CM. Oppbevares FCM opp til 7 dager ved 4 ° C uten tap i aktivitet.
- For etablering av en organoid kultur fra rektale biopsier, supplere FCM med 50 ug / ml vancomycin, 50 ug / ml gentamycin, og 10 uM rho-assosiert kveil-spiral-dannende protein serin / treonin-kinase-inhibitor (RhoKi). Bruk dette mediet, kalt isoleringsmedium (IM), bare for de første to til tre dager i kultur.
- EDTA Stock Solution Forberedelse
- Fremstille 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 8, i ultrarent H2O, sterilisert med en 0,22 um filter.
- Manipulering av basalmembran Matrix
- Klargjør basalmembran matrix (BMM) i henhold til produsentens anbefaling.
- Tine BMM overnatter på is.
- Ved overføring av BMM fra flasken til et 15 ml konisk rør, brukenen 5 ml pipette og en 15 ml konisk rør på forhånd avkjølt ved -20 ° C.
- Tint, lagre BMM i et kjøleskap ved 4 ° C og inkuber på is i minst 30-60 min før bruk.
MERK: For å oppnå de beste resultatene, må BMM være kaldt og riktig blandet før innstøping krypter eller organoids.
2. Etablering Colon Organoids fra et CF pasient Biopsi
MERK: Etter vev samling, er det viktig å opprettholde prøven på is i saltvann, Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline uten Ca 2+ og Mg 2+ (DPBS), eller BM. Rask behandling av biopsier er anbefalt, men det har vist seg mulig å etablere organoid kulturer fra biopsier lagret på is i opptil 7 dager.
- La biopsier synker til bunnen av en 15 ml konisk rør og fjern supernatanten.
- Tilsett 10 ml DPBS til biopsier og pipette opp og ned 10-20 ganger ved anvendelse av en 10 ml pipette.
MERK: pipette må være pre-fuktet med BM før pipettering biopsi. - La biopsier slå seg ned på bunnen og fjern supernatanten.
- Gjenta trinn 2.2 og 2.3 4-5 ganger før supernatanten er klar.
- Tilsett 10 ml DBPS og 200 mL EDTA (0,5 M) til biopsier og plassere røret på en gynge tube plattform for 60-120 min ved 4 ° C.
MERK: Inkubasjonstid kan variere per pasient. Hvis krypter blir frigitt, blir DPBS skyet. EDTA inkubasjon kan bli ferdigstilt når krypter kan observeres under et mikroskop. - Tillat krypter å bosette seg. Kast supernatanten.
- Ta opp 2 ml av BM og legge den til en ny 15 ml konisk tube. Rist denne nye rør manuelt på en slik måte at innsiden er dekket med BM.
- Ved hjelp av en pipette pre-fuktet med BM, tilsett 2 ml DPBS til røret som inneholder biopsier og pipette opp og ned 10-20 ganger.
- La de biopsier for å bosette og overføre DPBS med krypter til den nyerør inneholdende 2 ml BM som ble fremstilt i trinn 2,7.
- Gjenta trinn 2.8 og 2.9 inntil ingen flere krypter er utgitt.
- Spinn krypter ned ved 130 xg i 5 min ved 8 ° C.
- I mellomtiden, overføre IM til sikkerhetskabinett ved romtemperatur (RT).
- Kast supernatanten og tilsett 10 ml BM til krypten pellet og gjentar trinn 2.11.
- Suspender pelleten i 1 ml av BM. Ta 5-10 mL og telle antall krypter ved øyet under et mikroskop.
- Spinn krypter ned ved 130 xg i 5 min ved 8 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 55% BMM (v BMM til v IM).
MERK: krypter resuspenderes i tilsvarende volum på 55% BMM på en krypt per mL. Dersom det ikke er nok krypter, et minimalt volum BMM er 40 pl. - For seeding, pipette 35 mL per brønn (i en 24-brønns plate). Fordel 35 ul BMM til 3-5 dråper separat for å forbedre spredningen av growth faktorer inn i BMM. Ikke lag bobler.
- Plasser og forlate platen opp ned i inkubator ved 37 ° C i minst 20 min for BMM å stivne.
- Legg 500 mL av IM per brønn og holde den i inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Oppdater medium hver 2-3 dager. Fjern det gamle mediet ved å pipettere ut med en P1000 pipette, forlater BMM faller intakt. Tilsett forsiktig FCM ved pipettering det i den side av brønnen, ikke direkte på BMM synker.
MERK: Hvis ingen krypter er utgitt i isolasjon protokollen, sentrifuger supernatanten, vask pelleten 2-3 ganger med BM, og resuspender det i BMM. Ta left vev og skjær den i små biter med en barberhøvel. Samle disse inn i et 15 ml konisk rør, sentrifuger dem, og resuspender dem i samme BMM. Hvis noen epiteliale stamceller er til stede, vil disse også generere organoids.
3. aging av Colon Organoids for vedlikehold, frysing, og forskolin-indusert Hevelse analyse (FIS)
MERK: Hver organoid kultur har sin egen dobling tid. Normalt kan colorectal CF organoids utvides 1: 3-1: 5 ganger hver 7-10 dager. Det er et godt tegn hvis spirende strukturer er observert. Colorectal CF organoids er mindre cystisk (Figur 2A - 2C) enn kolorektal normale organoids (figur 2D). For etablering og vedlikehold, organoids dyrkes i 24-brønners plater; for frysing, i seks-brønns plater; og for FIS analysen, i 96-brønn patéer.
- Aging av Organoids
- Hold BMM på is i minst 30-60 min før du bruker den.
- Hold FCM ved RT i minst en time før du bruker det.
- Merk en 15 ml konisk rør med prøven navn og en annen slange som "vasket".
- aspirer nøye mediet fra brønnene ved hjelp av en P1000 pipette uten å forstyrre BMM synker.
- Tilsett 1 ml av BM til en godt og break opp BMM faller ved hjelp av en P1000 pipette. Overfør denne 1 ml inn i 15 ml konisk rør med prøven navn.
- Vask godt med ytterligere 1 ml BM og overføre den til den samme 15 ml tube.
- Gjenta trinn 3.1.5 og 3.1.6 med 5 flere brønner (opp til 6 brønner på en 24-brønns plate vil bli vasket i en 15 ml konisk tube).
- Fyll røret opp til 12 ml med BM. Pipetter opp og ned ved hjelp av en ml pipette pre-fuktet 5.
- Sentrifugering ved 85 x g i 5 minutter ved 8 ° C.
- Kast supernatanten og tilsett 1 ml av BM til pelleten. Med samme P1000 pipettespissen, ta opp en P10 spiss uten et filter, og pipettere opp og ned 20 ganger. Kast både P1000 og P10 tips.
- Tilsett 4 ml BM med en 5 ml pipette og hold røret vippet på ca 70 ° fra vertikal til den ene siden. Pre-våte en ny P1000 tips og bland kraftig 2-3 ganger med P1000 (1 ml volum).
- Tell til ti mens resterende i tiltet stilling, samle det øverste laget nøye wed P1000 pipette, og overføre 4 x 1 ml inn i røret merket som "vasket".
- Observer organoids settling til bunnen i den vippet rør; uforstyrret organoids og større biter vil synke til bunns. Sentrifuger 15 ml "vasket" rør i 5 minutter ved 85 x g og 8 ° C.
- Kast supernatanten og tilsett den nødvendige mengde medium og BMM til organoid pellet til en sluttkonsentrasjon på 55% BMM. Bland ved å pipettere opp og ned uten å lage bobler (figur 3B).
MERK: En god tetthet oppnås ved såing 25-30 organoids i 10 mL av BMM. - Følg trinn 02.17 til 02.19.
- Aging for Frysing
- Hold BM i is i minst 30-60 min før bruk. Hold FCM ved romtemperatur i minst 1 time før bruk.
- Forbered FCM supplert med RhoKi (trinn 1.3.3).
- Ta trypsin fra kjøleskapet og la den på RT i minst 30 minutter før bruk.
- Følg trinn 3.1.5-3.1.10.
- Fjern så mye supernatant som mulig, tilsett 4 ml trypsin, og vortex i 30 sek.
- Sette røret i et varmt vannbad ved 37 ° C i 1 min og vortex kraftig i 30 sek.
- Inspisere løsningen i røret. Hvis intakte organoids er fortsatt synlige under mikroskop, gjenta trinn 3.2.7.
- Når organoids blir forstyrret, tilsett 8 ml BM å nøytralisere trypsin og pipette 10 ganger.
- Spinn i 3 minutter ved 450 xg ved 8 ° C.
- Kast supernatanten og tilsett den nødvendige mengde medium og BMM til organoids for å oppnå en 55% BMM oppløsning. Bland ved å pipettere opp og ned uten å skape bobler.
MERK: For frysing, må organoids bli seedet i et 1: 1-forhold etter trypsinering. - Seed 250 fil i en enkelt brønn i en forvarmet seks-brønns vevskultur plate, som produserer små, atskilt dråper av ~ 10 mL. Sett platen opp ned i inkubator ved 37 ° C og forlaterBMM å stivne i 20-30 min.
- Legg 2,5 ml friskt FCM + RhoKi i hver seks-brønns plate brønnen og overfører platen til inkubatoren (figur 3C).
- Aging Organoids for FIS-analysen
MERK: Avhengig av antall og størrelse på organoids, mellom 4 og 6 brønner på en 24-brønns plate er nok for såing 27 brønner i en 96-brønns plate.- Behandle organoids som beskrevet fra trinn 3.1-3.1.13.
- Resuspender pelleten i 120 pl av 50% BMM.
- Bekreft antallet organoids (30-50) i en 3 ul dråpe BMM under mikroskopet.
- Plate de organoids ved hjelp av en eneste dråpe 3 pl plassert i midten av hver brønn av en 96-brønns pate.
- Sett platen i 37 ° C inkubator i 15 min for BMM å størkne; trinn er også beskrevet i trinn 6.1.1.
4. Frysing Colon CF Organoids
MERK: OrganOID s er klar til å bli frosset ned 1-2 dager etter trypsinering og dyrking, så organoids vil likevel være liten, noe som øker effektiviteten av overlevelse etter tining.
- Tilsett 1 ml av BM og bryte opp BMM dråper ved hjelp av en P1000 pipette. Overføring til en 15 ml konisk tube.
- Vask godt med ytterligere 1 ml BM og overføring til den samme 15 ml tube.
- Gjenta trinn 4.1 og 4.2 med alle brønner.
MERK: For å unngå for mye BMM, er 3 brønner på en seks-brønns plate samlet i en 15 ml tube. - Fyll opp 15 ml tube inneholder organoids med 12 ml kald BM og pipette opp og ned med en 5 ml pipette. La røret på is i 5 min.
- Spinne i 3 minutter ved 450 xg og 8 ° C og fjern supernatanten.
- Oppløs pellet av organoids med frysemedium og pipette opp og ned til riktig resuspendere organoids.
MERK: 500 mL av frysemedium brukes for hver 100 mL av BMM. - Ved hjelp av en 5 ml pipette, overføres 0,5 ml avorganoids resuspendert i iskaldt medium til sterile kryogene ampuller.
- Overfør ampullene til en celle frysing beholder og sette det ved -80 ° C.
- Etter 24 timer overføres ampullene til lagring i flytende nitrogen.
5. Etablering av kulturer fra Frosne Organoids
MERK: Tine BMM på is og holde den på is. La BM nå RT og oppvarmes en 10 ml prøve til 37 ° C før start av fremgangsmåten i tining en kryoampulle.
- Tine ampullen hurtig ved omrøring i et 37 ° C vannbad inntil det er fremdeles en liten frosset materiale.
- Overfør tint organoids til en 15 ml konisk rør ved hjelp av en P1000 pipette.
- Umiddelbart etter, tilsett 1 ml varm BM dråpe for dråpe under rysting i bunnen av røret. Når 1 ml medium er lagt til, bland forsiktig ved å pipettere opp og ned et par ganger for å fortynne frysemedium.
- Sakte (dråpe for dråpe) legge 9 ml varm BM til konisk rør Containing de organoids. Snu et par ganger.
- Spinn cellesuspensjonen i 3 minutter ved 85 x g og 8 ° C.
- Kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten. Resuspender organoid i 90 mL av FCM supplert med RhoKi (trinn 1.3.3). Deretter legger 110 mL av BMM.
- Legg 35 ul til hver brønn i en forvarmet 24-brønns plate, slik at små, atskilte dråper.
- Overføre platen til 37 ° C inkubator, forlater platen opp ned i 20-30 min.
- Legg 500 mL av FCM med RhoKi til hver brønn og overføre platen tilbake til inkubatoren (Figur 4A - 4C).
- Når organoids har kommet ordentlig fra tining, fortynne i mer BMM slik at hver 10 mL av BMM inneholder 25-30 organoids. Denne prosedyren kan utføres 2-3 dager etter tining (figur 4D - 4G) og sikrer riktig vekst av organoid.
6. Forskolin-indusert hevelsesi (FIS)
MERK: Fsk titrering gir mulighet for måling av CFTR av restfunksjon. For CFTR modulasjon, blir organoids utsettes for en gitt korreksjons (for eksempel, VX-809) og / eller forsterker (for eksempel VX-770), avhengig av genotype. Vanligvis er VX-809 tilsatt 18-24 timer før målingen, mens VX-770 og Fsk blir tilsatt rett før målingene. Vær oppmerksom på at enkelte modulatorer (korrektorer / potensiatorer) kan binde seg til plastoverflaten av analyseplaten.
- Plating for analyse
MERK: VX-809 aksjer er porsjonert ved 20 mM og lagret ved -80 ° C. Ved tining, la på RT og beskytte mot lys.- Behandle organoids som beskrevet i kapittel 3.3.
- Ved testing av VX-809 korreksjons, fremstille en dose-responskurve i tre paralleller med de følgende konsentrasjoner: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 og 30 uM. Forbered fortynninger i FCM.
- Til den 96-brønns plate tilsettes enten 100 μ; L av FCM med de respektive VX-809 eller konsentrasjon 100 mL av FCM og inkuber platen.
- Måling av analysen
MERK: VX-770 aksjer er porsjonert på 20 mm, mens Fsk er på 10 mm; begge er lagret ved -80 ° C. Ved tining, la ved romtemperatur og beskytte mot lys.- Ta en ampulle med calcein og DMSO og la ved RT i 15 min.
- Legg 5.1 mL av DMSO til ampullen hvor calcein er gitt som et pulver, hvis uåpnet. Ellers bruker en allerede resuspendert calcein hetteglass med 2,5 mL av calcein.
- Legg 2,5 mL av calcein til 580 mL av BM i en 1,5 ml tube og merk den.
- Tilsett 10 pl av denne fargestoffoppløsning (BM + calcein) til hver brønn ved hjelp av et tilbakevendende pipette.
- Resuspender en gang med en flerkanals for å sikre at fargestoffet er godt blandet.
- Inkuber platen i en 37 ° C inkubator i 30 min.
- Under calcein inkubasjon, begynne å forberede den Fskog VX-770-løsninger, om nødvendig.
- Ved anvendelse av en VX-770 potensiator, fremstille en dose-responskurve i tre eksemplarer med følgende konsentrasjoner: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 og 30 uM. I tilfelle av en Fsk titrering, konsentrasjonene er: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0 og 5,0 uM. Forbered fortynninger i BM.
MERK: For Fsk, VX-770, eller andre rusmiddel lagt på den andre dagen, fortynninger må være forberedt på 2x endelig konsentrasjon, siden 100 ul Fsk / narkotika titrering løsningen vil bli lagt til hver brønn, som allerede inneholder 100 mL av FCM. - Overfør Fsk og VX-770 løsninger, en P200 pipette, og tips til mikroskopet rommet.
- For bildebehandling FIS-analysen, bruk en levende celle bildebehandling konfokal mikroskop utstyrt med en automatisert scenen, et oppvarmet kammer, og CO 2 flyt.
MERK: Følgende trinn viser til en bestemt mikroskop. Forskjellige oppsett bør gjelde for andre mikroskoper følge produsentensbruksanvisning. - Sett 96-brønns plate i plateholderen.
- Angi confocal innstillinger for bildebehandling.
- Forhånds live bildeverktøyet til 37 ° C og 5% CO 2 og la kammeret pre-inkuberes i minst 30 min før måling.
- Bruk "Smart oppsett" for å velge Alexa Fluor-488 spor.
- Sett 5x linsen og skanneområdet til 0,6x for å zoome ut og fange hele godt.
- Tilpasse lasereffekten og detektorens følsomhet for å muliggjøre optimal deteksjon av Calcein-grønn merket organoids over bakgrunnen. Pinhole kan økes til 130 um, og bildet midling kan settes til 2.
- Sett litt dybde på 8 og rammestørrelsen til 512 x 512.
- Bruk tidsserien muligheten til å sette måle tid, frekvens og intervaller.
MERK: Forslag til regelmessige målinger: 1 time med 10 min intervall: sykluser = 7 (Syklus 1 er T = 0). For målinger av redusert hevelse, organoids kan avbildes i opptil tre timer. - Bruk flisen muligheten til å bestemme de enkelte brønnposisjoner manuelt.
- Tilsett 100 ul av den Fsk og / eller VX-770 løsninger til de tilsvarende brønner, etter samme rekkefølge som måle. Begynn å legge løsningene i den første avbildes godt og fortsette med bilde orden.
- Starte målingen.
- Etter at forsøket er ferdig, lagre filen.
- Analyse av FIS analysedata
- Lag en "organoid analyse" makro for dataanalyse av FIS analysen ved hjelp av analyseverktøyet i en bildeanalyse programvare som gjenkjenner alle strukturer avbildes gjennom Alexa-488 spor og fyller de identifiserte strukturer for å beregne økning i total organoid området over ulike tidspunkter.
- Åpne datafilen med de oppkjøpte bildene i bildeanalyseprogram.
- Velg makro for organoid analyse. <li> Sett terskel for å balansere signal-til-støy-forholdet i en brønn ved punkt 1 og sikre at alle organoid strukturer er anerkjent og fylt.
- Sjekk inn 4-6 brønner for å se om alle strukturer er også anerkjent på tidspunktet 7. Litt endre terskelen for å sikre at bakgrunnssignaler på tidspunkt 7 ikke er anerkjent som strukturer (den spesifikke terskelen kan endre seg noe mellom eksperimenter).
- Sett kriteriene for minimal områder på størrelse med anerkjente gjenstander til 1000 mikrometer to.
- Trykk "analyse" for å starte. Analysen tar ca 3 min, avhengig av programvaren som brukes.
- Når programvaren er ferdig, går du til "Opprett bord" og velg følgende data: godt tall (tabell bør øke i denne rekkefølgen), tidspunkter, og totalt areal per brønn.
- Lagre filen som et XLM å eksportere til et regnearkprogram.
- I dette programmet beregne den relative økningen i areal per well ved å angi området for tiden punkt 1 til 100%. Beregne arealet under kurven (AUC) fra tidspunkter 1-7 per tilstand; den nedre grense av området (Y-verdi) er satt til 100%. FSK eller narkotika titreringer (X-aksen) er plottet mot AUC (Y-aksen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser en representativ frisk isolering av krypter innebygd på BMM. Krypter er fra en kolorektal biopsi av et CF emne. Vanligvis er en organoid generert fra hver krypten (figur 1A - C). På grunn av dysfunksjon i CFTR, de fleste av colon CF organoids er ikke cystisk, men snarere er kompakte og med fremspring og buddings (Figur 2A - 2B). Men noen CF organoid kulturer, spesielt med høy restfunksjon, har et par organoids med cystisk form (figur 2C), som vill-type organoid kulturer (figur 2D).
Før aging av organoids for å ekspandere kultur eller poding en FIS assay er viktig at organoids har en stor størrelse med flere buddings, som vist i figur 3A. Hvis organoids er små og uten nUMEROUS buddings da behandlet for aging, er organoid kulturen negativt påvirket. Avhengig av kvaliteten og aktiviteten av essensielle vekstfaktorer som EGF, Wnt-3A, og Rspo3 de organoids nå den ønskede størrelse på mellom 7 og 12 dager (Figur 3A). Etter mekanisk ødeleggelse, blir buddings forstyrret, og som brukes til å generere nye organoids i det følgende avsnitt (figur 3B). Ved behandling av de organoids for frysing, er det viktig at de er trypsinisert til en liten størrelse, som vist i figur 3C. Etter trypsinering blir organoids belagt for 1 eller 2 dager for å la dem komme seg fra stress av manipulasjon. Dette trinn, sammen med den lille størrelsen på de organoids, sikrer en 98% celle-gjenvinning etter tining (figur 4A).
Når organoids tines, er det viktig å ha dem i høy tetthet, slik som normalt er de tint i etlite volum (Figure4A). Etter en eller to dager i kultur, og etter å observere at organoids øker størrelse (sammenlign figur 4A til 4B - 4C), er organoids er fortynnet i et forhold på 20-30 organoids pr 10 ul BMM, noe som gir den riktige tetthet å vokse til en større størrelse. Hvis organoids er altfor utvannet, kan de sakte vekst og kan også differensiere og dø. Hvis organoids er altfor overfylt, mangel på plass eller mangel på vekstfaktorer også bremser veksten av organoids og reduserer antall buddings.
Den plettering av organoids fra levedyktige kulturer med begrenset cellulære rester bør resultere i tilstander hvor> 95% av organoids sveller ved Fsk stimulering, forutsatt at det er tilstrekkelig CFTR funksjon er til stede (figur 5A - 5B). Organoids svelle i en genotype- og narkotikaavhengig måte, somillustrert av representative bilder av organoids med to F508del alleler (figur 5A) og organoids sammensatte-heterozygote for F508del og S1251N (figur 5B), en CFTR gating mutasjon assosiert med noe restfunksjon.
For å kvantifisere svelling er samlede Calcein-grønn overflatearealer er valgt for hvert tidspunkt, og uttrykt som prosentandel av T = 0 (satt til 100%; figur 6A). Rusk og små, ikke-svellende strukturer er typisk under 5% av det totale overflatearealet. Den relative arealøkning er uttrykt pr 10 min tidsintervall, og AUC (vilkårlige enheter) målinger blir generert for hver tilstand (T = 0 til 60 min, baseline terskel satt til 100%, figur 6B). Vi har funnet AUC for å være den mest robuste, da den inneholder en viss variasjon i initiering av hevelse, samt en kurvelineær forhold utover 30-40 min på Fsk ved høy CFTR funksjonsnivåer.
figur 6C). Organoids forbundet med CFTR av restfunksjon kan nå opp til 4500 AUC-enheter etter 60 min av 5 uM Fsk stimulering i fravær av CFTR-modulatorer (200-220% overflatearealet av pre-FSK forhold). Organoid svelling når et tak på ~ 4500 AUC-enheter, antagelig på grunn av de fysiske begrensninger i organoid strukturer, det hastighetsbegrensende virkning av basolateral ionetransport, og etablering av ione-og væske-transport-homeostase under "strukket" forhold. Fsk kan titreres for ytterligere å utvide det dynamiske området av analysen på disse høye CFTR restfunksjonsnivåer for å bedre kvantifisere restfunksjon eller meget effektive Forbindelse behandling (for eksempel, som indikert av den høyere aktivitet av VX770 på svellingen av S1251N organoids ved stimulering med lavere konsentrasjoner FSK, figur 6D).
Figur 1: Etablering av CF kolorektal organoids fra biopsier. (A) Representative bilder av isolert materiale fra en rektal biopsi etter å ha blitt innleiret i BMM på isolasjons dag (passasje 0, dag 0). Utvidelse av den angitte krypten vises på panelet nederst til høyre. (B) samme krypter ble fulgt etter 7 dager i kultur (passasje 0, dag 7). Utvidelse av samme krypten presentert i panel A vises. (C) Representative bilde av den samme organoid kultur 11 dager etter å ha blitt splittet (passasje 1, dag 11). Skala barer = 100 mikrometer.
159fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder av CF kolorektal organoids stammer fra individer med ulike CFTR mutasjoner. Representative bilder av CF kolorektal organoids fra personer med F508del / F508del (A), F508del / R117H-7T (B), og F508del / S1251N (C) mutasjoner. (D) Representant bilde av en kolorektal organoid kultur fra en hvete CFTR emne. Skala barer = 100 mikrometer. Disse bildene ble tatt uten Fsk stimulering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5159 / 55159fig3.jpg "/>
Figur 3: Behandler CF kolon organoids for vedlikehold og analyse eller for frysing. (A) Representative bilder av en CF-kolon organoid kulturen ferdig til å bli behandlet for enten aging (B) eller fryser (C). (B) Etter deres mekanisk ødeleggelse, er små biter dannet, som vil generere nye organoids i neste passering. (C) Etter trypsinering, er svært små, runde organoids generert, tilrettelegge sin levedyktighet under fryseprosessen. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Etablering av et CF kolorektal organoid kultur fra frosne organoids. (<strong> A - C) Representative bilder av en CF kolorektal organoid kultur tint på dag 0 (A). Bilder fra den samme brønn ble tatt en (B) og to (C) dager etter. (D - G) Representative bilder av fortynningen beskrevet i kapittel 5.9. Når organoids har kommet skikkelig fra tining (dag 3 etter tining), de er utvannet slik at de har plass til å vokse (D). Bilder fra den samme brønn ble tatt seks (E), ti (F), og femten (C) dager etter tining. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Forskolin-indusert hevelse av CForganoids. (A og B) Representative bilder av F508del / F508del (A) eller F508del / S1251N (B) kolorektal organoids før eller etter 60 min av stimulering med Fsk (5 mikrometer) i fravær eller nærvær av VX-770 (3 mikrometer]) eller VX-770 i kombinasjon med VX-809 (3 um). Skala barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Kvantifisering Forskolin-indusert hevelse. (A) Representative bilder av organoid området utvalg av en bildeanalyse programvare for F508del / S1251N organoids før (0 min) og etter 60 min av stimulering med Fsk (5 mm) og VX770 (3 mm). Skala barer = 200 mikrometer. (B) Representative bilder av den relative arealøkning av F508del / F508del eller F508del / S1251N organoids i løpet av 60 min Fsk (5 um) stimulering i fravær eller nærvær av VX770 (3 um) og / eller VX809 (3 um). (C) arealet under kurven målinger av betingelser som er angitt i (B) (t = 60 min, referanseterskel = 100%). (D) arealet under kurven målinger av F508del / F508del eller F508del / S1251N organoids på ulike konsentrasjoner av Fsk. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra enkelt representative eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en komplett protokoll for generering, ekspansjon, frysing og tining av menneskelige kolorektal organoids. Mens vi har etablert menneskelige organoid kulturer for en tid siden 17, har det noen ganger vist seg vanskelig å etablere teknologien i andre laboratorier uten hands-on trening. Vi forventer at disse protokollene vil erstatte slik opplæring.
Wnt-3A-kondisjonert medium er en av de mest avgjørende reagenser for å lykkes i å etablere og opprettholde en langsiktig organoid kultur. Faktisk kan organoid kulturer "krasj" når de utsettes for Wnt-3A-conditoned medium med lav aktivitet. Siden Wnt-3A-kondisjonert medium er gjort i huset, er det flere aspekter som må tas i betraktning ved generering av et aktivt medium. Aktiv Wnt-3A kan bare produseres i medium med høy kvalitet føtalt bovint serum (FBS) som inneholder de riktige vekstsignaler til L-celler og stabilisering av hydrofobtWnt-3A molekyler. Når Wnt-3A aktiviteten er lav (dvs. lav topp / FOP forholdstall, se nedenfor), er det vanligvis FBS som forårsaker problemet.
Kommersiell rekombinant Wnt fungerer dårlig, så vi anbefaler ikke å bruke det som positiv kontroll for TOP / FOP Wnt reporter analysen. Forholdet mellom TOP / Renilla og FOP / Renilla er en indikasjon på Wnt aktivitet av kondisjonert medium, så en god gruppe med Wnt-3A-kondisjonert medium gir en TOP / FOP ratio høyere enn 25, i forhold til TOP / FOP verdi fra den negative kontrollen: medium ikke utsettes for wnt-3A-produserende celler. Rekombinant Noggin og R-spondin kan erstattes av Noggin og R-spondin kondisjone-medium 28, 29.
Den nåværende protokollen beskriver også en funksjonstest for CFTR-FIS analysen. Vi har nylig vist at forholdet mellom CFTR-genotype og FIS, og hvordan dette gjenspeiler publisert CFTR genotype-fenotype relasjoner innhentet fra kliniske registre (www.CFTR2.org) 25. Ved hjelp av denne analysen, ble to personer med svært sjeldne CFTR mutasjoner identifisert som organoids var lydhør overfor ivacaftor (VX-770) 25. Etterfølgende forskrivning av dette stoffet resulterte i entydig klinisk respons, fremhever verdien av FIS analyse for å matche bestemte legemidler med pasienter med sjeldne mutasjoner i fravær av data fra kliniske studier. Viktig for kvantifisering av FIS er optimale vekst- og bestemmelsesbetingelser, bare angitt med en begrenset fraksjon av ikke-svellende organoids (som regel under 5%). Høye nivåer av rusk føre til undervurdering av hevelse, som en større andel av ikke-levedyktige, ikke-hevelse strukturer er anerkjent av bildeanalyse programvare.
Sammenhenger mellom in vitro FIS svar og tidligere etablerte CFTR-avhengige biomarkører (svette klorid konsentrasjon og INTESTINAL strømmålinger) på personlig nivå var lett påviselig i våre tidligere studier 19, 25. Dette støttet tanken om at restfunksjons målinger ved hjelp av FIS på pasienter med CF kan komplettere dagens tilnærminger som en diagnostisk eller prognostisk markør i en personlig måte. Gjennomstrømningen av FIS analysen sammenlignet med andre biomarkører for CFTR-funksjon, slik som svette klorid-konsentrasjonsmålinger in vivo og tarmstrømmålinger i ex vivo rektal biopsi, gir bedre kontroll av teknisk variabilitet. Det gir også et fullt CFTR avhengig avlesning og et stort dynamisk område ved hjelp av en titrering av Fsk som nøyaktig typer rest CFTR funksjon.
Imidlertid gjenspeiler den FIS analysen ble kun virkningen av den enkelte genotype på variabiliteten av legemidlets effekt, mens modulering av CF sykdom påvirkes av mer enn bare CFTR funksjon. for drug respons, er analysen reflekterende av en potensiell vev respons. Selv om svært nøyaktig i CFTR-målingen, er human variasjon i farmakokinetikken ikke er inkorporert, i motsetning til andre in vivo 7, 8 eller direkte ex vivo CFTR målinger 32. Som omtalt tidligere, er ikke CF modifikatorer (både genetiske og miljømessige) også påvirke fenotype, forårsaker en frakobling mellom in vitro observasjoner eller CFTR biomarkører og klinisk fenotype 2. Videre er identifisering av potensielle responsive mutasjoner ved hjelp av cellelinjer 33 forbundet med mindre innvirkning på pasienter som har behov for å få en rektal biopsi for etablering av organoids.
Flere CFTR-targeting narkotika er under utvikling en. Det er forventet at kliniske forsøk ikke vil tillate en korrekt forutsigelse av klinisk effekt bdessuten økt på CFTR mutasjonsstatus alene. Som FIS-analysen måler CFTR funksjon og legemiddelrespons funksjonelt, kan det bli metoden for valg for å bestemme hvilken medikament som fungerer best for hvilken pasienten. FIS Analysen kan også være nyttig for identifisering av pasientgrupper som skal inkluderes i registreringsstudier og for utvikling av nye legemiddelformer. Stimulering av kolorektal organoids med plasma før og under behandling kan videre bidra til å kvantifisere funksjonelle mengder sirkulerende CFTR modulatorer i blodet, noe som potensielt tilrettelegge tilpasset dosering og valg av narkotika doser i kliniske studier 30, 31. Endelig kan FIS være nyttig for en bedre grunnleggende forståelse av CFTR funksjon og dens interaksjon med andre -så langt stort sett unknown- genetiske modifiseringsmidler av dens funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av HIT-CF program av den nederlandske CF foundation (NFH), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina Barnas Hospital Research Fund og CZ og Zilverenkruis / Achmea. Vi vil gjerne takke S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, og G. Berkers (Department of Pediatric Lunge, Wilhelmina barnesykehus, UMC Utrecht), og RHJ Houwen (Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina barne~~POS=TRUNC, UMC Utrecht) for nærmer pasientene og få biopsier for generering av et CF Biobank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100x | 1x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1% BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H2O | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
- Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
- Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
- Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
- Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
- Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
- Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
- Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
- Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
- Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
- Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
- Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).
