Summary
Denne undersøgelse involverer fremgangsmåder til at afsløre virkninger på en model fisk vært følgende ændring af huden og tarmen microbiome fællesskaber sammensætning af et antibiotikum.
Introduction
Det er konstateret, at antibiotika kan forstyrre den menneskelige microbiome fører til dysbiosis, hvilket betyder en mikrobielle samfund ubalance. Den mikrobiota kompositoriske ændring efter behandling med antibiotika har vist sig at sænke samfunds mangfoldighed, reducere centrale medlemmer, og ændre samfundet stofskifte, specielt i tarmen 1, 2. Antibiotikum forstyrrelse af tarmen microbiome kan reducere kolonisering modstand mod Clostridium difficile 3, 4 og Salmonella 5.
Derudover har afbrydelse af mikrobiota været knyttet til udviklingen af mange syndromer og sygdomme hos mennesker (f.eks antibiotika-associeret enterocolitis, inflammatorisk tarmsygdom, stofskiftesygdomme osv.). Antibiotika er også i vid udstrækning implementeret i landbruget som vækstfremmere ikvæg og fjerkræ produktion 6. Brugen af disse kraftfulde værktøjer er ikke uden sideeffekter, hvilket er tydeligt i den hurtige stigning af antibiotikaresistens, samt virkningerne af et afbrudt microbiome har med sin beboede vært. Mange undersøgelser har vist, at bredspektrede antibiotika forbrug har langvarige konsekvenser for struktur og funktion af mikrobiota, endnu bivirkningerne fra en antibiotika-forstyrret microbiome påvirker vært fysiologi er kun spekulationer, som endnu ikke er understøttet.
Samspillet mellem værten, mikrobiota, og antibiotika er langt fra at blive forstået i en kortfattet måde. Derfor er en enkel og mere medgørlig model er en fordel at kaste lys over de meget komplekse pattedyr system. Slimhindeoverflader hos mennesker, herunder tarmen, huser den højeste tæthed og mangfoldighed af mikrober, og også de mest intime mikrobe-vært interaktioner. Den slimhinde hud microbiome af fisk tilbud several fordele som et modelsystem. Den Teleostei (benede fisk) er en af de tidligste slægter at divergerer i Vertebrata betyder, at benfisk har både medfødte og erhvervede immunforsvar, der har co-udviklet et forhold med kommensale bakterielle samfund 7. Fiskeskind deler mange karakteristika med type 1 slimhindeoverflader hos pattedyr, såsom fysiologiske funktioner, Immunity komponenter og arrangement af slim-producerende celler 8. Den eksterne placering af fiskeskind slimhindeoverfladen tilbyder en microbiome let at eksperimentelt manipulere og prøve.
Den vestlige mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), er en model fisk, der har været anvendt i fortiden for at studere parring og toksikologi 9, 10, 11. I betragtning af den lille størrelse, befolkning overflod i naturen som en invasiv art, m inimal pleje omkostninger, og hårdføre natur, har vi udviklet G. affinis som en slimhinde microbiome model. Endvidere Gambusia deler fysiologi for at føde levende unger med viviparous pattedyr, hvilket er usædvanligt i fiskearter. Vi afsluttede den mest omfattende undersøgelse på det tidspunkt, fiskeskind normal mikrobiota hjælp 16S profilering med Gambusia 12. Yderligere arbejde demonstrerede tre negative virkninger på værten efter afbrydelse af huden og tarmen mikrobiota ved hjælp af en bredspektret antibiotikum 13.
Fem forskellige effekter blev undersøgt i fisk efter antibiotisk eksponering. Den mest veletablerede vært gavn for microbiome er konkurrencedygtig udelukkelse af patogener. Fiskene patogen Edwardsiella ictaluri vides at forårsage udbrud af enterisk septikæmi i kommercielle havkat gårde 14. E. ictaluri har også vist sig at letalt inficere zebrafiskclass = "xref"> 15, 16 og Gambusia 17. En udfordring med dette patogen fra vandsøjlen kan tjene som et mål for udstødelse. Som en sammenligning med modtagelighed for en individuel patogen, blev overlevelse under eksponering for en høj tæthed af blandede organismer også udført. Afføring og organisk-rige jord blev brugt som almindeligt stødt kilder til mikrobielle samfund.
En anden etableret rolle den bakterielle tarm samfund udfører behandler næringsstoffer og energi høst, hvilket påvirker den samlede ernæringsmæssige optagelse for værten. Som en grov måling af ernæring, blev fisk kropsvægt sammenlignet før og efter en måneds blive fodret en standard kost. Antibiotika-behandlede fisk som et gennemsnit tabt vægt, mens kontrol fisk i gennemsnit taget på i vægt i løbet af måneden. Mekanismen for denne mangel på vægtstigning er uklar. En mulig årsag hertil er transittid af fødevarer i tarmen. En GI motiheden metoden blev tilpasset fra zebrafisk (Adam Rich, SUNY Brockport, personlig kommunikation) til at bestemme transittid. Det er endnu ikke blevet fastslået om antibiotika-behandlede fisk har en ændret transittid.
En fælles udfordring oplevet i det naturlige miljø ved alle organismer, især fisk, er osmotisk stress. Gambusia har vist sig at hurtigt at tilpasse, når akut understreget i høje koncentrationer af saltholdighed 18. Overraskende fisk med et antibiotikum-ændrede microbiome udviste sænket overlevelse til en høj salt stress. Mekanismen for denne roman fænotype er under efterforskning. En anden almindelig stress på vanddyr, især i akvarier, er giftige former af kvælstof (ammoniak, nitrat og nitrit). Overlevelse mod nitrat var ikke signifikant forskellig mellem antibiotikum-behandlede og kontrol fisk. De metoder, der præsenteres i dette manuskript kan anvendes med Gambusia eller lignende fisk modelorganismer, såsom zebrafisk og Medaka, at måle fænotyper i fisken følgende eksperimentelle manipulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
blev udført Alle eksperimenter dyr under godkendelse af IACUC protokoller, nummereret 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, og 14-04-17-1018-3-01.
1. Animalske Collection, håndtering og Etisk Care
- Saml Gambusia affinis fra marken webstedet (identifikation guide på http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) ved hjælp af en lille dip net og sted i 19 L spande. Brug visuel inspektion for at identificere arter.
- Rest fisk til 1 - 2 ud d i en spand med dam vand. Bagefter overføre fisk i 76 eller 189 L akvarium tanke fyldt med halv dam vand / halv postevand ved 25 ° C, tilsat kulsyre med en boblende airstone. Brug en lille dip net ved håndtering fisk som til minimalt forstyrre deres hud microbiome.
BEMÆRK: Fisk tæthed bør ikke være højere end 20 fisk / 38 l akvarium vand. Fisk er akklimatiseret til akvariet i mindst 5 d før eksperimenter. - Foder fisk på en daglig regime med 5 mg flake mad per fisk. Hold fisk med en 12 timers lys / 12 timer mørke-cyklus.
2. Indledende Antibiotika Eksponering for alle eksperimenter
- Tegning alle fisk fra hvert forsøg fra den samme akvarium, placere i to separate grupper (behandlet: udsættes for antibiotika & kontrol: ueksponerede) i 19 L spande. Tidligere data indsamlet viser, at fisk i samme akvarium har homogeniserede hud microbiomes der har lidt variation i samfundet sammensætning. 12
- Ved forsøg, holde fisk i 2 I kunstig dam vand (APW; 0,33 g / l CaCl2, 0,33 g / l MgSO4, 0,19 g / l NaHCO3), der steriliseres ved autoklavering før brug.
- Forbered rifampicin antibiotikum stamopløsningen ved tilsætning af 50 mg / ml i dimethylsulfoxid (DMSO). Rifampicin er et repræsentativt bredspektret antibiotikum, som er ikke-toksiske for fisk. Hos mennesker og mus, den fordeler sig godt i vævene.
- Fra rifampicin lager administrere en endeligkoncentration på 25 ug / ml i 2 I APW for antibiotisk eksponering af den behandlede fisk gruppe i 3 dage. Bemærk, at efter 3 d, dyrkbar hud bakterieantal tilbage svarende til den i forbehandlet fiskeskind.
- Parallelt hermed holde en gruppe af ubehandlet fisk i APW og giver en ækvivalent mængde af DMSO (0,5 ml pr liter APW) til vandsøjlen til at fungere som en kontrolgruppe.
- Som eksperimenter har til formål at måle virkningerne af et antibiotikum-ændrede microbiome på fisk fænotyper, for at undgå virkninger direkte fra selve antibiotikum, efter den tre dage antibiotikum eksponering (eller kontrol) periode, overførsel fisk i en spand med 2 I frisk APW.
- Brug en 10 timer hvileperiode så antibiotikum fjernes ved ligene af fisken. Base denne elimination tid på eksperimenter, hvor fiskene blev udsat for 25 ug / ml antibiotikum i tre dage. Aflive fisken ved snipping rygmarven efterfulgt af rygmarvsstødning, homogeniseres hele kroppen under anvendelse af en vævsformaler.
- Bestem antibiotikum tilstedeværelse anvendes 50 pi af denne suspension efter 0,2 um filtrering ind i midten af en agar petriskål. Lave hul til denne suspension ved at trykke en på hovedet steril 200 uL pipettespidsen i agar, som fjerner en lille prop.
- Brug agarplader med 20 ml målte volumen af næringsagar, og fordeles jævnt ved hjælp af en vatpind med en indikator organisme, Bacillus subtilis, som er følsom overfor rifampicin. Hent den B. subtilis fra et næringsstof agar inkuberet ved 25 ° CO / N og bruge vatpind til at få en koloni. Observere en zone af inhibering efter inkubation natten over ved 25 ° C indikerer tilstedeværelsen af antibiotikum i fiskevæv.
3. microbiome Extraction
- Uddrag en hud microbiome prøve fra de ydre mukosale epidermis ved at placere fisken i en steril 15 ml konisk rør fyldt med 2 ml sterilt PBST (137 mM NaCl, 10 mM phosphat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) -opløsning og vortexbehandling ved en indstilling på 10 i 1 minut med intervaller 10 s Midlertidig standsning. Detergent og salt i bufferen fremmer jævn fordeling af bakterier i opløsning. Sammenlignelige resultater blev fundet med 0,85% saltvand, men sænkede kimtal med rent vand.
- Overfør fisk fra konisk rør til et opsving spand. Letalitet huden ekstraktion er typisk lavere end 10%. Enten, analysere den bakterielle suspension i røret umiddelbart efter ekstraktion eller pelletere bakterierne ved en 2 min centrifugering i en centrifuge ved stuetemperatur ved 15.000 xg og opbevares ved -80 ° C til fremtidig analyse.
BEMÆRK: Alt kultur og biokemiske analyser er øjeblikkelig; DNA eller protein-ekstraktion kan være fra frosne prøver. - At opnå en gut microbiome prøve, først placere fisk i en steril petriskål. Aflive fisken ved overskæring af cervikal rygmarv direkte bag hovedet med kirurgiske sakse, efterfulgt af rygmarvsstødning, Og derefter eksternt sanitize kroppen med 70% ethanol klude.
- Efter dissektion, fjerne hele tarmen ved at skære efter spiserøret og før anus.
- Skær tarmen i små sektioner 1 - 2 mm i længden og placere alle sektioner i to ml PBST opløsning i en konisk rør. Efter hvirvelbehandling i 1 min, fjern supernatanten til et andet rent rør (tage forsigtighed for ikke at udarbejde gut sektioner).
BEMÆRK: Supernatanten indeholder ekstraherede tarmbakterier, der enten kan anvendes ved direkte analyser eller pelleteret ved den tidligere metode nævnt for hudprøver.
4. Infektion Model Forberedelse og bad om en SPF
- Opnå en infektiøs stamme af Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) og holde kulturen opbevares ved -80 ° C. Strain 93-146 anvendt i denne undersøgelse, isoleret fra en inficeret havkat, blev opnået fra Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University.
- streak E. ictaluri lager på et selektivt & differentielle medier kaldet E. ictaluri medier (EIM) agar 19 til dyrkning af bakterier og inkuberes i 2 dage ved 27 ° C.
- Overfør en ren isoleret koloni fra kulturen og inokulere en 150 ml kolbe indeholdende 40 ml næringsmedium (NB; 5 g / l pepton, 4 g / l kødekstrakt). Sted kolbe i et rysteapparat indstillet til 150 rpm i 2 dage ved 27 ° C.
- Efter inkubation fortyndes en prøve af kulturen i PBST til et spektrometer læsning på 0,2 OD ved 650 nm for at kalibrere E. ictaluri kultur for ønskede mængder infektiøs dosis.
- Næste overførsel både behandlet (efter 3 d af antibiotika eksponering) og ubehandlede fisk grupper i individuelle plast gelé, der indeholder 130 ml frisk kunstig dam vand, eller APW i ca. 10 timer for narkotika clearance fra fiskevæv.
- Så fra begge grupper, overføre igen hver fisk i 8-ounce plast gelé, der indeholder 130 ml ren APW. Giv hver fisk en dødelig dosis indeholder 2,8 x 10 6 CFU / ml E. ictaluri kultur i APW (badekar infektion model) og holde i en 27 ° C inkubator i 24 timer.
- Efter E. ictaluri bad, overføre fisk individuelt i nye kopper med 130 ml af APW.
- Efter vand udskiftning, rekord fisk dødelighed over varigheden af en uge. Fisk er ikke fodres i denne periode. I modsætning til havkat, Gambusia viser ingen ydre tegn på infektion, derfor er det vigtigt at anvende letalitet som en eksperimentel endepunkt.
5. polymikrobielle Challenge med afføring & Jord
- afføring Behandling
- Opnå friske menneskers afføring fra en rask frivillig emne, der ikke har fået antibiotika i de foregående to uger, ved hjælp af sterile handsker og en steril 50 ml konisk rør.
- Ved indsamling, samle fecal sagen i en steril plasticpose og derefter overføre i en steril 15 ml conical rør. Opret en bestand koncentration ved at suspendere afføring i PBST til en stamopløsning på 500 - 800 mg / ml. Denne tykke blanding er bedst at overføre anvendelse af en 1 ml eller større plast pipettespids, der er blevet skåret i bunden med steril saks, således at åbningen er større.
- Efter initial antibiotisk eksponering af behandlede og kontrol ubehandlede fisk grupper, adskilt i individuelle plastikkrus indeholder fækal suspension ved endelige koncentrationer af enten 15 mg / ml eller 10 mg / ml i APW med en samlet volumen på 130 ml. Hold kopper i en inkubator ved 25 ° C.
- Optag fisk dødelighed under fækal eksponering ved tæt observation over 2 d.
- jordbehandling
- Samle 1 - 2 kg af rige organisk muld (bør indeholde den højeste tæthed og mangfoldighed af mikrober) ca. 7 - 15 cm ned i dybden og anbringes i en ren plastikbeholder. Bemærk, at jorden skal bruges inden for to dage efter indsamlingen.
- directly efter periode indledende eksponering, adskille de to grupper af antibiotika behandlede og ubehandlede fisk i individuelle plast gelé, der indeholder 18,2 g jord i 130 ml APW. Bland jorden i vand godt i hånden før tilsætning fisken. De fleste af de partikler ikke suspendere og bo på bunden af koppen.
- Expose fisk til en varighed på 3 d ved 25 ° C, og registrere enhver dødelighed.
6. Osmotisk stress Challenge
- Efter rensning efterfulgt af en 10 h hvileperiode som beskrevet ovenfor, individualisere fisk i separate kopper indeholdende NaCl ved 17,5 mg / ml (300 mM) i 150 ml APW. Dette er halvdelen af den typiske saltindhold i havvand, som ikke er fuldt letal (<50%) til at styre fisk, men er stærkt belastende, som kræver effektiv osmoregulering.
- Observeres for dødelighed fisk over en varighed på 36 timer.
7. Nitrat Toksicitet Challenge
- Rest fisk for en 10 timers periode efter antibiotika udstillingerure, og derefter separat fisk i individuelle gelé, der indeholder en natriumnitrat koncentration af enten 10 mg / ml (118 mM) eller 17,5 mg / ml (206 mM) i 130 ml APW.
- Optag for dødelighed end 4 d for lav dosis og en d for høj dosis.
8. Vækst Analyse af Individualiseret eller Grupperet fisk
- Komplet antibiotikum eksponering eller kontrolperiode 3 d som grupper i spande.
- For Individuel, fylde 8-oz Styrofoam kopper med 150 ml APW hver, overføre et enkelt fisk i koppen og registrere kroppens samlede vægt for første vurdering.
- Gentag for alle fisk i både behandlede og ubehandlede grupper. Brug hvide Styrofoam kopper i stedet for klare plastikkrus, fordi fiskene ikke vil spise, når i det klare cups.
- Foder fisk dagligt med standard kost af to piller pr fisk. Pellets blev brugt i stedet for flager, fordi pellets har lav varians i individuelle masse (3,53 ± 0,42 mg hver, eller 8% variation), resulting i fisk modtager tilsvarende mængder af mad. Overvåg forbruget ved visuelt at registrere levnet pellets. Forbrug satser var typisk over 80%.
- Ved slutningen af hver uge i 4 uger, bestemme fiskens vægt. Forbered en ny kop med frisk APW, placere på en balance, og derefter optage vægten. Derefter hældes en fisk i en dip nettet fra den oprindelige bæger og overføres til det nye bæger, som derefter vejet igen. Fisk ikke håndteres for at undgå stress.
- For grupper, placere 2 L af APW i en 19 L spand og tarere skalaen. Hold fisk sammen i begge grupper ved overførsel til nye APW spande derefter optage totalvægt gruppe. Optag fisk gruppe vægt hver uge over en måned tidsperiode ved at overføre til en ny spand.
9. Gut Transit Time
- Brug fluoresceinmærket 70 kDa anionisk dextran. Dextran er ikke signifikant fordøjet, og er for stor til at blive absorberet over tarmen lag, således passage vil måle transittid gennem tarmen.Mærket dextran blev indarbejdet i fiskefoder.
- I et sterilt 1,7 ml rør, tilsæt 360 pi sterilt deioniseret vand og 52 mg af gelatine (13% opløsning), og glasset anbringes på en 60 ° C varmeblok indtil gelatine smelter og er helt opløst.
- Grind guldfisk food flager til et fint pulver under anvendelse af en morter og støder, og der tilsættes 40 mg af denne pulver til røret, sammen med 20 pi fiskeolie. Efter blanding tilsættes 1,6 mg FITC-dextran.
- Doser den varme væske blandingen i 20 uL dråber på Parafilm på laboratoriet bænken, og lad dem hurtigt afkøle og størkne. Dråber kan opbevares i op til 4 d, før de bliver for svært for fisk at spise. Store dråber i køleskabet ved at placere Parafilm på halvdelen af en petriskål, som derefter flød på sterilt vand i en forseglet plastbeholder, der holder dråberne befugtet.
- Lige før fodring, kvart dråber i sektioner ved hjælp af et barberblad. Akklimatisere fisken til Styroskum kopper individuelt i 2 dage uden fodring (Bemærk: Kun ueksponerede kontrol fisk blev brugt). Placer fire kvartaler i maden i koppen med fisk, og observere fiskene i 30 minutter for hvor mange stykker af den mad, de hver spise.
- Til at begynde overvågningsperioden, overføre fisk individuelt i kopper med 80 ml APW bruger en dukkert nettet. Hver 2 timer Rotér forsigtigt APW i hånden, og derefter tage en 1 ml prøve og opbevar det i en mærket 1,7 ml rør ved 4 ° C. Tag prøver i 36 timer.
- Optag fluorescens, med et fluorescens-spektrofotometer, af alle prøver samtidigt efter afslutning af assayet. Placere hele 1 ml prøve i en kuvette, og registrere fluorescensen målt ved anvendelse excitation ved 495 nm og emission ved 520 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En samlet skematisk diagram af eksperimentelle system anvendt til at undersøge fisk host effekter fra antibiotikum eksponering 13 er vist i figur 1A og omfatter teknik til ekstraktion af huden (figur 1B) og tarm (figur 1C) microbiomes fra fisken. Tre dage blev valgt som antibiotiske periode for eksponering, fordi tidligere data viser, at mens den samlede hud dyrkbar antal dråber tidligt i behandlingen, har det vendt tilbage til niveauet før behandlingen efter 3 d. I mellemtiden, samfundet sammensætning, som bestemt af 16S profilering, er blevet stærkt ændret. Derfor bør 3-dages periode være optimal til at analysere effekterne fra et ændret samfund af omtrent samme massefylde. Bemærk, at kultur analyse, ved anvendelse af koloni-numre på agarplader, kan udelade en række arter. Effektivitet af huden microbiome dispersion metode (figur 1B 4 - 10 5 CFU / g fiskens vægt) til koloni nummer fra flere fisk underkastet samme procedure suspensionen en anden gang (at kvantificere eventuelt tilbageværende bakterie). Tællinger fra denne anden suspension var lavere end 100 CFU / g, hvilket tyder suspensionen metode er effektiv (ikke offentliggjort).
Fisk med et antibiotikum-ændrede microbiome syntes at være mere modtagelige for et E. ictaluri infektion end kontrol fisk (figur 2). Forskellen i gennemsnitlige tid til død 56,1 ± 15 timer for den behandlede fisk og 98,5 ± 48 h for kontrol fisk var ikke statistisk signifikant (to-halet t-test, p = 0,12). Dette skyldes sandsynligvis den lille gruppe størrelse (behandlet n = 6, kontrol n = 5). Gruppestørrelser på mindst et dusin anbefales derfor. En fordel ved denne infektion model er den bath protokol, som ikke kræver nåle til infektion eller sporing af fødeindtagelse. E. ictaluri naturligt invaderer havkat fra vandsøjlen. Sikkerhed er høj, fordi E. ictaluri er temperaturfølsomt, og dermed dårligt sygdomsfremkaldende for mennesker. Andre studier har vist, at tiden til døden i G. affinis korrelerer med den initiale dosis af bakterier. Inkubationen temperatur på 27 ° C blev valgt som optimale for både bakterier og fisk.
Behandlede eller kontrol fisk havde ikke signifikante forskelle i overlevelse i vand forurenet med høje tællinger af blandede mikrober. Ingen dødelighed observeredes over 4 dage for kontrol (n = 8) eller behandlede (n = 9) fisk, når jord blev anvendt som den mikrobielle kilde. Mens nogle dødelighed gjorde forekomme med menneskelige ekskrementer som kilden til mikrober (tabel 1), antibiotisk behandling gjort nogen forskel. Når koncentrationen af afføring i APW var ved 20 mg / ml 40 - 50%af fiskene døde. Koncentrationen af opløst oxygen var kun 10% (sammenlignet med> 80% i spande eller akvarier), således de hypoxiske betingelser forvirrede fortolkningen. Når / ml blev anvendt lavere niveauer af 16 eller 10 mg blev overlevelsesrater matchede (tosidet Fishers eksakte test, p = 0,95 eller større for en forskel mellem grupperne). Opløst ilt niveauer i disse to forsøg var 65% eller derover. Gambusia er et meget hårdføre invasive arter, der kan leve i lav kvalitet vand. Det ville være interessant at anvende disse analyser af naturlige mikrobielle eksponering til at måle overlevelse af andre arter mod en udfordring af forurenet vand. Prøver af vand fra specifikke miljømæssige steder, især dem udsat for eutrofiering, kunne anvendes i en lignende analyse, selvom vandkvalitet (opløst O 2, nitrat, saltholdighed, osv.), Vil skulle fastlægges, som en potentielt confounding faktor.
Fish exposed overfor rifampicin var mere modtagelige for osmotisk stress end kontrol fisk (figur 3). Log-rank test observeret en signifikant forskel (p = 0.049) i overlevelsesraten (43% død i kontrolgruppen og 88% død i behandlede gruppe, n = 9 for begge grupper) ved udsættelse for forhøjede saltindhold. Resultater fra denne analyse er aftalt med en bestemmelse af 18,1 mg / ml som LC 50 for NaCl med G. affinis på 24 timer i ferskvand 20. Tegn på saltvand stress, fisk udviser omfatter rødme omkring gællerne og faldt svømning bevægelse. Med dette assay, saltholdighed niveauer over 18 mg / ml resulterede i hurtig fisk død.
Når de udsættes for toksinet nitrat i vandsøjlen, havde præ-eksponering for antibiotika ikke påvirke overlevelse (tabel 2). For hvert forsøg blev døden indspillet i både en kort og lang tid punkt, der repræsenterer akutte og mere kroniske effekter. koncentrationenaf 10 mg / ml blev valgt baseret på det bliver LD 50 for G. affinis i ferskvand ved 48 timer 21. Resultater fra dette assay var i overensstemmelse med dette LD 50 værdi, med en 50% dødelighed i begge behandlingsgrupper og kontrolgrupper efter 90 timer. En højere udfordring af nitrat (17,5 mg / ml) blev også undersøgt, hvilket fører til mere hurtig død. Igen var der ikke forskel i behandlingsgrupper. Nitrit er dramatisk mere toksisk end nitrat til G. affinis, med en LD 50 på 0,0015 mg / ml ved 48 timer 22. Fællesskabet biokemiske analyser ved hjælp af den analytiske profil indeks-system (ikke offentliggjort) viser, at fiskeskind mikrobiota har potentiale til at reducere nitrat. Men nitrit niveauer i APW løbet begge forsøg forblev under detektionsgrænsen (0,001 mg / ml). Denne udfordring metode kunne bruges med alle små opløselige kemikalier.
Når individualiseret i kopper og fodret than samme beløb til hver fisk i en måned, blev der en tendens til antibiotika-behandlede fisk til ikke tager på i vægt samt kontrol fisk, uden en statistisk signifikant forskel (data ikke vist). For at undgå stress af individualisering, blev fisk opstaldet sammen som en gruppe for behandlet og ubehandlet fisk i skovle til en måned og givet matchede mængder mad. Begrænsningen af dette setup er, at fisken ikke kan modtage den samme mad på et individuelt grundlag. Men i gruppen model, behandlede fisk i gennemsnit tabte vægt og kontrol fisk i gennemsnit taget på i vægt (tabel 3). Mængden af mad fiskene var forbrugende syntes ikke at være påvirket af forudgående antibiotisk eksponering, så appetit undertrykkelse er en usandsynlig kandidat forklaring på manglende vægtøgning. Talrige andre faktorer kan bidrage, herunder ændringer i betændelse i tarmen, niveauer af slimproduktion, gut permeabilitet og / eller tarmmotilitet. En væsentlig fordel ved dette assay til måling nutritiOnal effekter er enkelhed. Det er billigt, og kræver kun et laboratorium balance som instrumentering. Den er velegnet til at screene for en virkning, der fører til anden impliceret eksperimenteren at bestemme mekanismen.
Et eksempel faktor til at undersøge i forbindelse med fisk vægtforøgelse er mad transittid, som er relateret til tarmmotilitet. FITC-mærket dextran kan inkorporeres i gelatineret fødevarer og er ikke-letal på fisken. Måling af fluorescens i det omgivende vand med tiden er et mål for hvor hurtigt FITC-dextran passerer gennem tarmen. Kan detekteres fluorescens over baggrund, så snart 2 timer, med en maksimal nået efter 16 timer efter fodring (figur 4). Dette resultat er med kontrol fisk fra et akvarium. Pålidelige resultater fra antibiotika-behandlede fisk er endnu ikke blevet opnået. En begrænsning ved denne procedure er, at en 2-d sulteperiode er påkrævet for fisk at spise fødevarer. en adv Antage af protokollen er høj følsomhed (lav baggrundsfluorescens), som fisk spiser kun én mad sektion kan give resultater, selv om data er mere konsekvent, når to sektioner er spist. Denne protokol er mindre kompliceret end en tilsvarende og dødelig metode til mus 23.
Figur 1: Skematisk oversigt over den fælles forsøgsprotokol. A er et rutediagram illustrerer, venstre mod højre, fisk overført fra akvariet tank, adskilles i antibiotika-behandlet (ved rødt vand) eller kontrol (blå) grupper, og derefter placeret i individuelle kopper at spore fænotyper. B og C viser processen med at udvinde fiskene hud og tarm microbiomes. Efter hvirvelblanding, er bakterier suspenderet i opløsningen til analyse af det mikrobielle samfund.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: patogenfølsomhedsresultater. En overlevelse kurve under eksponering for E. ictaluri for fisk pre-behandlet med rifampicin (rød linje) eller en ubehandlet kontrolgruppe (sort linje) fisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Modtagelighed for Osmotisk. En overlevelse kurve under eksponering for høj saltholdighed for fisk i både antibiotika-behandlede og ubehandlede grupper. please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fødevarer Transit Time. Fluorescens over tid i vandet fra to fisk fodret FITC-dextran. Fish A spiste to gelatine fødevarer sektioner og fisk B spiste en. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Modtagelighed for High Microbial miljøer. Udsættelse for menneskelig afføring blev vurderet ved 3 forskellige koncentrationer. Dødsfald-forhold x: y viser det samlede antal fisk døde på det angivne tidspunkt punktet x sammenlignet med det samlede antal fisk i forsøgsgruppen y.
Tabel 2: Nitrat Toksicitet Challenge. Optaget tid dødelighed fisk i behandlingsgrupper og kontrolgrupper hele eksponering for et giftigt nitratkoncentration. Dødsfald-forhold x: y viser det samlede antal fisk døde på det angivne tidspunkt punktet x sammenlignet med det samlede antal fisk i forsøgsgruppen y.
Tabel 3: Vækst Analyse. Ændringer i den samlede kropsvægt efter en måned efter antibiotikum eller kontrol behandling. Den procentvise forskel i indledende gennemsnitlige kropsvægt (for fiskene i at forsøgsgruppen) i forhold til den endelige gennemsnitlige kropsvægt er kolonnen Δweight. N er antallet af fisk i denne gruppe. Den gennemsnitlige vægt pr fisk ved udgangen af forsøget er undervægtige / fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nogle udfordringer kræver en hvileperiode i ren APW efter antibiotisk behandling for stof til at være udtømt i fisk væv. Hvis hvileperioden springes derefter antibiotisk tilstedeværelse kan forvirre resultaterne, især når assay involverer udsættelse for bakterier. For at undersøge effekter fra en ændret microbiome sammensætning uden store ændringer i det samlede antal af mikrober på værten, indledende forsøg overvågning microbiome sammensætning (16S profilering eller hele genomet sekventering) og befolkningstæthed (16S kvantificering via qPCR) under antibiotisk eksponering ville være påkrævet. Mens 3 d er optimal i dette system, ændre værten og / eller antibiotika ville kræve rekalibrering.
Typisk for biomedicinsk forskning, er musemodellen almindeligt anvendt til microbiome studier. Den mest almindelige fisk model er zebrafisk. For at få en bedre forståelse af de universelle egenskaber af strukturen og funktionen af slimhinde Microbiomes og vært interaktioner, nye og atypiske modeller er en nødvendighed. Vores WT fisk model fungerer som en autentisk kilde til at studere host-microbiome interaktioner ved at inkludere naturlige vært genetiske variation, som andre modeller har tabt på grund af generationer af lab-hævet dyr indavl 24. En stor eksperimentel fordel ved Gambusia er deres hårdføre karakter, tolerere en lang række betingelser. Høje overlevelsesrater er blevet observeret i vand, der varierer i temperatur (4 - 38 ° C), saltindhold (0 - 17 mg / ml), opløst oxygen (110 - 25%), og pH (4 - 8). Dette tillader ikke kun at undersøge mange miljøbetingelser, men også for flere trin eksperimentelle fremgangsmåder, der ofte er for stressende for andre fiskearter.
Procedurerne præsenteres her er egnede til hurtig screening for at opdage værten effekter fra en bestemt behandling. Opfølgende undersøgelser er at bestemme direkte årsagssammenhæng og mekanisme. Eksempel extension Studies for fisk microbiome værten virkninger omfatter: måling tarmbetændelse, undersøgelse af fisk sundhed ved at kvantificere fedtdepoter, og måling af mucus niveauer på huden og i tarmen. En gnotobiotiske Systemet udvikles til at studere i detaljer links til specifikke mikrober til bestemte vært fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
References
- Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).
- Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
- Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
- Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
- Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
- Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
- Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22 (2015).
- Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
- Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
- Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
- Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
- Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
- Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
- Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
- Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
- Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
- Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
- Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).
