Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersökning av värd Fenotyper i Published: February 22, 2017 doi: 10.3791/55170
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Biological Sciences, Sam Houston State University, 2Irma Lerma Rangel College of Pharmacy, Texas A&M University Health Science Center

Summary

Denna studie involverar metoder för att avslöja effekterna på en modell fisk värd följande förändring av huden och tarmen microbiome samhällen komposition genom ett antibiotikum.

Introduction

Det har fastställts att antibiotika kan störa den mänskliga microbiome leder till dysbios, vilket betyder ett mikrobiella obalans. Mikrobiota s sammansättning förändring efter antibiotikabehandlingar har visat sig sänka samhällets mångfald, minska nyckelpersoner, och ändra gemenskap metabolism, särskilt i tarmen 1, 2. Antibiotikum störning av tarmen microbiome kan minska kolonisering resistens mot Clostridium difficile 3, 4 och Salmonella 5.

Dessutom har störningar i mikrobiota kopplats till utvecklingen av många syndrom och sjukdomar hos människor (t.ex. antibiotikaassocierad enterokolit, inflammatorisk tarmsjukdom, metabola sjukdomar, osv.). Antibiotika är också allmänt tillämpas inom jordbruket som tillväxtbefrämjande medel iboskap och fjäderfäproduktion 6. Användningen av dessa kraftfulla verktyg är inte utan bieffekter, vilket är tydligt i den snabba ökningen av antibiotikaresistens, samt effekterna av en störd microbiome har med sin bebodda värd. Många studier har visat att bredspektrumantibiotikaanvändning har långvariga konsekvenser för struktur och funktion hos mikrobiota, ännu biverkningar från en antibiotika störs microbiome påverkar värd fysiologi är bara spekulationer som ännu inte stöds.

Samspelet mellan värd, mikrobiota, och antibiotika är långt ifrån förstås på ett kortfattat sätt. Därför är en enkel och mer lätthanterlig modell fördelaktigt att belysa den mycket komplexa däggdjurssystem. Slemhinneytor hos människor, inklusive tarmen, hamnen den högsta tätheten och mångfalden av mikrober, och även de mest intima mikrob-värd interaktioner. Mucosal hud microbiome fisk erbjuder several fördelar som ett modellsystem. Den Teleostei (benfiskar) är en av de tidigaste linjerna divergerar i Vertebrata mening att teleosts har både medfödda och förvärvade immunsystem som har samar utvecklat en relation med kommenbakteriesamhällen 7. Fisk hud delar många egenskaper med typ 1 slemhinneytor hos däggdjur, såsom fysiologiska funktioner, immunitets komponenter och arrangemang av slemproducerande celler 8. Den externa placeringen av fiskskinn slemhinneyta erbjuder en microbiome lätt att experimentellt manipulera och prov.

Den västra moskitfisk, Gambusia affinis (G. affinis), är en modell fisk som har använts i det förflutna för att studera parning och toxikologi 9, 10, 11. Med tanke på den lilla storleken, befolknings överflöd i naturen som en invasiv art, m inimal vård kostnad och härdiga natur, har vi utvecklat G. affinis som en slemhinna microbiome modell. Vidare, Gambusia delar fysiologi föder levande ungar med viviparous däggdjur, vilket är ovanligt i fiskarter. Vi avslutade den mest omfattande studien vid tidpunkten för fiskskinn normal mikrobiota använder 16S profilering med Gambusia 12. Ytterligare arbete visade tre negativa effekter på värd efter avbrott i huden och tarmfloran med hjälp av ett brett spektrum antibiotikum 13.

Fem olika effekter undersöktes i fisken efter antibiotika exponering. Den mest väletablerade värd förmån för microbiome är konkurrenskraftig uteslutning av patogener. Fisken patogen Edwardsiella ictaluri är känd för att orsaka utbrott av enter septikemi i kommersiella havskatt gårdarna 14. E. Siella ictaluri har också visat sig dödligt infektera zebrafiskclass = "xref"> 15, 16 och Gambusia 17. En utmaning med denna patogen från vattnet kan fungera som ett mått på utslagning. Som en jämförelse med mottaglighet för en enskild patogen, var överlevnad under exponering för en hög täthet av blandade organismer också utföras. Avföring och organiskt-rik jord användes som gemensamt stött källor mikrobiella samhällen.

En annan etablerad roll bakterietarm samhället utför är närings bearbetning och energi skörd, vilket påverkar den totala näringsupptaget för värden. Som en grov mätning av näring, var fisk kroppsvikt jämfört före och efter en månad av matas en standarddiet. Antibiotikabehandlade fisk som ett genomsnitt gått ner i vikt medan kontrollfisk i genomsnitt gått upp i vikt under månaden. Mekanismen för denna brist på viktökning är oklar. En möjlig bidragande orsak är transittiden av mat i tarmen. En GI motitets metod anpassades från zebrafisk (Adam Rich, SUNY Brockport, personlig kommunikation) för att bestämma överföringstiden. Det har ännu inte fastställts om antibiotikabehandlade fisk har en förändrad transittiden.

En gemensam utmaning med erfarenhet i den naturliga miljön av alla organismer, särskilt fisk, är osmotisk stress. Gambusia har visat att snabbt anpassa sig när akut betonade i höga koncentrationer av salthalt 18. Överraskande, fisk med en antibiotika förändrad microbiome uppvisade sänkt överlevnad till en hög saltstress. Mekanismen för denna nya fenotyp är under utredning. En annan vanlig stress på vattenlevande djur, särskilt i akvarier, är giftiga former av kväve (ammoniak, nitrat och nitrit). Överlevnad mot nitrat var inte signifikant olika mellan antibiotika-behandlade och kontrollfisk. De metoder som presenteras i detta manuskript kan användas med Gambusia eller liknande fisk modellorganismer, såsom zebrafisk och medaka, att mäta fenotyper i fisken efter experimentell manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes under godkännande av IACUC protokoll, numrerade 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 och 14-04-17-1018-3-01.

1. Animaliska insamling, hantering och etisk Care

  1. Samla Gambusia affinis från fält webbplats (identifiering guide på http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) med en liten dip net och plats i 19 L hinkar. Använd visuell inspektion för att identifiera arter.
  2. Resten fisk för 1-2 d i en hink med damm vatten. Efteråt överföra fisken i 76 eller 189 L akvarium tankar fyllda med halv damm vatten / halv kranvatten vid 25 ° C, luftades med en bubblande airstone. Använd en liten dopp netto vid hantering av fisk för att minimalt störa deras hud microbiome.
    OBS: Fisk densitet bör inte vara högre än 20 fiskar / 38 liter akvarievatten. Fisk är acklimatiserad till akvariet i minst 5 d innan försöket.
  3. Mata fiskar på en dagligen med 5 mg flingfoder per fisk. hold fisk med en 12 h ljus / 12 timmar mörker-cykel.

2. Inledande antibiotika exponering för alla experiment

  1. Dra all fisk från varje försök från samma akvarium, placera i två separata grupper (behandlade: utsätts för antibiotika och kontroll: oexponerade) i 19 L hinkar. Tidigare uppgifter som samlas in visar att fiskar i samma akvarium har homogeniserade hud microbiomes som har liten variation i samhället sammansättning. 12
  2. Under experiment, hålla fisken i två liter konstgjord damm vatten (APW, 0,33 g / L CaCl2, 0,33 g / L MgSO 4, 0,19 g / L NaHCO 3) som steriliseras genom autoklavering före användning.
  3. Förbered rifampicin antibiotikaförrådslösning genom tillsats av 50 mg / ml i dimetylsulfoxid (DMSO). Rifampicin är ett representativt brett spektrum antibiotikum som är icke-toxisk för fisken. Hos människor och möss, distribuerar det väl i vävnaderna.
  4. Från rifampicin lager administrera en slutligkoncentration av 25 ^ g / ml i 2 L av APW för antibiotic exponering av den behandlade fiskgruppen i 3 dagar. Observera att efter 3 d, odlingsbara hud bakterieantalet åter liknande den i förbehandlade fiskskinn.
  5. Parallellt hålla en grupp av obehandlad fisk i APW och ge en ekvivalent mängd av DMSO (0,5 ml per L av APW) i vattenmassan för att fungera som en kontrollgrupp.
  6. Som experiment är avsedda att mäta effekterna av en antibiotika förändrad microbiome på fisk fenotyper, för att undvika effekter direkt från antibiotikum själv, efter tre dagars antibiotika exponering (eller kontroll) period, överföring fisk i en hink med två liter färsk APW.
    1. Använd en 10 h viloperiod så antibiotikumet avlägsnas genom kropparna av fisken. Bas denna eliminering tid på experiment där fisken exponerades för 25 | ig / ml av antibiotikum under tre dagar. Avliva fisken genom att klippa ryggmärgen följt av nackstick, sedan homogenisera hela kroppen med hjälp av en vävnadskvarn.
    2. Bestämma antibiotika närvaro genom att placera 50 mikroliter av denna suspension efter 0,2 fim filtrering in i centrum av en agar petriskål. Gör ett hål för denna suspension genom att trycka en upp och ner steril 200 mikroliter pipettspetsen i agar, som avlägsnar en liten plugg.
    3. Använda agarplattor med 20 ml uppmätt volym av näringsagar, och fördela det jämnt med användning av en bomullstopp med en indikatororganism, Bacillus subtilis, som är känslig för rifampicin. Erhålla B. subtilis från en näringsagar inkuberades vid 25 ° CO / N och med användning av bomullspinne för att erhålla en koloni. Observera en inhiberingszon efter inkubation över natten vid 25 ° C indikerar närvaro av antibiotika i fiskvävnad.

3. Microbiome Extraktion

  1. Extrahera en hud microbiome prov från de yttre slemhuden genom att placera fisken i en steril 15 ml koniska rör fyllt med 2 ml steril PBST (137 mM NaCl, 10 mM fosfat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) -lösning och virvling vid en inställning av 10 under 1 min med steg om 10 s paus. Detergent och salt i bufferten befrämjar jämn dispersion av bakterier i lösning. Jämförbara resultat hittades med 0,85% saltlösning men sänkte bakterietal med rent vatten.
  2. Överför fisk från den koniska röret till en återhämtning hink. Letalitet av hud extraktionen är normalt lägre än 10%. Antingen, analysera bakteriesuspensionen i röret omedelbart efter extraktion eller pelle bakterierna genom en 2 min centrifuge i en centrifug vid rumstemperatur vid 15000 x g och förvara vid -80 ° C för framtida analys.
    OBS: All kultur och biokemiska analyser är omedelbar; DNA eller protein extraktion kan vara från frysta prover.
  3. För att få en gut microbiome prov, först placera fisken i en steril petriskål. Avliva fisken genom att avskilja den cervikala ryggmärgen direkt bakom huvudet med kirurgisk sax, följt av nackstickOch sedan externt sanera kroppen med 70% etanol våtservetter.
  4. Efter dissektion, ta bort hela tarmen genom att skära efter matstrupen och innan anus.
  5. Skär tarmen i små delar 1 - 2 mm i längd och placera alla sektioner i två ml PBST-lösning i en konisk tub. Efter vortexning under 1 minut, ta bort supernatanten i ett annat rent rör (ta försiktighet inte upprätta tarm avsnitt).
    OBS: Supernatanten innehåller extraherade tarmbakterier som antingen kan användas för direkta analyser eller pellets av den tidigare metoden nämns för hudprover.

4. Infektion Modell Upprättande och bad av en specifik patogen

  1. Skaffa en smittsam stam av Edwardsiella ictaluri (E. Siella ictaluri) och hålla kulturen förvaras vid -80 ° C. Stam 93-146 används i denna studie, isolerad från en infekterad havskatt, erhölls från Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University.
  2. Streak E. Siella ictaluri mald på ett selektivt & differential media kallade E. Siella ictaluri media (EIM) agar 19 att odla bakterier och inkubera i 2 d vid 27 ° C.
  3. Överföra en ren isolerad koloni från kulturen och inokulera en 150 ml kolv innehållande 40 ml näringsbuljong (NB; 5 g / L pepton, 4 g / L köttextrakt). Plats kolv i en shaker inställd på 150 varv per minut under 2 d vid 27 ° C.
  4. Efter inkubation, späd ett prov av kulturen i PBST till en spektrometer läsning av 0,2 OD vid 650 nm för att kalibrera E. Siella ictaluri kultur för önskade infektiösa dosvolymer.
  5. Nästa överföring båda behandlas (efter 3 d antibiotika exponering) och obehandlade fiskgrupper i individuella plastbägare som innehåller 130 ml av färskt konstgjord damm vatten, eller APW för cirka 10 timmar för drog klartecken från fiskvävnad.
  6. Sedan från båda grupperna, överföra igen varje fisk i 8-uns plastbägare som innehåller 130 ml ren APW. Ge varje fisk en dödlig dos innehållande 2,8 x 10 6 CFU / ml E. Siella ictaluri kultur i APW (badkar infektionsmodell) och hålla i en 27 ° C inkubator under 24 timmar.
  7. Efter E. Siella ictaluri bad, överföra fisk individuellt i nya koppar med 130 ml av en genomsnittlig industriarbetarlön.
  8. Efter vatten byte, spela fiskdöd under varaktigheten av en vecka. Fisk är inte utfodras under denna period. I motsats till havskatt, Gambusia visar inga yttre tecken på infektion, därför är det viktigt att använda dödlighet som en experimentell slutpunkt.

5. polymikrobiella Challenge med avföring och jord

  1. avföring Behandling
    1. Skaffa nya mänsklig avföring från en frisk frivillig ämne som inte har fått antibiotika under de senaste två veckorna, med hjälp av sterila handskar och en steril 50 ml koniska rör.
    2. Vid insamling, samla avföring i en steril plastpåse och sedan överföra till en steril 15 ml conical röret. Skapa en stamkoncentration genom att suspendera avföring i PBST för att ge en förrådslösning av 500 till 800 mg / ml. Denna tjocka blandningen är bäst att överföra med hjälp av en 1 ml eller större plast pipettspets som har skurits i botten med en steril sax så att öppningen är större.
    3. Efter initial antibiotika exponering av behandlade och kontroll obehandlade fiskgrupper, separera i individuella plastbägare som innehåller fekal suspension vid slutliga koncentrationer av antingen 15 mg / ml eller 10 mg / ml till APW med en total volym av 130 ml. Hålla koppar i en inkubator vid 25 ° C.
    4. Spela fiskdöd under fekal exponering genom noggrann observation över 2 d.
  2. markbehandling
    1. Samla 1 - 2 kg av rika organiska matjord (bör innehålla den högsta tätheten och mångfalden av mikrober) ca 7-15 cm i djup och placera i en ren plastbehållare. Observera att marken ska användas inom två dagar efter insamlingen.
    2. directly efter initial exponeringsperioden separera båda grupperna av antibiotika behandlade och obehandlade fisk i individuella plastbägare som innehåller 18,2 g jord i 130 ml av en genomsnittlig industriarbetarlön. Blanda jorden i vatten väl för hand före tillsats av fisk. De flesta av de partiklar som inte avbryta och stanna på botten av koppen.
    3. Exponera fisk under en period av tre dagar vid 25 ° C och registrera alla dödlighet.

6. Osmotisk stress Challenge

  1. Efter behandling följt av en 10 h viloperiod som beskrivits ovan, individualisera fisk i separata kopparna innehållande NaCl vid 17,5 mg / ml (300 mM) i 150 ml av en genomsnittlig industriarbetarlön. Detta är hälften av den typiska salthalten i havsvatten, som inte är helt dödlig (<50%) för att styra fisk men är starkt stressande, kräver effektiv osmoregulation.
  2. Observera för fiskdöd över en period av 36 timmar.

7. Nitrat Toxicitet Challenge

  1. Vila fisk för en 10-timmarsperiod efter antibiotika mässorure, och sedan separat fisk i enskilda koppar innehåller en natriumnitratkoncentrationen av antingen 10 mg / ml (118 mM) eller 17,5 mg / ml (206 mM) i 130 ml av en genomsnittlig industriarbetarlön.
  2. Rekord för dödlighet under 4 d för låg dos och en d för hög dos.

8. Tillväxtanalys av Individualized eller grupperade Fish

  1. Komplett 3 d antibiotika exponering eller kontrollperiod som grupper i hinkar.
  2. För Individuell fyller 8-oz Styrofoam koppar med 150 ml APW vardera, överföra en individuell fisk i koppen och registrera den totala kroppsvikten för första bedömning.
    1. Upprepa för alla fiskar i både behandlade och obehandlade grupper. Använd vit frigolit koppar i stället för klara plastmuggar, eftersom fisken inte kommer att äta när i det klara kopparna.
  3. Foder fisk dagligen med standarddiet av två pellets per fisk. Pellets användes i stället för flingor eftersom pellets har låg variation i individuella massa (3,53 ± 0,42 mg vardera, eller 8% variation), resulting fisk emot liknande mängder mat. Övervaka förbrukningen genom att visuellt inspelning okonsumerat pellets. Förbruknings priser var typiskt över 80%.
  4. I slutet av varje vecka under 4 veckor, bestämma fiskens vikt. Förbered en ny kopp med färsk APW, placera på en balans, och sedan notera vikten. Sedan, häll en fisk i ett dopp netto från den ursprungliga koppen och överför till den nya koppen, som sedan vägs igen. Fisk är inte hanteras för att undvika stress.
  5. För grupper, placera två liter APW till en 19 L hink och tarera vågen. Håll fisk tillsammans i båda grupperna vid överföring till nya APW hinkar sedan registrera den totala gruppen vikt. Spela fisk grupp vikt varje vecka över en månad tidsperiod genom att övergå till en ny hink.

9. Gut Transit Time

  1. Använd fluoresceinmärkt 70 kDa anjoniska dextran. Dextran är inte signifikant diger, och är för stor för att absorberas tvärs tarmskiktet, sålunda passagen kommer att mäta tiden för passage genom tarmen.Märkt dextran införlivades fiskmat.
  2. I en steril 1,7 ml rör, tillsätt 360 mikroliter sterilt avjoniserat vatten och 52 mg gelatin (13% lösning) och placera röret på en 60 ° C värmeblock tills gelatinet smälter och är helt upplöst.
    1. Grind guldfisk livsmedelsflingor till ett fint pulver med användning av en mortel och mortelstöt, och tillsätt 40 mg av detta pulver till röret, tillsammans med 20 mikroliter av fiskolja. Efter blandning, tillsätt 1,6 mg av FITC-dextran.
  3. Fördela den varma vätskeblandningen i 20 mikroliter droppar på Parafilm på laboratoriebänken, och låt dem snabbt svalna och stelna. Droppar kan lagras i upp till fyra d innan de blir för svårt för fisk att äta. Store droppar i kylskåpet genom att placera Parafilm på hälften av en petriskål, som sedan flöt på sterilt vatten i en förseglad plastbehållare, som håller dropparna fuktad.
  4. Strax före utfodring, faller kvartalet i sektioner med hjälp av ett rakblad. Acklimatisera fisken till Styroskum koppar individuellt för 2 dagar utan att mata (Obs: Endast oexponerade kontroll fisk användes). Placera fyra fjärdedelar av maten i koppen med fisken, och observera fisk för 30 minuter för hur många bitar av mat de var äter.
  5. Till att börja övervakningsperioden, överföra fisk individuellt i koppar med 80 ml APW använder ett dopp netto. Varje 2 timmar, snurra försiktigt APW hand, och sedan ta en 1 ml prov och förvara i en märkt 1,7 ml rör vid 4 ° C. Ta prover för 36 timmar.
  6. Rekord fluorescens, med en fluorescensspektrofotometer, av alla prover samtidigt efter fullbordande av analysen. Placera hela 1 ml prov i en kyvett, och registrera fluorescens mättes med användning av excitation vid 495 nm och emission vid 520 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En övergripande schematiskt diagram över den experimentella system som används för att studera fisk värdeffekter från antibiotikum exponering 13 representeras i figur 1A och innefattar den teknik för att extrahera huden (Figur 1B) och tarm (Figur 1C) microbiomes från fisken. Tre dagar valdes som antibiotika exponeringstiden, eftersom tidigare data visar att medan den totala huden odlingsbara antal droppar i början av behandlingen, har det återgått till nivåerna före behandlingen efter 3 d. Samtidigt samhället sammansättning, som bestäms av 16S profilering har varit starkt förändrats. Därför bör tre-dagarsperiod vara optimal för att analysera effekterna från ett förändrat gemenskap av ungefär samma densitet. Notera att odlingsanalys, med användning av antalet kolonier på agarplattor, kan utelämna ett antal arter. Effektiviteten av huden microbiome dispersionen metod (Figur 1B 10 APRIL-10 MAJ CFU / g fiskens vikt) till koloniantal från flera fisk som utsatts för samma förfarande suspensionen en andra gång (för att kvantifiera eventuell kvarvarande bakterie). Räknas från denna andra suspension var lägre än 100 CFU / g, vilket antyder suspensionen metoden är effektiv (opublicerad).

Fisk med ett antibiotikum-altered microbiome föll vara mer mottagliga för ett E. Siella ictaluri infektion än kontrollfisken (Figur 2). Skillnaden i genomsnittlig tid till döds av 56,1 ± 15 timmar för den behandlade fisk och 98,5 ± 48 timmar för kontroll fisk var inte statistiskt signifikant (tvåsidigt t-test, p = 0,12). Detta beror sannolikt på den lilla gruppstorlek (behandlad n = 6, kontroll n = 5). Gruppstorlekar av minst ett dussin rekommenderas därför. En fördel med denna infektionsmodell är bath-protokollet, som inte kräver nålar för infektion eller spårning av födointag. E. Siella ictaluri naturligt invaderar havskatt från vattnet. Säkerheten är hög på grund E. Siella ictaluri är temperaturkänsligt, och därmed dåligt smittsam för människor. Andra studier har visat att tiden till döds i G. affinis korrelerar med den initiala dosen av bakterier. Inkubationstemperaturen av 27 ° C valdes som optimal för både bakterier och fisk.

Behandlade eller kontrollfisk hade inte signifikanta skillnader i överlevnad i vatten som är förorenat med höga värden av blandade mikrober. Ingen dödlighet observerades under 4 dagar för kontroll (n = 8) eller behandlade (n = 9) fisk när jord användes som mikrobiell källa. Medan vissa dödlighet gjorde inträffa med mänsklig avföring som källan av mikrober (tabell 1), gjort antibiotikabehandling ingen skillnad. När koncentrationen av avföring i APW var vid 20 mg / ml, 40 till 50%av fisken dog. Emellertid koncentrationen av löst syre var endast 10% (jämfört med> 80% i hinkar eller akvarier), på så sätt de hypoxiska betingelser förväxlas tolkningen. När lägre nivåer av 16 eller 10 mg / ml användes, var överlevnaden matchas (tvåsidig Fishers exakta test, p = 0,95 eller högre för en skillnad mellan grupperna). Upplöst syrenivåer i dessa två studier var 65% eller högre. Gambusia är en mycket härdiga invasiva arter som kan leva i låg kvalitet vatten. Det skulle vara intressant att använda dessa analyser av naturliga mikrobiell exponering för att mäta överlevnaden av andra arter mot en utmaning av förorenat vatten. Prover av vatten från specifika miljö platser, särskilt de utsätts för övergödning, skulle kunna användas i en liknande analys, även om vattenkvaliteten (löst O2, nitrat, salthalt, osv.) Skulle behöva fastställas som en potentiellt confounding faktor.

fisk eXposed mot rifampicin var mer känsliga för osmotisk stress än kontrollfisken (Figur 3). Log-rank-test observerade en signifikant skillnad (p = 0,049) i överlevnadsgrad (43% död i kontrollgruppen och 88% död i behandlade gruppen, n = 9 för båda grupperna) när de utsattes för förhöjd salthalt. Resultat från denna analys överens med en bestämning av 18,1 mg / ml som LC 50 för NaCl med G. affinis på 24 timmar i sötvatten 20. Tecken på koksalt stress som fisken uppvisar inkluderar rodnad runt gälarna och minskad simrörelser. Med denna analys, salthalten över 18 mg / ml resulterade i snabb död fisk.

När de exponeras för toxinet nitrat i vattenmassan, gjorde före exponering för antibiotikumet inte påverka överlevnad (Tabell 2). För varje försök, var död inspelad både på kort och lång tidpunkt representerar akuta och mer kroniska effekter. koncentrationen10 mg / ml valdes baserat på att det är LD 50 för G. affinis i sötvatten på 48 timmar 21. Resultaten från denna analys var i överensstämmelse med denna LD 50 värde, med en 50% dödlighet i både behandlade och kontrollgrupper efter 90 h. En högre utmaning av nitrat (17,5 mg / ml) undersöktes också, vilket leder till en snabbare död. Återigen var det inte skillnad i behandlingsgrupperna. Nitrit är dramatiskt mer toxisk än nitrat till G. affinis, med ett LD50 av 0,0015 mg / ml vid 48 h 22. Gemenskap biokemisk analys med hjälp av analys profil indexsystem (opublicerad) visar att fiskskinn mikrobiota har potential att minska nitrat. Förblev dock nitritnivåer i APW under båda försöken under detektionsgränsen (0,001 mg / ml). Denna utmaning metod kan användas med alla små lösliga kemikalier.

När individualiseras i koppar och matade than samma belopp till varje fisk i en månad, var en trend för antibiotikabehandlade fisk inte gå upp i vikt samt kontroll fisk, utan en statistiskt signifikant skillnad (data visas ej). För att undvika stress individualisering, var fisk inrymt tillsammans som en grupp för behandlade och obehandlade fisk i hinkar för en månad och ges matchade mängder mat. Begränsningen av denna inställning är att fisken inte kan ta emot samma mat på en individuell basis. Men i gruppen modellen, behandlades fisk i genomsnitt gått ner i vikt och kontroll fisk i genomsnitt gått upp i vikt (tabell 3). Mängden mat fisken konsumerar inte tycks påverkas av tidigare antibiotika exponering, så aptit dämpning är en osannolik kandidat förklaring till bristen på viktökning. Ett flertal andra faktorer kan bidra, inklusive förändring i inflammation i tarmen, nivåer av slemproduktion, gut permeabilitet och / eller tarmmotilitet. En stor fördel med denna analys för att mäta nutritiOnal effekter är enkelhet. Det är billigt, och endast kräver en laboratorie balans instrumentering. Det är lämpligt att screena för en effekt, vilket leder till andra involverade experimenterande för att bestämma mekanismen.

Ett exempel faktor att undersöka rör fisk viktökning är livsmedelspassagetiden, som är relaterad till gut motility. FITC-märkt dextran kan införlivas i gelatiniserad mat och är nonlethal för fisken. Mätning av fluorescens i det omgivande vattnet över tid ger ett mått på hur snabbt den FITC-dextran passerar genom tarmen. Fluorescens över bakgrunden kan detekteras så snart som 2 h, med en maximal nås efter 16 timmar efter utfodring (Figur 4). Detta resultat är med kontroll fisk från ett akvarium. Pålitliga resultat från antibiotikabehandlade fisk har ännu inte uppnåtts. En begränsning hos detta förfarande är att en 2-d starvation period krävs för fisk att äta mat. en adv antage av protokollet är hög känslighet (låg bakgrundsfluorescens), som fiskätande endast en del mat kan ge resultat, även om uppgifterna är mer konsekvent när två sektioner äts. Detta protokoll är mindre komplicerat än en liknande och dödlig metod för möss 23.

Figur 1
Figur 1: Schematisk översikt av den gemensamma Försöksprotokoll. A är ett flödesdiagram, från vänster till höger, överfördes från akvariet fisk, separeras i antibiotikabehandlade (representerad av rött vatten) eller kontroll (blå) grupper, och placerades därefter i individuella cups att spåra fenotyper. B och C skildrar processen att utvinna de fiskskinn och tarm microbiomes. Efter virvling är bakterier suspenderas i lösningen för analys av den mikrobiella miljön.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Pathogen Känslighet. En överlevnadskurvan vid exponering för E. Siella ictaluri för fisk som förbehandlats med rifampicin (röd linje) eller en obehandlad kontrollgrupp (svart linje) fisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Känslighet för Osmotisk stress. En överlevnadskurvan under exponering för hög salthalt för fisk i båda antibiotika-behandlade och obehandlade grupper. pelas klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Mat Transit Time. Fluorescens över tid i vattnet från två fisk utfodras FITC-dextran. Fisk En åt två gelatin livsmedel avsnitt och fisk B åt en. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: Känslighet Hög Microbial miljöer. Exponering för human avföring bedömdes på 3 olika koncentrationer. Dödad av x: y visar det totala antalet fiskar döda vid den angivna tidpunkten x jämfört med det totala antalet fiskar i försöksgruppen y.


Tabell 2: Nitrat toxicitet Challenge. Inspelad tid av fiskdöd i behandlade och kontrollgrupper under exponering för ett giftigt nitrathalt. Dödad av x: y visar det totala antalet fiskar döda vid den angivna tidpunkten x jämfört med det totala antalet fiskar i försöksgruppen y.

tabell 3
Tabell 3: Tillväxtanalys. Förändringar i total kroppsvikt efter en månad efter antibiotika eller kontrollbehandling. Den procentuella skillnaden i initial genomsnittlig kroppsvikt (för fiskarna att försöksgruppen) jämfört med slutlig genomsnittliga kroppsvikten är kolumnen Δweight. N är antalet fiskar i denna grupp. Medelvikten per fisk vid slutet av försöket är under / fisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vissa utmaningar kräver en viloperiod i ren APW efter antibiotikabehandling för det läkemedel som skall utarmas på fiskvävnad. Om viloperiod hoppas då antibiotika närvaro kan förbrylla resultaten, särskilt när analysen innebär exponering för bakterier. För att undersöka effekterna av en förändrad microbiome komposition utan stora förändringar i det totala antalet mikrober på värden, preliminära experiment övervakning microbiome sammansättning (16S profilering eller hela genomet sekvensering) och befolkningstäthet (16S kvantifiering via qPCR) under antibiotika exponering skulle vara nödvändig. Medan 3 d är optimal i detta system, ändra värden och / eller antibiotika skulle kräva omkalibrering.

Typiskt för biomedicinsk forskning, är musmodell som vanligen används för microbiome studier. Den vanligaste fisk modell är zebrafisk. För att få en bättre förståelse av de universella egenskaperna hos strukturen och funktionen av mucosal Microbiomes och värdinteraktioner, nya och atypiska modeller är en nödvändighet. Vår WT fisk modell fungerar som en autentisk källa för att studera värd microbiome interaktioner genom att inkludera naturliga värd genetisk variation som andra modeller har förlorat på grund av generationer av lab-upp djur inavel 24. En stor experimentell fördel av Gambusia är deras hardy natur, tolerera ett brett spektrum av förhållanden. Höga överlevnaden har observerats i vatten som varierar i temperatur (4-38 ° C), salthalt (0-17 mg / ml), löst syre (110 - 25%), och pH (4-8). Detta gör inte bara att undersöka många miljöförhållanden, men också för flera steg experimentella procedurer som ofta alltför påfrestande för andra fiskarter.

Procedurerna som presenteras här är lämpade för snabb screening för att upptäcka värd effekter från en viss behandling. Uppföljande studier krävs för att avgöra direkt orsakssamband och mekanism. Exempel förlängning studies för fisken microbiome värd effekter inkluderar: mäta tarminflammation, undersökning av fiskens hälsa genom att kvantifiera fettdepåer, och mätning av slem nivåer på huden och i tarmen. En gnotobiotisk systemet håller på att utvecklas för att studera i detalj länkar specifika mikrober till särskilda värd fenotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rifampicin Calbiochem 557303-1GM
Sodium Nitrate Sigma Aldrich S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran ThermoFisher Scientific D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets Calbiochem 6500-OP tablets dissolve in water to make PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).
  2. Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
  3. Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
  4. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
  5. Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
  6. Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
  7. Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
  8. Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
  9. Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
  10. Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22 (2015).
  11. Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
  12. Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
  13. Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
  14. Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
  15. Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
  16. Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
  17. Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
  18. Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
  19. Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
  20. Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  21. Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  22. Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  23. Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
  24. Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).

Tags

Immunologi Mukös microbiome fisk modellorganism antibiotika exponering värdeffekter, Infection
Undersökning av värd Fenotyper i<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Efter antibiotikabehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carlson, J. M., Chavez, O.,… More

Carlson, J. M., Chavez, O., Aggarwal, S., Primm, T. P. Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment. J. Vis. Exp. (120), e55170, doi:10.3791/55170 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter