Summary
En vätskekristallnanopartikel (LCNP) nanocarrier utnyttjas som ett medel för styrd tillförsel av ett hydrofobt last till plasmamembranet hos levande celler.
Abstract
Den kontrollerade leveransen av läkemedel / avbildande ämnen till celler är kritisk för utvecklingen av terapeutiska medel och för studier av cellulära signalprocesser. Nyligen har nanopartiklar (NPS) visat betydande löfte i utvecklingen av sådana avgivningssystem. Här har en flytande kristall NP (LCNP) -baserad avgivningssystem använts för reglerad avgivning av ett vattenolösligt färgämne, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO), inifrån NP kärnan till den hydrofoba regionen av ett plasma membranbiskiktet. Under syntesen av de nationella parlamenten, var färgämnet effektivt införlivas i hydrofoba LCNP kärna, vilket bekräftas av flera spektroskopiska analyser. Konjugering av en PEGylerad kolesterolderivat till NP yta (DiO-LCNP-PEG-Chol) aktiverat bindningen av de färgämnesladdade NP till plasmamembranet i HEK 293T / 17-celler. Tidsupplöst laserskanning konfokalmikroskopi och Förster resonansenergiöverföring (FRET) avbildning bekräftade passetIve utflöde av DiO från LCNP kärnan och dess införande i plasmamembranet tvåskiktsmembran. Slutligen försvagat leverans av DiO som LCNP-PEG-Chol cytotoxiciteten av DiO; NP form av DiO uppvisade ~ 30-40% mindre toxicitet jämfört med DiO gratis levereras från bulklösningen. Detta tillvägagångssätt visar användbarheten av LCNP plattformen som en effektiv modalitet för membranet specifik avgivning och modulering av hydrofoba molekyl last.
Introduction
Sedan tillkomsten av gränssnittsnanomaterial (material ≤100 nm i åtminstone en dimension) med levande celler, har ett fortsatt mål varit att dra fördel av de unika storleksberoende egenskaper hos nanopartiklar (NPS) för olika tillämpningar. Dessa applikationer inkluderar cell- och vävnads märkning / avbildning (både in vitro och in vivo), realtidsanalys och kontrollerad leverans av läkemedel och andra laster 1. Exempel på sådana relevanta NP egenskaper innefattar emission storleksberoende av halvledarnanokristaller (kvantprickar, QDs); de fototermiska egenskaper guld nanopartiklar; den stora lastförmåga av den vattenhaltiga kärnan i liposomer; och ballistiska ledningsförmågan hos kol allotropes, såsom enda vägg kolnanorör och grafen.
På senare tid har stort intresse uppstått i användningen av NPS för kontrollerad modulering av läkemedel och andra laster, såsom kontrast / imaging enherrar. Här är syftet att väsentligt öka / optimera den totala lösligheten, levererade dosen, cirkulationstiden, och eventuell clearance av läkemedlet lasten genom att leverera det som ett NP formulering. Detta har kommit att kallas NP-medierad läkemedelstillförsel (NMDD), och det finns för närvarande sju FDA-godkända NP läkemedelsformuleringar för användning i kliniken för behandling av olika cancerformer och hundratals fler i olika stadier av kliniska prövningar. I huvudsak är målet att "uppnå mer med mindre," det vill säga att använda NP som en byggnadsställning för att leverera mer läkemedel med färre doserings administrationer genom att dra nytta av den stora ytarea: volym (t.ex., hårda partiklar, såsom QDs och metalloxider) av NPS eller deras stora inre volym för lastning stora lastVikt (t.ex. liposomer eller miceller). Syftet här är att minska behovet av flera systemiskt levererade dosregimer medan samtidigt främja vattenstabilitet och förbättrad cirkulation, i synnerhet förutmanande hydrofoba läkemedels last att även mycket effektiv, är svårlösliga i vattenhaltiga medier.
Således var målet för det arbete som beskrivs häri för att bestämma möjligheten att använda en ny NP byggnadsställning för den specifika och kontrollerad leverans av hydrofoba laster till den lipofila plasmamembranet tvåskiktsmembran. Motiveringen för arbetet var den inneboende begränsad löslighet och svårigheter i leveransen av hydrofoba molekyler till celler från vattenbaserade medier. Normalt kräver leverans av sådana hydrofoba molekyler användningen av organiska lösningsmedel (t.ex. DMSO) eller amfifila ytaktiva ämnen (t.ex. poloxamerer), som kan vara giftiga och kompromisser cell- och vävnadslivsduglighet två eller micell bärare, som kan ha begränsad intern belastning kapacitet. NP bäraren valts här var en ny flytande kristall NP (LCNP) formulering utvecklades tidigare 3 och som hade visats tidigare för att uppnå en ~ 40-faldig förbättring av effektiviteten av anticancerläkemedlet doxorubicin i odlade celler 4.
I det arbete som beskrivs häri, den representativa last väljs var den potentiometriska membran färgämnet 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO). DiO är en vattenolöslig färgämne som har använts i antero och retrograd spårning i levande och fixerade neuroner, membranpotentialmätningar, samt för allmänna membranmärkning 5, 6, 7, 8, 9. På grund av dess hydrofoba natur, är DiO typiskt tillsättas direkt till cellmonoskikt eller vävnader i en kristallin form 10, eller det inkuberas vid mycket höga koncentrationer (~ 1-20 M) efter utspädning från en koncentration stamlösning 11, 12.
innehåll "> Här var den metod nytta för LCNP plattform, är en multifunktionell NP vars inre kärna är helt hydrofoba och vars yta är samtidigt hydrofila och mottagliga för biokonjugering, för att forsla för DiO. DiO införlivas med LCNP kärnan under syntes och NP ytan därefter funktionaliseras med en PEGylerad kolesterol molekyldel att främja membranbindning av DiO-LCNP ensemble till plasmamembranet. Detta tillvägagångssätt resulterade i ett avgivningssystem som fördelades den DiO in i plasmamembranet med större trohet och membranuppehålls tid än den fria formen av DiO levereras från bulklösningen (DIO gratis). Vidare visade denna metod att LCNP-medierad leverans av DiO avsevärt modulerar och driver graden av specifik uppdelning av färgämnet i den lipofila plasmamembranet tvåskiktsmembran. detta är uppnås samtidigt samtidigt minskar cytotoxiciteten hos det fria läkemedlet vid ~ 40% genom att leverera det som en LCNP formulering.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av DiO-LCNP och DiO-LCNP-PEG-Chol
- Lös upp flytande kristallina diakrylat bryggbildare (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DiO, 2 mg), och en fri radikal-initiator (azobisisobutyronitril, 1 mg) under polymerisation i 2 ml kloroform. Lägg till detta att en vattenhaltig lösning av akrylat-funktionaliserad ytaktivt medel (AC10COONa, 13 mg i 7 ml).
- Rör om blandningen under 1 h och sonikeras vid 80% amplitud under 5 min för att producera en miniemulsion bestående av små droppar av det organiska materialet som omges av polymeriserbart ytaktivt medel i vatten.
- Värm blandningen till 64 ° C i ett oljebad för att initiera polymerisationen av både tvärbindningsmedlet och ytaktivt medel som kloroform avdunstar långsamt, vilket ger en DiO-innehållande NP suspension som stabiliseras av det ytaktiva medlet.
- Filtrera det NP-suspension (3 gånger) genom ett 0,2 | im sprutfilter för att avlägsna eventuell aggregation. store den filtrerade NP-lösning vid 4 ° C fram till vidare användning.
- Konjugering av PEG-Chol Dio-LCNP via EDC koppling.
- Upplösa Chol-PEG-NH2 • HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) i 25 mM HEPES-buffert (pH 7,0).
- Bered en arbetslösning innehållande iV-hydroxi-sulfosuccinimide natriumsalt (NHSS, 40 mM) och 1-etyl-3- (3- (dimetylamino) -propyl) karbodiimid-hydroklorid (EDC, 400 mM) i HEPES-buffert från koncentrerade förrådslösningar.
- Omedelbart tillsätt 20 pl av den nyberedda arbetslösning av NHSS / EDC till 1,0 ml av DiO-LCNP i HEPES-buffert och rör om under 5 min.
- Tillsätt 20 | il stamlösning av Chol-PEG-NH2 • HCl till denna blandning och rör om under 2 timmar.
- Centrifugera kort reaktionsblandningen vid maximal hastighet (~ 2000 xg) i 30 sek med användning av en bordsskiva minicentrifug och passera supernatanten genom en PD-10 storlekssorterande kromatografi kolonn 13 jämviktad medDulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS, 0,1 x).
2. Karakterisering av DiO-LCNP och DiO-LCNP-PEG-Chol
- Bekräfta framgångsrik kovalent konjugering av PEG-Chol till DiO-LCNP yta genom gelelektrofores.
- Lös upp 0,5 g av agaros i 50 ml (1x) av tris-borat-elektrofores (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM borsyra, och 2 mM EDTA) -buffert. Värm lösningen i en mikrovågsugn för upplösning av agarosen. Låt lösningen svalna något och häll innehållet i en gelplatta i elektroforesrutan. Sätt en gel kam för att skapa provbrunnar.
- När gelen har stelnat, tillsätt den önskade mängden (tillräckligt för att dränka gelen i kammaren) av TBE löpande buffert till kammaren.
- Lägg 35 pl DiO-LCNP prov (ändrad med glycerol, 5% v / v) till brunnarna i gelen och kördes under 20 minuter vid en spänning på 110 V.
- Bild gelen med hjälp av en gel imaging systth excitations- och emissionsfilter vid 488 nm och 500-550 nm, respektive.
- Utvärdera partikelstorlek och fördelning av dynamisk ljusspridning (DLS) genom att späda DiO-LCNP lösning (~ 200-faldig utspädning) i PBS (pH ~ 8, 0,1 x) och mätning på en DLS instrument 14. Mäta zeta-potentialen för DiO-LCNPs användning av en lämplig z-potential mätinstrument.
3. Beredning av cellodlingsskålar för leverans Experiment och Imaging
OBS: DiO-LCNP etikettering utförs på HEK 293T / 17 humana embryonala njurceller (mellan passagerna 5 och 15) som odlas såsom beskrivits tidigare fyra. Utför leverans experiment och den efterföljande cell imaging, såsom beskrivs nedan.
- Förbered 35 mm vävnads diameter odlingsskålar (försedda med 14 mm nr 1 coverglass insatser) genom att belägga dem med bovint fibronektin (~ 100 | il vid en koncentration av 20 mikrogram/ Ml) i DPBS under 2 h vid 37 ° C.
- Avlägsna fibronektin beläggningslösningen från odlingsskålen. Harvest HEK 293 T1 / 7-celler från T-25-kolv genom att först tvätta cellmonoskiktet med 3 ml DPBS och därefter genom att tillsätta 2 ml trypsin-EDTA (0,5% trypsin-0,25% EDTA).
- Inkubera kolven vid 37 ° C under ~ 3 min. Avlägsna trypsin-EDTA och returnera kolven till inkubatorn. När celler lösgörs från kolven, neutralisera trypsinet genom att tillsätta 4 ml av komplett medium (Dulbeccos modifierade Eagle-medium, DMEM; ändras för att innehålla 10% fetalt bovint serum, 5% natriumpyruvat, och 5% antibiotika / antimykotika) till kolven . Bestämma cellkoncentrationen i suspensionen genom att räkna dem i en cellräknare.
- Justera cellkoncentrationen till ~ 8 x 10 4 celler / ml med tillväxtmedium. Tillsätt 3 ml av cellsuspensionen till skålen och kulturen i inkubatorn över natt; nästa dag, bör cellerna vara vid ~ 70% konfluens och bör vara klar för användning. Tillräckligcelldensiteten är kritisk för robust och effektiv märkning av en hög procentandel av celler.
4. Cellular Leverans av DiO och DiO-LCNPs och avbildning av fixerade celler
- Bered 1 ml lösningar av DiO, DiO-LCNP och DiO-LCNP-PEG-Chol i frisättningsmedium (HEPES-DMEM, DMEM innehållande 25 mM HEPES) genom att späda stamlösningar av DiO gratis och DIO-LCNPs; lämpliga DIO koncentrationer för inkubation på celler blir ~ 1-10 iM (uttryckt som den koncentration av DiO gratis eller DiO i form av DiO-LCNP).
- Avlägsna tillväxtmediet från odlingsskålarna med användning av en serologisk pipett och tvätta cellmonolagren (se steg 3) två gånger med HEPES-DMEM (2 ml varje tvätt). Utför tvättar genom att försiktigt lägga till och ta bort HEPES-DMEM med hjälp av en pipett till / från kanten av rätter.
- Tillsätt 0,2 ml av de beredda Dio gratis eller DiO-LCNP leveranslösningar till mitten av odlingsskålar och åter rätter till incubator under en lämplig tidsperiod (typiskt 15 eller 30 minuter, beroende på behoven av experimentet). Längre inkubationstider lägga till mer ospecifik cellulär märkning av icke-membran områden (t.ex., cytosolen).
- Efter inkubationstiden, ta bort leveranslösningar med hjälp av en serologisk pipett. Tvätta cellmonoskikten två gånger med DPBS (2 ml varje tvätt). Utför tvättar genom att försiktigt lägga till och ta bort DPBS till / från kanten av skålen.
- Fixera cellmonoskikten med hjälp av 4% paraformaldehyd (framställd i DPBS) under 15 min vid rumstemperatur.
VARNING: Paraformaldehyd är brandfarligt, andnings irriterande, och en misstänkt cancerframkallande. - Ta bort paraformaldehydlösning med hjälp av en pipett och försiktigt tvätta cellerna en gång med DPBS (2 ml) genom att lägga till och ta bort DPBS med hjälp av pipett till / från kanten av rätter.
- De fixerade cellerna är redo att avbildas med avseende på närvaro av en membranfluorescenssignal med hjälp av konfokal laserscanningmikroskopi (CLSM). Utför avbildning omedelbart eller, alternativt, byt medium med DPBS innehållande 0,05% NaN3 och förvara disken vid 4 ° C.
VARNING: NaN3 är giftig; vara mycket försiktig när du använder NaN3.
OBS: Fasta prover lagrade på detta sätt bör avbildas inom 48 timmar för bästa resultat.
5. Cellular Leverans av DiO och DiO-LCNPs och FRET Imaging i levande celler
OBS: I denna metod är celler colabeled med 6 ^ M av varje DiO-LCNP-PEG-Chol (där DiO är en FRET donator) och 1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII fri, där Dil är en FRET-acceptor). Frisläppandet av DiO från DiO-LCNP-PEG-Chol och dess införlivande i plasmamembranet bekräftas av en observerad ökning av energiöverföring från DIO givare till Dil acceptor.
- Etikett celler sekventiellt med DiO-LCNP-PEG-Chol och DII free användning av metoden beskriven i steg 4.
- Efter färgning, tvätta cellerna en gång med DPBS (2 ml) med hjälp av en serologisk pipett och ersätta tvättbufferten med 2 ml av levande cell imaging lösning (LCI).
- På ett mikroskop scenen utrustad med en uppvärmd inkubation kammare, avbilda levande celler provet med en konfokalmikroskop (60X objektiv) med en FRET avbildning konfiguration vid 30 minuters intervaller under en 4 timmarsperiod genom spännande DIO donator vid 488 nm och samla hela emissions spektra av både DIO givaren och Dil acceptor 490-700 nm med en 32-kanal spektrala detektor.
- OBS: För mer information om FRET avbildning, se referens 15.
- Bestäm tidsupplöst emissionsintensiteten av både DIO givaren och Dil acceptor från celler färgade med DiO-LCNP-PEG-Chol och DII. Beräkna tidsupplöst acceptor / donator FRET förhållandet (DII emi / DiO EMI) för bilderna, som stadigt ökar och så småningom plattaau när mängden DiO givaren uppdelad i membranet har nått ett maximum 16.
6. Cytotoxicitet Analys av DiO och DiO-LCNPs till HEK 293T / 17-celler
OBS: Cytotoxiciteten hos DIO-LCNP material bedöms med hjälp av en tetrazoliumfärgämne baserat proliferationsanalys 17. Celler odlas i en flerkällsplatta i närvaro av varierande koncentrationer av de material under betingelser som emulerar leverans / märkning. Cellerna odlas sedan i 72 timmar för att möjliggöra proliferation. Ett färgämne (MTS, (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboximetoxifenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) tillsätts sedan till brunnarna, och metaboliskt aktiva celler omvandlar färgämnet till en blå formazanprodukt. mängden färgbildning är direkt proportionell mot antalet viabla celler.
- Harvest HEK 293 T1 / 7-celler från T-25-kolv genom att följa det förfarande som beskrivs i steg 3.2.SeedHEK 293T / 17-celler (5000 celler / 100 | il / brunn) och brunnarna i en 96-brunnars vävnadsodlingsbehandlade plattan och kulturen under 24 h.
- Helt ta bort odlingsmedium från brunnarna med hjälp av en mikropipett och tillsätt 50 pl HEPES-DMEM innehållande DiO gratis, DiO-LCNPs eller DiO-LCNP-PEG-Chol vid ökande koncentrationer att replikera brunnar. Inkubera på cellerna vid 37 ° C under 30 min.
OBS: Vanligtvis replikerar görs i tre exemplar eller fyra exemplar är tillräckliga för att ge statistiskt tillförlitliga uppgifter.- Efter inkubation, ta bort leveransmediet innehållande material med användning av en mikropipett och ersätta det med 100 pl av tillväxtmedium. Odla cellerna för 72 timmar.
- Tillsätt 20 pl av tetrazolium substrat till varje brunn, lämna tillbaka plattan i inkubatorn och tillåta färgbildning fortskrida vid 37 ° C under 4 h. Läs absorbansen (abs) i formazanprodukten vid 570 nm (absorption minima för DIO-LCNPs används i denna study) och 650 nm (för subtraktion av ospecifik bakgrund absorbans) med användning av en mikrotiterplattläsare.
- Rita differential absorbansvärdet (abs 570 - abs 650) mot materialkoncentration och rapportera resultaten som procent av kontroll celltillväxt (grad av proliferation av celler i endast cellodlingsmedium).
7. Data Analysis
- Statist analysera data med en univariat variansanalys (ANOVA). För multipla jämförelser, applicera Bonferronis post hoc-test. Ge alla medelvärden som ± standardfel av medelvärdet (SEM) om inget annat anges.
OBS: Det acceptabla sannolikheten för signifikans var p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCNPs framställdes, i vilken den hydrofoba kärnan av NP var lastad med ett representativt membranmärkning prob för att visa användbarheten av LCNP som en effektiv leveransbärare för hydrofoba last. För detta ändamål lasten valdes den starkt vattenolösliga potentiometrisk membranmärkning färgämne, DiO. DiO-laddade LCNPs (DiO-LCNPs) syntetiserades med användning av en två-fas mini-emulsion teknik med kemiska komponenter DACTP11, AC10COONa och DiO, som visas i figur 1 18. I denna NP-systemet tillhandahåller kovalent bundna polymera nätverket av den kristallina bryggbildare DACTP11 en stabil hydrofob kärna där DiO bosatt inom de interstitiella utrymmena i det tvärbundna nätverket. Karboxylatgrupperna på NP ytan tillhandahålla kolloidal stabilitet till partikeln i vattenhaltiga media men också fungera som en funktionell grupp "handtag" för fastsättning av cellmålsökande ligander(Och andra biologiska substanser). Att tjudra DIO-LCNPs till plasmamembranet, ades en amin-terminerad PEGylerat kolesterol molekyldel (PEG-Chol) kovalent fäst till LCNP ytan via EDC koppling (Figur 1). Efter NP-syntes och bekräftelsen av framgångsrik biokonjugering, förmågan till DIO-LCNPs märka plasmamembranet hos levande celler och för att leverera den inbäddade DiO last till den lipofila delen av plasma membranbiskiktet med förbättrad specificitet och kinetik jämfört med den fria blankett (DiO gratis) levereras från bulklösningen bedömdes.
Såsom visas i figur 2 A, DiO fri (6,0 ^ M) kraftigt färgade plasmamembranet med hög effektivitet (nästan 100% av cellerna märkta) efter 15 min av inkubation med HEK 293T / 17-celler. Emellertid var signifikant cellulär internalisering av DiO fri observeras vid endast en blygsam ökning iinkubationstid till 30 min (fig 2 A och C). Omfattningen av DiO fri interna bestämdes genom tidsupplösta colocalization experiment där cellerna först inkuberats med 6,0 | iM DiO fri (30 min). DIO fri-innehållande inkubationsmediet avlägsnades sedan, och cellerna därefter odlas i upp till 4 timmar. Plasmamembranen hos cellerna motfärgades med en färgämnesmärkt membranfosfolipid (fosfoetanolamin konjugerad till rodamin B, PE-Rhoda). Såsom visas i fig 2 C, efter 15 min av inkubation, var nästan 100% av DiO fri samlokaliserades med PE-Rhoda markör (Pearson colocalization koefficient; PCC = 0,99 ± 0,01). Emellertid, efter 30 min av inkubation ~ 80% av DiO fri förblev bunden till membranet (~ 20% internalis). Graden av DiO fri interna ökat stadigt som the inkubationstid förlängdes till så länge som fyra timmar, och detta återspeglas i den åtföljande minskning i PCC mellan DIO och Rhoda-PE (figur 2 C). En anpassning av data till en enda biexponentiellt ekvation visade att DIO fri interna nådde ett maximum på ~ 50% på en timme, med en internalisering hastighet (k = 0,045 min -1) och halveringstid (15 min) som speglade snabb och effektiv cellulärt upptag av DiO gratis. Dessa data visar den snabba tidsberoende övergång DiO fritt från plasmamembranet till cytosolen, där den förblev i stort sett undantagna från kärnan under 4 h tidsperiod undersöktes.
Med tanke på den okontrollerade cellulära upptaget av DiO gratis, målet blev att modulera detta beteende genom leverans av DiO som en LCNP-PEG-Chol NP formulering. När levereras som en LCNP-PEG-Chol biokonjugat, en mer ihållande membran residrenstiden för DiO jämfört med DiO gratis noterades (Figur 2 B). Efter 15 min av inkubation av DiO-LCNP-PEG-Chol med cellerna, var nästan 100% av DiO-signalen ligger vid plasmamembranet, där den samlokaliserades med PE-Rhoda membranmarkör, ett resultat som var jämförbart med som observerades för DiO gratis. Det konstaterades dock att medan DiO fri märkning av membranet var ganska jämn och sammanhängande, färgningsmönstret av DiO-LCNP-PEG-Chol efter 15 min inkubation var mer punktat och inte alls lika enhetlig karaktär (Figur 2 B). Detta resultat indikerade att DIO-LCNP-PEG-Chol-NP samlades in i diskreta regioner inom plasmamembranet. När inkubationstiden ökades till 30 min, ~ 94% av DiO-signalen förblev på membranet (jämfört med ~ 80% för DiO gratis på detta samma tidpunkt) (Figur 2 B och 2C). Denna trend blev ännu mer uttalad när cellerna odlades med DiO-LCNP-PEG-Chol-NPS för allt längre tider efter den initiala 30 minuters inkubering. Till exempel efter odling under 1 h efter den inledande inkubationen var nästan 80% av DiO-LCNP-PEG-Chol NP signalen membranös och samlokaliserades med PE-Rhoda markör (jämfört med ~ 55% för DiO gratis). Noterbart är den cellulära internalisering av DiO-LCNP-PEG-Chol NPS nådde högst 30% på två timmar (70% membrankvarhållande). Detta motsvarar en cellulär upptagningshastighet (k = 0,024 min -1, halveringstid = 29 min) som är exakt hälften av den som observerades för internalisering av DiO gratis.
Nästa, förmågan hos NP inbäddade DiO last att effektivt utflöde ut ur LCNP kärna och mata in den lipofila miljö av plasmamembranet tvåskiktsmembran på ett kontrollerat och tidsberoende sätt bestämdes. Tillbedöma detta genomfördes en FRET-baserade strategi devised vari DiO tjänar som en FRET donator engagerad i energiöverföring till acceptor-färgämne, Dil. Som väntat, vid initial märkning (t = 0 min), var emissionssignalen domineras av DiO donator som finns i de membran tjudrat NP (figur 3 B). FRET avbildning av samma fält 4 timmar senare (t = 240 min), men visade en signifikant ökning av emissionssignalen från Dil acceptor, vilket ger starka belägg för övergången till DIO givare från LCNP kärnan i plasmamembranet tvåskiktsmembran (Figur 3 C). Undersökning av tidsupplöst karaktären hos denna övergång visade en stadig minskning i Diö givar utsläpp i kombination med en motsvarande ökning av Dil acceptor utsläpp under 4 timmar experimentella fönster (Figur 3 D). Noterbart är att FRET effektivitet under denna övergång nådde sin maximum vid ~ 180 min efter initial märkning, vilket antyder att utflödet och membran avskärmning av DiO donatorn hade nått sitt maximum vid denna tidpunkt (fig 3 E). Dessa data visade tydligt av tidsupplöst uppdelning av DIO från NP till plasmamembranet tvåskiktsmembran som nådde sin maximala ~ 3 timmar efter initial märkning med DIO-LCNP-PEG-Chol NPS.
Slutligen jämförande cytotoxicitet analys för DiO gratis kontra DiO-LCNP-PEG-Chol. Vid inkubation med HEK 293T / 17-celler (vid en DiO koncentration av 6 ^ M i båda fallen), stod det klart att inkapsling av DIO i LCNP kärnan försvagade sin cytotoxicitet. Medan DiO fri framkallade cellulära viabilitet av ~ 50%, celler inkuberade med DiO-LCNP-PEG-Chol uppvisade cellulära viabilitet ~ 90%. (Figur 4). Kumulativt data cellmärknings kopplad med det cellulära toxistad data visar förbättringar i både effektivitet DiO-baserade membran märkning och moduleringen av cytotoxiciteten hos DiO.
Figur 1: Schematisk bild av membranbindande DiO-LCNP-PEG-Chol. DiO-LCNP är sammansatt av ett akrylat flytande kristall tvärbindningsmedel (DACTP11); en karboxyl-terminerad polymeriserbart ytaktivt medel (AC10COONa); och en lipofil färg, DiO. Kolesterol-terminerad poly (etylenglykol) (PEG-Chol) konjugerades till DiO-LCNP via EDC koppling. Tillsats av Chol till DiO-LCNP yta medierar preferentiell bindning av NP till plasmamembranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tids löst cellulärt upptag av DiO fri i HEK 293 T / 17-celler. DiO fri (6,0 | iM, panel (A) eller DiO-LCNP-PEG-Chol ([DiO] = 6,0 pM, panelen (B) inkuberades på cellmonoskikt under 15 min, avlägsnades och ersattes med tillväxtmedium; cellerna var odlades under de tider som anges (upp till 4 timmar). Cellerna färgades därefter med PE-Rhoda (2,0 | iM) och fixeras. proverna avbildades för DiO (grön) och membranbunden PE-Rhoda (röd) med användning av CLSM. ( C) tid upplöst plot av procent av membranbundna DiO fri eller DiO-LCNP-PEG-Chol signalen som en funktion av ökande inkubationstid. Data erhölls från Pearson colocalization koefficient (PCC, n = 3 & #177; standardavvikelse) på den gröna (DiO) och röda (PE-Rhoda) kanaler, och uttrycks i procent (± SEM) efter normalisering till PCC som motsvarar 15 min av inkubation. Skalstreck = 20 | im. Återgivet med tillstånd från 18 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tidsupplöst FRET bekräftar utflödet av DiO från DiO-LCNP-PEG-Chol till plasmamembranet. HEK293T / 17 celler costained med DiO-LCNP-PEG-Chol och DII, där DiO (grön avger) och Dil (röda avger) färgämnen fungera som FRET donator och acceptor, respektive. (A) DIC bild av levande celler costained med DiO-LCNP-PEG-Chol ([DiO] = 6,0 M) och Dil (6,0 M). sriklig avbildades för att övervaka förändringen i FRET-signal under en period av 4 timmar. (B) och (C) är de FRET bilder av den levande cell på samma fokalplan vid t = 0 min och t = 240 min, respektive. (D) Normaliserad, tidsupplöst emissionsintensiteten hos DIO donator och Dil acceptor från celler färgade med DiO-LCNP-PEG-Chol och DII och avbildas i FRET excitation läge. (E) tidsupplöst FRET ratio (Dil emi / DiO emi) för celler märkta med DiO-LCNP-PEG-Chol och DII och avbildade i FRET-konfiguration. Skalstreck = 20 | im. Återgivet med tillstånd från 18 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
figur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fortsatt mål att NMDD är den kontrollerade målinriktning och avgivning av läkemedelsformuleringar till celler och vävnader, i kombination med samtidig förbättrad läkemedelseffektivitet. En specifik klass av läkemedelsmolekyler för vilka detta har utgjort en betydande utmaning är hydrofoba läkemedel / avbildande medel som har sparsamt till ingen löslighet i vattenhaltiga medier. Detta problem har plågat övergången av potenta läkemedel från i cellodlings vitro-system till den kliniska miljön och har resulterat i ett antal lovande läkemedelsmolekyler är "hyllan" eller övergivna och inte drivas vidare i klinisk miljö. Wortmannin (Wtmn), till exempel, är en potent hämmare av fosfatidylinositol 3 'kinaser och fosfatidylinositol 3' kinasrelaterade kinaser och har stor potential som ett medel mot cancer, men dess brist på vattenlöslighet har hämmat dess utveckling i kliniska prövningar.
Nyligen Karve et al. visade förbättrad vatten solubility av Wtmn när de formuleras som en lipid-polymer NP enheten 19. En arena som kraftigt skulle kunna dra nytta av denna typ av förbättrade, kontrollerad leverans som en NP formulering är leveransen av hydrofoba läkemedel och avbildningsmedel till plasmamembranet. Således var målet för att ta itu med denna tekniska hinder och att utveckla en metod för att övervinna detta tekniska hinder.
Vid utarbetandet av denna metodik, en modell membran inriktning färgämne, DiO, valdes som historiskt har plågats av dålig löslighet i vattenhaltiga medier. Detta förlänar betydande utmaningar i den specifika leveransen av färgämnet till plasmamembranet. Bland dessa utmaningar är behovet av att lägga till den kristallina formen av färgämnet direkt till celler eller vävnader 10 eller inkubera celler med mycket höga koncentrationer av DiO efter utspädning från stamlösningar som innehåller lösningsmedel, såsom DMSO 11, 12.Tillvägagångssättet här var tvåfaldig: 1) införliva DiO i den hydrofoba kärnan av LCNPs under NP-syntes och 2) kovalent modifiera den syntetiserade dio-LCNPs med PEGylerad kolesterol konjugat (DiO-LCNP-PEG-Chol) för att underlätta den direkta interaktionen av DiO-laddade NPS med plasmamembranet. I själva verket denna metod förbättras effektivt ett antal aspekter av leverans av DiO till plasmamembranet.
För det första membranuppehållstiden för DiO var effektivt fördubblats vid leverans som en LCNP formulering jämfört med när DiO levererades fri från bulklösningen. Denna förlängda membran uppehållstid tillskrevs lokalisering av DiO-LCNP-PEG-Chol konjugat till lipidaggregat mikroområdena i plasmamembranet, vilket bekräftas genom co-färgningsexperiment. För det andra, var uppdelningen av DIO last i lipiddubbelskiktet bekräftas av FRET experiment där DiO tjänade som givare till en membran bosatt DII acceptor. Slutligen,långsam, fördröjd frisättning av den DiO last in i membranbiskiktet effektivt dämpas cytotoxiciteten av DiO vid ~ 40%.
Det är viktigt att framhålla flera punkter i protokollet som är avgörande för framgång. För det första måste den procentuella laddningen av DiO in i LCNP kärnan empiriskt optimeras i försöket syntes körs för att erhålla en balans mellan genereringen av hög kvalitet DiO-LCNP-PEG-Chol NPs och den önskade nivån av fluorescenssignal i cellulära leveransförsök . På samma sätt måste den biokonjugering av Chol-PEG-NH2 del till DiO-LCNP yta optimeras för att erhålla den önskade graden av cellulär märkning. Slutligen är kritisk för framgång antalet celler som appliceras på fibronektinbelagda odlingsskålar, och försiktighet måste iakttas för att ympa cellerna vid en densitet av ~ 8 x 10 4 celler / ml (~ 2,4 x 10 5 celler per skål) . När cellerna ympas alltför glest, resulterar det i en ineffektiv membran märkning, medan sådd ceLLS alltför tätt resulterar i förvärv av dåliga bilder som inte tydligt visar membran märkning.
En potentiell begränsning av den så beskrivna protokollet är att effektiviteten för inkorporering av olika andra membranmålsökande färgämnen och läkemedel kommer att variera beroende på de hydrofoba egenskaperna hos färgämnet / läkemedels-last. I dessa fall kommer LCNP syntesprotokollet måste testas empiriskt för att bestämma de optimala syntesbetingelser för perfekt färg / drog last inkorporering.
Sammanfattningsvis har en metod utvecklats för LCNP baserade kontrollerad tillförsel av ett hydrofobt färgämne last till plasmamembranet hos levande celler som övervinner många av de tekniska problem som är förknippade med det cellulära leveransen av vattenolösliga last. Den totala betydelsen av metoden är att det tydligt förbättrar specifika leverans av gods till plasmamembranet samtidigt dämpa samtidig cytotoxicitet som är associated med leveransen av hydrofoba laster vid höga koncentrationer från bulklösningen. Denna strategi bör hitta bred användning vid leverans av liknande utmanande hydrofoba färgämnet / imaging agent last och kommer sannolikt att bidra till att underlätta övergången av effektiv, men ändå dåligt vattenlösliga, last från experimentella regimen att den kliniska inställningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NRL Base finansieringsprogrammet (arbetsenhet MA041-06-41-4943). ON stöds av en National Research Council forskar Associateship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
