Abstract
Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, endotel hücreleri, perisitler, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve lenf damarları ve sinirler koordinasyon içinde yapılmalıdır. çok hücreli, multi-sistem etkileşimleri fizyolojik ilgili bir ortamda anjiyogenezisteki soruşturma gerektirmektedir. In vitro hücre kültürü modelleri kullanımı bakış açıları sağladı Böylece, ortak bir eleştiri bir mikrovasküler ağı ile ortaya çıkan karmaşıklık özetlemek kalmamasıdır. Bu protokolün amacı, öncesi ve kültürlü sıçan mezenter dokularında anjiyogenez uyarılmasından sonra bozulmamış mikrovasküler ağlarının zaman atlamalı karşılaştırmalar yapabilme yeteneği göstermektir. Kültürlü dokuların hiyerarşi korumak mikrovasküler ağları içerir. İmmünohistokimyasal markalama endotel hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, kan damarları ve lenf damarlarının varlığını teyit. İçindeAyrıca bu yöntem, BSI-lektin ile dokuları etiketleme önce ve artan kapiller filizlenmesi ve damar yoğunluğu ile karakterize serum veya büyüme faktörü uyarılmasından sonra yerel ağ bölgelerin time-lapse karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Ortak hücre kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, fizyolojik olarak uygun mikrovasküler ağlarda endoteliyal hücre soyu çalışmaları ve dokuya özel anjiyojenik madde değerlendirilmesi için bir araç sağlar.
Introduction
Mikrovasküler ağ büyüme ve yeniden doku işlevi için ortak paydası, yara iyileşmesi, ve birden çok patoloji ve önemli bir proses, mevcut olanlar 1, 2, yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, anjiyojenez ise. yeni gemiler mühendislik veya anjiyogenez katılan hücresel dinamiklerin önemini anlayarak, anjiyogenik dayalı tedaviler tasarımı dokuya için kritik öneme sahiptir. Ancak, bu işlem karmaşıktır. Bir mikrovasküler ağ içinde belirli yerlerde değişiklik ve çoklu hücre tipleri (örneğin endotel hücrelerini, düz kas hücreleri perisitleri, makrofajlar, kök hücreler) ve birden fazla sistemi (lenfatik ağları ve yapay sinir ağları) içerir olabilir. In vitro modeller anjiyogenez 3 katılan farklı hücreler arasındaki ilişkiyi inceleyen çok büyük katkıları olmasına rağmen, onların fizyolojik alaka thei nedeniyle zarar olabilir Sınırlı karmaşıklığı ve yakından in vivo senaryoyu yansıtmayan gerçeğini r. Bu sınırlamaları, üç boyutlu kültür sistemleri üstesinden gelmek için 3, ex vivo doku modelleri 4, mikroakışkan sistemleri 5, 6, ve son yıllarda geliştirilmiş ve tanıtılmıştır 7 hesaplama modelleri. Bununla birlikte, sağlam mikrovasküler ağ ex vivo anjiyojenezi araştırmak için hızlandırılmış yeteneğine sahip bir model için hala bir ihtiyaç vardır. karmaşıklık düzeyi ile anjiyogenez çalışmaları için yeni time-lapse modellerinin kurulması anjiyogenez düzenleyen altında yatan mekanizmaları anlamak için paha biçilmez bir araç sağlayacak ve tedavileri geliştirmek.
Sağlam bir mikrovasküler ağ üzerinden anjiyogenez ex vivo soruşturma sağlayan bir potansiyel modeli sıçan mezenter kültür modeli> 8. Son çalışmada, kan ve lenfatik mikrovasküler ağları kültür sonra canlı kalır olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, sıçan mezenter kültür modeli fonksiyonel pericyte-endotel hücre etkileşimleri, kan ve lenfatik endotel hücre bağlantıları ve zaman atlamalı görüntüleme araştırmak için kullanılabilir. Bu makalenin amacı time-lapse görüntüleme yöntemi için protokol sağlamaktır. Bizim Örnek sonuçlar serumu ile anjiyojenezin uyarılmasında sonra canlı kalır ve dokuya özel anjiyojenik yanıtlar gibi endotel hücre takibi çalışmaları ölçülmesi için bu yöntemi kullanarak örnekleri sunmaktadır çok sayıda hücre türleri belge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri Tulane Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Cerrahi Prosedür Kurulumu
- Otoklav aletleri, cerrahi malzemeleri, ve ameliyat öncesinde kültür malzemeleri. Her sıçan için Cerrahi sarf malzemeleri şunlardır: 1 drape, önceden kesilmiş delik ile 1 örtüyü (0.5 x 1.5) merkezinde, gazlı bez ve 1 emici underpad. Cerrahi aletler şunlardır: bir sayı 10 bıçak ile 1 neşter, cımbız 2 çift ve ince bir makas. 1 drape, cımbız 1 çift ve polikarbonat filtreler ile 6-plaka ekler hazırlandı: Kültür malzemeleri bulunmaktadır.
- pleksiglas platformu, cerrahi bir evre ve% 70 etanol ile cerrahi tezgah üstü alan sterilize edin. steril bir kapta kullanıma kadar cerrahi sahne tutun.
- 100 mm kültür çanağı merkezi deliğe 1 ile yaklaşık 2 sondaj cerrahi alanı oluşturur. Sonra, pürüzsüz zımpara kağıdı kullanınherhangi bir keskin kenarları ve dokular için yükseltilmiş yüzey oluşturmak için deliğin kenarlarına silikon yapıştırıcı katman ekleyin.
- Alternatif olarak, CAD yazılımı kullanarak cerrahi sahne tasarım ve 3-D baskı (Şekil 1) yapmak.
- aşağı steril emici underpad yerleştirin ve bunun üstüne bir pleksiglas platformu yatıyordu. Emici underpad yanındaki ısıtılmış bir yastık üzerinde, bir önceden kesilmiş deliksiz, örtü yerleştirin.
- Steril bir fosfat tamponlu salin (PBS) önceden sıcak ortam, 37 ° C'ye kadar tuz. Bir sonraki cerrahi kurulum için bir 50 ml konik tüp ısıtma pedi ve yer tuzlu üstünde ayrı kültür kaplarına yerleştirin medya ve PBS.
- tüm paketler tüm malzemelerin steril kullanımını sağlamak için cerrahi başlamadan önce açılmış olduğundan emin olun. Bu prosedürde kullanılan yaygın araçların tam listesi listelenir Spesifik Cerrahi Malzemeler ve Araçlar Tablo.
2. mezentery Doku Hasat
- Kullanım erişkin erkek Wistar sıçanları (350 ± 25 g; 6 - yaş 8 hafta). Diğer suşlar ve sıçanların yaşları ikame edilebilir.
- Ketamin (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (8 mg / kg vücut ağırlığı) bir kas içi enjeksiyon ile sıçan anestezisi. sıçan bir refleks yanıt denetlemek için ayak parmakları arasında sıkıştırarak anestezi altında olduğunu teyit; hiçbiri olmalıdır. bu terminal prosedür için rüçhan analjezi gerekli değildir.
- Karın bölgesini Tıraş ve epilasyon kremi kullanarak kalan tüylerden. povidon-iyot, ardından% 70 izopropil alkol ile iki kez karın cildi silin. mendil cerrah cerrahi bölgenin merkezinde başlamalı ve daha önce steril gazlı bez veya steril pamuklu çubuk aynı parça ile temizlendi olan alanların üst üste olarak dairesel şekilde hazırlanan alanın dışına taşıyın. Sonra steril cerrahi kurulum hayvan transferi ve pleksiglas plat üstünde yerform.
- sternum altında 1 ile başlayan gut 1.25 kesi - Bir neşter bıçak kullanarak, bir 0.75 yapmak. bağırsak veya mezenter (cilt 1 kat, bağ dokusu 1 kat, ve kas 1 kat) delmek için dikkatli olun.
- kesi üzerinde önceden kesilmiş delik olan bir örtü koyun ve örtü üstünde bir steril cerrahi sahne yerleştirin. kesi ile açılış Uyum Gösterir olun. bulmak ve cerrahi evre delikten ileum çekin steril pamuk uçlu aplikatör kullanın.
- Pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak aşamasında 8 mezenterik pencereleri ve açılır pencere (Şekil 1) dokunmamaya dikkat - 6 çekin. Dokular, tipik haliyle çekum yakınındaki itibaren ince bağırsak ileum bölgesinden toplanır. çözeltisi damla steril bir şırınga kullanılarak gerektiği kadar ısıtılmış steril tuzlu su ile nemli maruz kalan dokuların tutun.
- Pentobarbital sodyum intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan (sıçan başına 0.2 mL) ile öldürülür. Beni çıkartmadan öncesenteric pencereler, sıçan kalbi palpe ötenazi sağlamak; Puls olmalıdır.
- pencere kesmek için yağ yastığı ve ince makas kapmak için cımbız kullanarak istediğiniz mezenter dokuları çıkarın. pencerenin çevresinde yağ (2 mm) bir sınır bırakın. medya içinde bir defa ısıtılmış, steril PBS içinde bir kez dokuları yıkayın.
- karın boşluğuna batın ileum dönün ve kurumsal kurallarına göre hayvanın imha edin.
Time-Lapse Çalışmaları 3. Mezenter Doku Kültürü
- Steril bir laminer akış kaputu Transfer otoklava kültür malzemeleri (bölüm 1.1) ve dokular.
- polikarbonat filtre zarı tepesinde her doku aktarmak için cımbız kullanın. yağ yastığı ile tut dokular damarsal hasar görmesini önlemek için.
- Hızla pencere dokunmamaya dikkat ederek, yağ yastığı kullanılarak doku yayıldı. 6-çukurlu plaka altına doku ile ekleme ters çevirin ve ortam 3 ml (Şekil 1 ile kapak
- En fazla 5 gün boyunca, standart inkübatör koşullarında her doku ve kültür (% 5 CO2, 37 ° C) 3.3 - Tekrar 3.2 adımları tekrarlayın.
Mezenter Doku 4. Time-Lapse Görüntüleme
- görüntüleme gününde, konjuge BSI-lektin iyi her ortam katkısı ve 30 dakika boyunca, standart kültür koşulları altında inkübe edilir. lektin özgür medya ile iki kez dokuları yıkayın. BSI-lektin leke kültüründe en fazla 3 gün süreyle mezenter dokusu üzerinde görünür kalacaktır.
- Bir mikroskop aşamasına plaka aktarın. kendi morfolojisi ve ağ yapısına dayalı kan ve lenf damarlarına belirleyin.
- Her doku üzerinde istenen ağ bölgesini bulun ve görüntü alabilir. görüntüleme dikkat edinAynı bölgeyi sağlamak için konum sonraki görüntüler için Çekilecek. Bir motorlu sahne kullanılıyorsa, koordinatları belge.
- inkübatör dokuları dönün ve istenen son noktaya kadar kültüre devam edin. Tekrarlayın 4.1 adımları - 4.3 istenilen deneysel zaman noktalarında bağlı gerektiği gibi.
5. Doku ile immün
- BSI-lektin Etiketleme
- ortam ile iki durulama ardından ortam içinde 1:40 FITC ile konjüge edilmiş lektin (6-gözlü plaka içinde çukur başına 2.5 ml antikor çözeltisi) 37 ° C'de 30 dakika boyunca doku inkübe edin. durular için, medya ekleyin ve sonra hemen değiştirin.
- Live / Dead Etiketleme
- 1 ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca doku inkübe: 500, 2 mM etidyum homodimer-1 ve 1: ortamı ile iki durulama sonra ortam 500, 1 mM Calcein AM (6-gözlü plaka içinde oyuk başına 2.5 ml antikor çözeltisi).
- BSI-lektin / NG2 Etiketleme
- Bir mikroskop yayılmış dokular kaydırdıe (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın.
- -20 ° C'de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın.
- 100 tavşan poliklonal NG2 antikor ve% 5 normal keçi serumu (NGS): Primer antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe edin. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın.
- İkincil antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: 100 keçi anti-tavşan CY2 bağlı antikor (GAR-Cy2) ve% 5 NGS. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın.
- PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin. durular için, PBS ekleyin ve sonra hemen değiştirin.
- slaytlar monte etmek için, üst 50:50 PBS ile doku ve gliserol çözeltisi ve yer lamel kapsamaktadır. oje kullanarak slayt kenarları mühür.
- LYVE-1 / PECAM Etiketleme
- bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın.
- -20 ° C'de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- 200 fare monoklonal biyotinile CD31 antikoru ve 1: Primer antikor etiketlemesi için 1, oda sıcaklığında 1 saat boyunca dokular inkübe 100 tavşan poliklonal LYVE-1 antikoru, PBS +% 0.1 saponin +% 2 sığır serum albümini (BSA) +% 5 NGS . PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- 500 Cy3-konjüge edilmiş streptavidin antikoru ve 1: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 GAR-Cy2 ikincil antikor etiketlemesi için, 1 1, oda sıcaklığında st için dokular inkübe edin. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- 50:50 PBS ve gliserol çözeltisi ile slaytlar, kapak dokularını mount ve üstüne bir lamel yerleştirin. oje kullanarak slayt kenarları mühür.
- BrdU / BSI-lektin Etiketleme
- ortam 1 mg / ml BrdU ekleme ve BrdU çözeltisi doku ortamı değiştirin. 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir.
- bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın.
- -20 ° C'de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS (3 x 10 dk) ile dokuları yıkayın.
- 37 ° C'de 1 saat boyunca 2M HCI doku DNA'yı denatüre. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) dokuları yıkayın.
- PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 monoklonal fare anti-BrdU: Primer antikor etiketlemesi için, 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe edin. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- İkincil antikor etiketlemesi için, 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: 100 keçi anti-fare Cy3-konjüge edilmiş antikor, PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS (GAM-Cy3). PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- üst slaytlar, kapak dokularını 50:50 PBS ile ve gliserol çözeltisi ve yer lamel monte etmek için. oje kullanarak slayt kenarları mühür.
- BSI-lektin / CD11b etiketleme
- bir mikroskop lamı üzerine dokulara yayılır (1-2 dokular / slayt) ve kurumaya bırakın. yağ çıkarılması için sıkıca bastırarak bir neşter ile aşırı yağ çıkarın.
- -20 ° C'de 30 dakika süreyle soğuk metanol dokuları düzeltildi. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- Primer antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 farede anti-fare CD11b. PBS +% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika) ile dokuları yıkayın.
- İkincil antikor etiketlemesi için 1 ile oda sıcaklığında 1 st için dokular inkübe: PBS +% 0.1 saponin +% 2 BSA +% 5 NGS 100 GAM-Cy3. PBS ile dokuları yıkayın+% 0.1 saponin ile (3 x 10 dakika).
- PBS ile iki durulama sonra PBS içinde 1:40 FITC konjüge lektin, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku inkübe edin.
- üst slaytlar, kapak dokularını 50:50 PBS ile ve gliserol çözeltisi ve yer lamel monte etmek için. oje kullanarak slayt kenarları mühür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültür içinde 3 gün sonra, dokular sıçan mezenter kültürü modeli (Şekil 2a) mikro-damar canlılığını gösteren bir ölü / canlı canlılığı / sitotoksisite kiti ile etiketlenmiştir. mezenterinde mevcut hücrelerin çoğu endotel hücrelerinin mikrovasküler segmentlerde konumlarına göre belirlenen edildi kültürde canlı kalmıştır. Endotel hücre çoğalması ayrıca lektin / BrdU etiketleme (Şekil 2D) ile teyit edilmiştir. Damarlar boyunca düz kas hücresi ve perisit varlığı NG2 etiketleme (Şekil 2B) ile teyit edilmiştir. LYVE1 ve PECAM için etiketleme lenfatik ve kan mikrovasküler ağları dallanma belirlenen ve kan endotel hücre fenotipi (Şekil 2C) karşı lenfatik muhafaza doğruladı.
Bu modelin time-lapse özelliği microva etiketleme ile kullanılmıştırfarklı zaman noktalarında BSI-lektin ve zamanla ağ içinde aynı bölgeyi görüntüleme ile scular ağlar; Bu özelliği dokuya özgü anjiyojenik tepkileri araştırmak için özellikle değerlidir. % 10 serum ile ortam takviyesi uyarımı 3 gün sonra güçlü bir anjiyojenik tepki neden oldu. Buna ek olarak, yeni damar segmentleri ve kılcal filizler 5 gün stimülasyon (Şekil 3) ile tanımlanmıştır. (Şekil 4) önce ve stimülasyon sonrasında ağ bölgelerin Kantitatif karşılaştırma için izin verilen zaman atlamalı görüntüleme yöntemi. Daha önceki sonuçları 9 doğrular bu temsili çalışmada, için, vasküler alana düşen damar sayısı ve vasküler alanı başına kılcal filizi sayısı dokusu başına bir 4X görüntüden ölçüldü. Kan damarı segmentleri iki şube noktaları ve kılcal filizi arasındaki mevcut lektin-pozitif kan endotel hücre segmentleri olarak tanımlandı sona kör olarak tanımlandı Bir ana bilgisayar geminin kaynaklanan segmentleri. Ağ bölgelerin Time-lapse karşılaştırma da (Şekil 6) endotel hücre bölümlerinin izleme (Şekil 5) ve kan / lenf damarı yanlış desen belirlenmesini sağladı. Lektin ve CD11b kültürlendi dokuların Etiketleme ek yeniden modelleme şebekelerinde geçiş yerleşik makrofajların varlığını (Şekil 7) doğruladı.
Şekil 1. Mezenterik pencereler cerrahi bir aşamasında ince bağırsağı dışarı çekerek bulunurdu. Cerrahi evre 3-D baskı tarafından tasarlanan ve yapıldı. Merkezi eliptik bir delik (A) yaklaşık 2 1 ile bulunmaktadır. Mezenterik pencereleri bir membran ucun üstüne yayılmış, sonra vardı ve uç ters ve iyi (B) konulmuştur. Ölçek çubuğu = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kan damarları sıçan mezenter kültür modelinde canlı kalır. Kültürden sonra gerçekleştirilen ölü / canlı deney, özellikle kan damarları (A) boyunca, ölü hücreler (kırmızı) için canlı hücreler (yeşil) yüksek bir oranını gösterdi. Mezenter dokular gemiler (yeşil) yanında perisitler (kırmızı) tespit etmek ve hücrelerin bu farklı kültür sonrası dokularında (B) 'de mevcuttur teyit etmek için, lektin ve anti-NG2 ile etiketlenmiştir. Dokular da PECAM karşı etiketli / LYVE-1 lenfatik kan (kırmızı) damarları tanımlamak için (yeşil) gemiler (C). mikrovasküler hücreler kültürde çoğalması tabi eğer araştırmak, mezenter dokular lektin / anti-BrdU ile etiketlenmiş . Lektin (yeşil) ile etiketlenmiş kılcal segmentlerde, birden fazla hücre çoğalma (kırmızı) (D) olarak teyit edildi. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sıçan mezenter Şekil 3. Time-lapse görüntüleme kültürünün boyunca mikrovasküler remodeling gözlemleyerek sağlar. Güçlü bir anjiyojenik tepki% 10 serum stimülasyonu ile kültür Şekil 3 (b) ve 5 gün boyunca (° C) sonra gözlenmiştir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
dosyaları / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg "/>
Sıçan mezenter kültür modelinde Şekil 4. Mikrovasküler ağları öncesi ve anjiyogenez sonra görüntülendi. % 10 serum ile gün 0 ve 3 (A, B) ile ilgili lektin ile etiketlenmiş aynı ağ sonrası uyarım karşılaştırması yeni damarlar tanımlar. Lektin da tanımlanamayan interstisyel hücre popülasyonu etiketler. Damar yoğunluğu (C, D) ve vasküler alanı (E, F) her kılcal filizlerin sayısının nicelleştirilmesi, her doku için, her iki metrik bir artış doğruladı. Önce c, e) (gün 0) ve doku başına sonra (3 gün) karşılaştırılması. D, F) Karşılaştırma gün 0 ile gündüz arasındaki eşleştirilmiş Student t-testi kullanılarak 3 ortalamaları damar alanı başına damar segmentlerinin ortalama sayısı (p <0.0001) ve filizi ortalama sayısı (p <0.00001 hem de önemli bir fark) doğruladı . Beyaz barlar gün 0 temsil ve siyah çubuklar 3. günde Valu temsiles ± SEM ortalamasıdır. Bu Örnek analiz için, 13 dokular 2 sıçandan toplandı. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sıçan mezenter kültür modeli 5. Şekil yakındaki ağların içine damar ada kaderi ve birleşme araştırmak için de kullanılabilir. bağlantısız endotel segmentler olarak tanımlanan time-lapse görüntüleme, vasküler adaları, kullanma, 0. günde tespit edildi ve yakındaki ağa bunların bağlantı gün 3 sonrası anjiyogenik uyarımı ile doğrulandı. Mezenter dokular bFGF (A, B) ve VEGF / PDFG-BB (C, D) ile uyarıldı. Içi boş oklar 0. günde bağlantısız segmentleri göstermek ve katı oklar networ ada bağlantıyı temsilk. Ok uçları bir damar ada ve yakındaki ağ arasındaki bağlantıların yerini göstermektedir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6. Time-lapse görüntüleri lenfatik ve kan damarı desenlendirme gözlemlemek için yeteneğini göstermek. Lenfatik (l) gemiler arteriyollerdeki (a) ve venüllerden ayırt edilebilir (v) gün 0 (A) üzerine etiketleme morfolojiye göre. % 10 serum ile 5 gün sonra stimülasyon üzerine, lenfatik morfoloji kaybetti ve damarlar yakın anjiyojenik kan damarlarının (B) ile entegre görünmektedir edilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.
Şekil 7. Makrofajlar kültürlü sıçan mezenterik dokularda mevcut kalır. % 10 serum ile 3 gün süre ile kültüre dokuların lektin / CD11b eş markalama lektin pozitif geçiş hücreler, makrofajların bir alt olduğunu göstermektedir. (A) BSI-lektin etiketleme bir temsilcisi görüntü. Aynı görüş alanında (B) CD11b etiketleme. (C) Birleştirilmiş görüntü. oklar ko-etiketleme örneklerini tespit. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol mikrovasküler ağ büyüme time-lapse görüntüleme için bir ex vivo aracı olarak sıçan mezenter kültür modeli kullanılarak için bir yöntem belgelemektedir. Laboratuvarımızda Önceki çalışmaları, 1 yönelik modeli) anjiyojenez 8, 2) lenfanjiyogenez 8, 3) perisit-endotelyal hücre etkileşimleri 8 ve 4), anti-anjiyojenik madde testi 9'a göre bir kullanım oluşturmuştur. Birden çok zaman noktalarında kültürlenmiş sıçan mezenter dokuların görüntülenmesi için yeteneği dokuya spesifik büyüme tepkileri ve çeşitli angiogenik stimuli sırasında hücre-hücre etkileşimleri izleme değerlendirmek için niceliksel tahlili bulunmaktadır. Anjiyogenez sırasında endotel hücrelerinin artan çoğalması ve perisitlere varlığı bizim daha önceki çalışmaları 8 ile tutarlı ve kültürlü sıçan mezenterik dokularında anjiyojenez sırasında birden fazla hücre tipleri arasındaki dinamik etkileşimleri doğrulamak.
in vitro hücre kültür sistemleri ile karşılaştırıldığında lass = "jove_content"> Sıçan mezenter kültürü modeli benzersizdir. Aksine bir kollajen jel 10 aort segmentlerden anjiyojenik filizlenmesini incelemek için kurulmuştur aort halka tahlil, düşünün. Aort ringde çimlenme birden hücre tipleri içerirken, kılcal filizi in vivo senaryo çok farklı aorta, eksize kesimleri dışında büyür. Beyin dilim modeli başka ex vivo model, ancak lenfatik damarların geçersizdir. Ayrıca, beyin dilim modeli öncesi ve anjiyojenik stimülasyon 11 sonra time-lapse görüntüleme yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir olmamıştır. En son katılan diğer bir eks vivo modeli, retina kültürü modelidir. Retina modelin avantajı anjiyojenez sağlam microvascu meydana gelir kidokuda 12, 13 içinde lar ağlar. Bu modellerde, GFP transgenik fare suşları, zaman içinde çimlenme kılcal gözlemleyebilecektir için kullanılabilir, ancak modelinde kullanıldığı gibi, ne yazık ki, fare mezenter, sıçan mezenter GFP transgenik farenin mezenter ikame elimine avasküler 14'tür. Ayrıca, kültür sıçan mezenter dokuların basit lektin etiketleme, farklı zaman noktalarında ve in vivo modellerde diğer ex göre ağ oluşumunu belirlemek için yeterli olduğunu göstermektedir, modeli kan ve lenfatik endotel hücreleri hem de eş zamanlı gözlem sağlar.
BSI-lektin mikrovasküler ağları görselleştirmek ve anjiyojenik tepkileri algılamak için bu yazıda kullanılmıştır. Lektin endotel hücreleri üzerinde glikoproteinler bağlanır ve endotel antib kıyasla nedeniyle kısa inkübasyon süresi için bu protokol seçildi bir protein yapısıody belirteçler. Lektin antikorlar daha az pahalı ve sabitleme gerektirmez; aynı zamanda kolayca kültür ortamı içinde karıştırılmış ve inkübasyon süresi sona erdikten sonra taze ortam ile ikame edilmiş olabilir. Gelecekteki çalışmalar anjiyogenik süreci lektin etiketleme tekniğinin potansiyel etkilerini aydınlatmak için gerekli olsa da, bizim temsilcisi sonuçları (Şekil 4) göstermek sağlam anjiyogenez kaynaklı olabilir ve önceki çalışma 9 lektin etiketli ağlarda anjiyogenez hedef yoluyla önlenebileceğini gösteriyor ki Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) bulunmaktadır. Antikor belirteçler potansiyel olarak daha spesifik belirteçler için bir ihtiyaç olduğunda, alternatif etiketleme yaklaşımı olarak kullanılabilir, ya da örneğin düz kas hücreleri, perisitler, destek ve sinirler gibi mikrovasküler ağlar içinde mevcut olan diğer hücre tipleri araştırmak için bir ihtiyaç olduğunda. görselleştirme hücreler için başka bir potansiyel yöntem gene olacaktır.
Time-lapse sıçan mezenter modeli kullanmanın avantajı bu protokol için temsilci sonuçlar vurgulanmıştır. Tedaviden önce ve sonra görüntü karşılaştırması olmayan ikili istatistiksel analiz etkileyen değişkenliği sorunları azaltır. eksplant spesifik yanıtlar damar yoğunluğu% 20 233% artış ve filiz yoğunluğu% 40 3.500 ila% artış değişiyordu. Bu varyasyon için özel nedenleri bilinmemektedir, ancak zamanla aynı dokuda büyüme ölçme dokuya özgü yanıtları onaylamak için yeteneği sunar.
mikrovasküler büyüme sırasında farklı zaman noktalarında görüntü karşılaştırmalı analizi, aynı zamanda, endotelyal hücrelerin izleme sağlar. Örneğin, laboratuar yakındaki ağların 15, 16 kesilir mikrovasküler ağların yakınında endotel hücre kesimleri gibi vasküler adaları belirlemiştir. Bu adalar yakınında networ bağlanmak onaylamak içinanjiyojenik uyarıcıya tepki olarak k, sıçan mezenter kültürü modeli kullanılmıştır. Şekil 5'te gösterildiği gibi, vasküler adalar temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) veya VEGF artı trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF), doku uyarıldıktan sonra izlenmiştir. Biz de (veri burada gösterilmemiştir) benzer sonuçlar sonrası serum stimülasyonu göstermiştir. anjiyogenez uyarılmasından sonra, başlangıçta bağlantısız vasküler adaları yakınında ağlara bağlanabilir bulunabilir.
Sıçan mezenter kültür modelinin diğer potansiyel uygulamalar lenfatik ve kan damarları ve kendi endotel hücreleri ve interstisyel hücre kader takibi arasındaki ilişkileri araştırmak için yeteneği kaldıraç olabilir. Önce ve bu modelde% 10 serum ile uyarıldıktan sonra aynı mikrovasküler ağların Time-lapse görüntüleri potansiyel lenfatik-to-kan damar entegrasyonu (Şekil 6) örnekler verdi. stimülasyon, lenfatik ve kan Vess önceels damar morfolojisi dayalı ayırt edildi. uyarıldıktan sonra, kan damarı kimlik karşı lenfatik az netleşti. Lenfatik / kan-Endotelyal Hücre Etkileşimlerinin potansiyel PECAM bir gözlemle desteklenmektedir PECAM bağlantı + / LYVE-1 kan endotelyal hücreler + / LYVE-1 + lenfatik endotel hücreleri (burada veriler gösterilmemiştir). Bu gözlemler lenfatik / kan endotel hücre plastisite araştırmak için sıçan mezenter kültür modelinin kullanımını desteklemektedir. Şekil 6A da belirgin interstisyel hücre lektin etiketleme vurgulamaktadır. Bu etiketleme tutarsız ve dokudan dokuya heterojen bir birlikte, endojen doku yerleşik hücrelerin varlığını vurgulamak mı. Kültürlü dokuların CD11b etiketleme (Şekil 7), bu lektin-pozitif interstisyel hücreler makrofajların bir alt kümesi olabileceğini düşündürmektedir. Makrofaj tutulum ortaya çıkan faiz anjiyogenez 20, ek bir gücü göz önüne alındığındaModel zamanla makrofaj dinamiklerini izlemek için kullanımı olabilir.
Çok ex vivo modelleri gibi, sıçan mezenter kültürü modelinde anjiyojenezi okuyan bir akım sınırlama kan akışının olmaması. Kan akışının neden olduğu kesme stresi endotel hücre morfolojisi ve proliferasyonu olarak anjiyojenez 17, 18, 19 bir rol oynadığı gösterilmiştir. Şekil 4'de yer alan Örnek sonuçlar için, kesme geriliminin yokluğu sadece kültür ağlarda anjiyojenik tepki meydana getirmeye yeterli olabilir. Ancak, sıçan mezenter kültür modeli 8 karakterize eden ilk yayına dayalı olduğunu biliyoruz, bu ortam takviyesi nedenleri yalnız medya karşı anjiyogenez arttı. kültürlü mikrovasküler ağ içinde akışını içeren gelecekteki çalışmalarda şüphesiz daha yakından taklit etmek için gerekli olanin vivo senaryoda. içeren akışı için potansiyel yaklaşımlar ağ besleyen arteriollerin kanül veya mezenterik pencerelerin yağ sınırları içinde daha yukarı arterlerin bile kanülasyon içerebilir. Ancak, akış olmamasına rağmen, birden fazla hücre tiplerinin canlılığı, anjiyogenez sırasında kan ve lenfatik mikrovasküler ağlar ve hücre çoğalması bakım in vitro modellerinde merkezli hücreye kıyasla karmaşıklık sıçan mezenter kültür modelin göreli artış düzeyini destekler.
Sonuç olarak, bu protokol, dokunulmamış mikrovasküler şebekelerinde anjiyojenik yanıtlar görüntülenmesi için basit ve tekrarlanabilir ex vivo usul tarif eder. Bu gibi bir yöntem olup, bir ağ ortamında belirli yerlerde anjiyojenik hücre dinamikleri değerlendirilmesi için in vitro bir model esas hücreye bir alternatif sunar. yöntem aynı zamanda anjiyogenez, lenfanjiogenetik ve kan / lenf araştırmak için yeni bir araç sunar mis-pıtırAynı anda ning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60 mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/mL |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
