Abstract
Angiogenese, defineret som væksten af nye blodkar fra allerede eksisterende fartøjer, indebærer endotelceller, pericytter, glatte muskelceller, immunceller og koordinering med lymfekar og nerver. Den multi-celle, multisystem interaktioner nødvendiggør undersøgelse af angiogenese i et fysiologisk relevant miljø. Medens anvendelsen af in vitro celle-kultur-modeller har tilvejebragt mekanistiske indsigt, en fælles kritik er, at de ikke rekapitulere kompleksiteten forbundet med en mikrovaskulær netværk. Formålet med denne protokol er at demonstrere evnen til at få tid-lapse sammenligninger af intakte mikrovaskulære netværk før og efter angiogenese stimulering i dyrkede rotte mesenterium væv. Dyrkede væv indeholder mikrovaskulære netværk, der opretholder deres hierarki. Immunhistokemisk mærkning bekræfter tilstedeværelsen af endotelceller, glatte muskelceller, pericytter, blodkar og lymfekar. I enddition, mærkning væv med BSI-lektin muliggør time-lapse sammenligning af lokale netværk regioner før og efter serum eller vækstfaktor stimulation karakteriseret ved øget kapillær spiring og skib tæthed. I sammenligning med almindelige cellekulturmodeller, denne fremgangsmåde tilvejebringer et værktøj til endotheliale celle afstamning undersøgelser og vævsspecifik angiogen evaluering lægemiddel i fysiologisk relevante mikrovaskulære netværk.
Introduction
Mikrovaskulær netværk vækst og ombygninger er fællesnævnere for væv funktion, sårheling, og flere patologier og en vigtig proces er angiogenese, defineret som væksten af nye blodkar fra eksisterende 1, 2. For tissue engineering nye skibe eller designe angiogene baserede terapier, at forstå vigtigheden af de cellulære dynamik involveret i angiogenese er kritisk. Men denne proces er kompleks. Det kan variere på bestemte placeringer inden for en mikrovaskulær netværk og involverer flere celletyper (dvs. endothelceller, glatte muskelceller, pericytter, makrofager, stamceller) og flere systemer (lymfatiske netværk og neurale netværk). Selvom in vitro-modeller har bidraget enormt til at undersøge forholdet mellem forskellige celler involveret i angiogenese 3, kan deres fysiologiske relevans blive undermineret på grund af thei r begrænset kompleksitet og det faktum, at de ikke afspejler nøje en in vivo situation. For at overvinde disse begrænsninger, tredimensionelle dyrkningssystemer 3, ex vivo vævsmodeller 4, mikrofluide systemer 5, 6, og beregningsmodeller 7 er udviklet og introduceret de senere år. Imidlertid er der stadig et behov for en model med time-lapse kapacitet til at efterforske angiogenese i intakte net mikrovaskulære ex vivo. Etableringen af nye time-lapse modeller for angiogenese studier med dette niveau af kompleksitet vil give et uvurderligt redskab til at forstå de underliggende mekanismer, der regulerer angiogenese og forbedre behandlinger.
En potentiel model, der muliggør ex vivo undersøgelse af angiogenese på tværs af et intakt mikrovaskulære netværk er rotter mesenteriet kulturmodel> 8. I seneste arbejde har vi vist, at blod og lymfe mikrovaskulære netværk forbliver levedygtigt efter kultur. Endnu vigtigere er, kan rotte mesenterium kultur model bruges til at undersøge funktionelle pericyt-endotel celle interaktioner, blod og lymfe endotel celle forbindelser, og time-lapse billeddannelse. Formålet med dette oplæg er at give vores protokol for time-lapse imaging-metoden. Vores repræsentative resultater dokumenterer de multiple celletyper, der forbliver levedygtigt efter stimulering af angiogenese med serum og tilbyde eksempler på anvendelse af denne fremgangsmåde til kvantificering vævsspecifikke angiogene responser samt endotelcelle-sporing undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg og procedurer blev godkendt af Tulane University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Kirurgisk Procedure Setup
- Autoklave instrumenter, kirurgiske forsyninger og kultur forsyninger før indgrebet. Kirurgiske forsyninger til hver rotte indbefatter: 1 drapere, 1 drapere med forskårne hul (0,5 x 1,5 in) i centrum, gaze puder, og 1 absorberende underlag. Kirurgiske instrumenter omfatter: 1 skalpel med en nummer 10 klinge, 2 par pincetter, og et par fine sakse. Kultur forsyninger omfatter: 1 drapere, en pincet, og forberedt 6-brønds plade skær med polycarbonatfiltre.
- Sterilisere en plexiglas platform, en kirurgisk fase og en kirurgisk benchtop plads med 70% ethanol. Hold den kirurgiske trin i en steril skål indtil anvendelse.
- Lav en kirurgisk fase ved at bore en ca. 2 i med 1 i hullet i midten af en 100 mm dyrkningsskål. Brug derefter sandpapir til at udjævneeventuelle skarpe kanter og tilføje et lag af silikone lim til hullets kanter for at skabe en hævet overflade til vævene.
- Alternativt designe den kirurgiske trin under anvendelse af CAD-software og gøre med 3-D trykning (figur 1).
- Placer en steril absorberende underlag ned og lægge et plexiglas platform på toppen af det. Placer afdækningsstykket, uden en forskåret hul, over en opvarmet pude ved siden af den absorberende underlag.
- Pre-varm steril phosphatbufret saltvand (PBS), medier og saltvand til 37 ° C. Place medier og PBS i separate dyrkningsskåle oven varmepuden og sted saltvand i et 50 ml konisk rør ved siden af den kirurgiske setup.
- Sørg for at alle pakker er åbnet før begyndelsen af operationen for at sikre steril håndtering af alle materialer. En komplet liste over de fælles værktøjer, der anvendes i denne procedure, der er anført i Tabel over specifikke kirurgiske materialer og værktøj.
2. Mesentery Tissue Høst
- Brug voksne Wistar-hanrotter (350 ± 25 g, 6 - 8 uger gamle). Andre stammer og aldre af rotter kan anvendes i stedet.
- Bedøver rotten via en intramuskulær injektion af ketamin (80 mg / kg legemsvægt) og xylazin (8 mg / kg legemsvægt). Bekræft rotten er under anæstesi ved at knibe mellem tæerne for at kontrollere, om en refleks reaktion; der bør være ingen. Forebyggende analgesi til denne terminal procedure er ikke nødvendig.
- Barbering maveregionen og fjerne de resterende hår ved hjælp af hårfjerning creme. Tør abdominal hud to gange med 70% isopropylalkohol efterfulgt af povidon-iod. For servietterne kirurgen bør starte i midten af det kirurgiske sted og flytte til ydersiden af det forberedte område i en cirkulær måde, at ikke overlapper områder, der tidligere er blevet skrubbede med det samme stykke steril gaze eller steril vatpind. Derefter overføre dyr til det sterile kirurgiske opsætning og sted på toppen af plexiglas platform.
- Ved hjælp af en skalpel, lave en 0,75 i - 1,25 i snit i tarmen begynder 1 i under brystbenet. Pas på ikke at punktere tarm eller mesenterium (1 lag af huden, en lag af bindevæv, og en lag af muskel).
- Placer en drapere med en pre-cut hul over incisionen og placere en steril kirurgisk etape på toppen af drapere. Sikre åbningen flugter med snittet. Brug sterile bomuld tippes applikatorer at lokalisere og træk ileum gennem den kirurgiske fase åbning.
- Træk 6 - 8 mesenteriske vinduer gennem scenen ved hjælp af bomuld-tippes applikatorer, og være omhyggelig med ikke at røre vinduerne (figur 1). Væv høstes typisk fra ileum region af tyndtarmen begyndende nær coecum. Hold udsatte væv fugtig med varmet sterilt saltvand efter behov ved hjælp af en steril sprøjte til at dryppe løsningen.
- Aflive rotten via intrakardial injektion af pentobarbital natrium (0,2 ml pr rotte). Før du fjerner migsenteric vinduer, sikre rotten aflivet ved palpating hjertet; der bør ikke være puls.
- Fjern ønskede mesenterium væv ved hjælp af en pincet til at gribe fat pad og fine saks til at klippe vinduet. Efterlad en kant af fedt (2 mm) omkring vinduet. Vask væv gang i opvarmet steril PBS og en gang i medierne.
- Retur eksterioriseret ileum til bughulen og bortskaffelse af animalske efter institutionelle retningslinier.
3. mesenterium Tissue Culture for time-lapse studier
- Overfør autoklaveres kultur leverancer (se afsnit 1.1) og væv til en steril laminar flow hætte.
- Brug pincet til at overføre hvert væv oven på en polycarbonat filtermembran. Grab væv ved fedt pad at undgå at beskadige karrene.
- Hurtigt bredte vævet ved hjælp af fedt pad, og pas på ikke at røre ved vinduet. Vend indsatsen med vævet ind i bunden af en 6-brønds plade og dække med 3 ml medium (figur 1
- Gentag trin 3.2 - 3.3 hvert væv og kultur i standard inkubator betingelser (5% CO2, 37 ° C) i op til 5 dage.
4. Time-Lapse Imaging af mesenterium Tissue
- På dagen for billeddannelse, supplere medierne i hver brønd med konjugeret BSI-lectin og inkuberes under standard dyrkningsbetingelser i 30 minutter. Vask væv to gange med lectin-frie medier. BSI-Lectin plet vil forblive synlige på mesenteriet væv i op til 3 dage i kultur.
- Overfør pladen til et mikroskop stadium. Identificer blod og lymfekar baseret på deres morfologi og netværk struktur.
- Finde en ønsket netværksområde på hvert væv og tage billeder. Vær opmærksom på imagingplacering for at sikre samme region vil blive fanget for efterfølgende billeder. Hvis du bruger en motoriseret etape, dokumentere koordinaterne.
- Retur væv til inkubatoren og fortsætte til kultur indtil ønskede slutpunkt. Gentag trin 4.1 - 4.3 Som en nødvendig afhængig af ønskede eksperimentelle tidspunkter.
5. Tissue immunolabeling
- BSI-Lectin Mærkning
- Inkuber væv i 30 minutter ved 37 ° C med 01:40 FITC-konjugeret lectin i medier (2,5 ml antistofopløsning pr brønd i 6-brønds plade) efterfulgt af to skylninger med medier. For skylninger, tilføjer medier og derefter straks udskiftes.
- Levende / Dead Mærkning
- Inkuber væv i 10 minutter ved 37 ° C med 1: 500 2 mM ethidiumhomodimer-1 og 1: 500 1 mM calcein AM i medier (2,5 ml antistofopløsning pr brønd i 6-brønds plade) efterfulgt af to skylninger med medier.
- BSI-Lectin / NG2 Mærkning
- Spread væv på et mikroskop glede (1 - 2 væv / dias) og lad det tørre. Fjern overskydende fedt med en skalpel ved at trykke godt ned for at udskære fedt.
- Fix væv i kold methanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask væv med PBS (3 x 10 min).
- For primært antistof mærkning inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 100 polyklonalt NG2 antistof og 5% normalt gedeserum (NGS). Vask væv med PBS (3 x 10 min).
- For sekundært antistof mærkning inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 100 gede-anti-kanin CY2-konjugeret antistof (GAR-CY2) og 5% NGS. Vask væv med PBS (3 x 10 min).
- Inkuber væv i 30 minutter ved stuetemperatur med 1:40 FITC-konjugeret lectin i PBS efterfulgt af to skylninger med PBS. For skylninger, tilføje PBS og derefter straks udskiftes.
- For at montere dias, dækker væv med 50:50 PBS og glycerol løsning og sted dækglas på toppen. Forsegl slide kanter ved hjælp af neglelak.
- Lyve-1 / PECAM Mærkning
- Spred væv på et objektglas (1 - 2 væv / dias) og lad det tørre. Fjern overskydende fedt med en skalpel ved at trykke godt ned for at udskære fedt.
- Fix væv i kold methanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For primært antistof mærkning inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 200 muse monoklonalt biotinyleret CD31 antistof og 1: 100 kaninpolyklonalt Lyve-1-antistof i PBS + 0,1% saponin + 2% bovint serumalbumin (BSA) + 5% NGS . Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For sekundært antistof mærkning, inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 500 CY3-konjugeret streptavidin antistof og 1: 100 GAR-CY2 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For at montere dias, dække væv med 50:50 PBS og glycerol løsning og placere et dækglas på toppen. Forsegl slide kanter ved hjælp af neglelak.
- BrdU / BSI-lectin Mærkning
- Tilsæt 1 mg / ml BrdU til medier og erstatte væv medier med BrdU løsning. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
- Spred væv på et objektglas (1 - 2 væv / dias) og lad det tørre. Fjern overskydende fedt med en skalpel ved at trykke godt ned for at udskære fedt.
- Fix væv i kold methanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask væv med PBS (3 x 10 min).
- Denaturere væv DNA i 2 M HCI i 1 time ved 37 ° C. Vask væv i PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For primært antistof mærkning, inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 100-monoklonalt muse-anti-BrdU i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For sekundært antistof mærkning, inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 100 gede-anti-muse Cy3-konjugeret antistof (GAM-Cy3) i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For at montere dias, dække væv med 50:50 PBS og glycerol løsning og sted dækglas på toppen. Forsegl slide kanter ved hjælp af neglelak.
- BSI-Lectin / mærkning CD11b
- Spred væv på et objektglas (1 - 2 væv / dias) og lad det tørre. Fjern overskydende fedt med en skalpel ved at trykke godt ned for at udskære fedt.
- Fix væv i kold methanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For primært antistof mærkning inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 100 muse anti-rotte CD11 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask væv med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For sekundært antistof mærkning inkuberes væv i 1 time ved stuetemperatur med 1: 100 GAM-Cy3 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask væv med PBS+ 0,1% saponin (3 x 10 min).
- Inkuber væv i 30 minutter ved stuetemperatur med 1:40 FITC-konjugeret lectin i PBS efterfulgt af to skylninger med PBS.
- For at montere dias, dække væv med 50:50 PBS og glycerol løsning og sted dækglas på toppen. Forsegl slide kanter ved hjælp af neglelak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 3 dage i kultur, blev vævene mærket med en levende / død levedygtighed / cytotoksicitet kit til at påvise levedygtigheden af mikrovaskulaturen i rotten mesenteriet kulturmodel (figur 2A). De fleste celler til stede i mesenteriet forblev levedygtige i kultur, hvor endotelceller blev identificeret baseret på deres placering i mikrovaskulære segmenter. Endotelcelleproliferation blev også bekræftet af lectin / BrdU mærkning (figur 2D). Glatte muskelceller og pericyt tilstedeværelse langs fartøjer blev bekræftet med NG2 mærkning (figur 2B). Mærkning for LYVE1 og PECAM identificeret forgrening lymfe og blod mikrovaskulære netværk og bekræftede den fastholdt lymfe versus blod endotel-fænotype (figur 2C).
Den time-lapse træk ved denne model blev brugt ved mærkning af microvascular netværk med BSI-lektin på forskellige tidspunkter og billeddannelse samme region i netværket over tid; denne evne er særligt værdifuldt for at undersøge væv specifikke angiogene reaktioner. Tilskud af medier med 10% serum forårsagede en robust angiogen respons efter 3 dages stimulation. Derudover blev nye fartøj segmenter og kapillarspirer identificeret ved dag 5 i stimulation (figur 3). Den time-lapse billeddannelse metode tilladt til kvantitativ sammenligning af netværks regioner før og efter stimulering (figur 4). Til denne repræsentativ undersøgelse, som bekræfter vores tidligere resultater 9, blev antallet af fartøjer pr vaskulær område og antallet af kapillarspirer pr vaskulær område kvantificeret fra en 4X billede pr væv. Blodkarrenes segmenter blev defineret som lectin-positive blod endotelcellespecifikke segmenter stede mellem to forgreningspunkter og kapillarspirer blev defineret som blind sluttede segmenter, der stammer fra en vært fartøj. Time-lapse sammenligning af netværk regioner også sporing af endotheliale celle-segmenter (figur 5) og identifikation af blod / lymfekar mis-mønsterdannelse (figur 6). Mærkning af dyrkede væv til lectin og CD11b desuden bekræftede tilstedeværelsen af interstitielle residente makrofager (figur 7) i remodeling net.
Figur 1. Mesenteriske windows blev placeret ved at trække tyndtarmen gennem et kirurgisk fase. Den kirurgiske fase er designet og lavet af 3-D print. Den elliptiske hul i midten er cirka 2 i med 1 i (A). De mesenteriske vinduer blev derefter spredt ud på toppen af en membran insert, og insertet blev vendt og anbragt i en brønd (B). Scale bar = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Blodkar forblive levedygtig i rotter mesenteriet kultur model. Levende / dead assay udført efter dyrkning viste et højt forhold af levende celler (grøn) til døde celler (rød) specifikt langs blodkarrene (A). Mesenterium væv blev mærket med lektin og anti-NG2, at identificere pericytter (rød) sammen fartøjer (grøn) og at bekræfte, at forskellige typer af celler er til stede i de post-kultur væv (B). Væv blev også mærket mod PECAM / Lyve-1 for at identificere blod (rød) fartøjer fra lymfe (grøn) fartøjer (C). For at undersøge, om mikrovaskulære celler undergår proliferation i kultur, blev mesenterium væv mærket med lektin / anti-BrdU . På kapillære segmenter mærket med lectin (grøn), blev flere celler bekræftet at være proliferativ (rød) (D). Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Time-lapse billeddannelse af rotte mesenterium muliggør observation mikrovaskulære remodeling i løbet af kulturen. En robust angiogen respons blev observeret efter 3 (B) og 5 dage (C) af kulturen med 10% serum stimulation. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
filer / ftp_upload / 55.183 / 55183fig4.jpg "/>
Figur 4. Mikrovaskulære netværk i rotte mesenterium kultur model blev afbildet før og efter angiogenese. Sammenligning af det samme netværk mærket med lektin på dag 0 og dag 3 (A, B) efter stimulation med 10% serum identificerer nye skibe. Lectin etiketter også en population af uidentificerede interstitielle celler. Kvantificering af kardensitet (C, D) og antallet af kapillarspirer pr vaskulær område (E, F) bekræftede en stigning i begge målinger for hvert væv. C, E) Før (dag 0) og efter (dag 3) sammenligninger pr væv. D, F) Sammenligning mellem dag 0 og dag 3 gennemsnit anvendelse af en parret t-test bekræftede en væsentlig forskel i både det gennemsnitlige antal skibssegmenter (p <0,0001) og det gennemsnitlige antal af spirer (p <0,00001) pr vaskulær område . Hvide søjler repræsenterer dag 0, og sorte søjler repræsenterer dag 3. Values er gennemsnit ± SEM. Til dette repræsentative analyse blev 13 væv høstet fra 2 rotter. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Rotte mesenterium kultur modellen kan anvendes til undersøgelse vaskulær ø skæbne og inkorporering i netværk i nærheden. Brug time-lapse billeddannelse, vaskulære øer, defineret som usammenhængende endotel segmenter, blev identificeret på dag 0 og deres forbindelse til den nærliggende netværk blev bekræftet ved dag 3 post-angiogene stimulation. Mesenteriet væv blev stimuleret med bFGF (A, B) og VEGF / PDFG-BB (C, D). Hule pile viser afbrudte segmenter på dag 0 og faste pile repræsenterer ø forbindelse til netværk. Pilespidser angiver placeringen af forbindelser mellem en vaskulær ø og den nærliggende netværk. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Time-lapse billeder demonstrerer evnen til at iagttage lymfe og blodkar mønster. Lymfe (l) fartøjer kan skelnes fra arterioler (A) og vener (v) baseret på mærkning morfologi på dag 0 (A). På dag 5 efter stimulation med 10% serum, er lymfe morfologi tabt og fartøjer synes at have integreret med de nærliggende angiogene blodkar (B). Scale barer = 100 um. Klik her for at se et størreversion af denne figur.
Figur 7. Makrofager være til stede i dyrkede rotte mesenteriske væv. Lectin / CD11b co-mærkning af væv dyrket i 3 dage med 10% serum antyder, at lectin positive interstitielle celler er en delmængde af makrofager. (A) En repræsentant billede af BSI-lektin mærkning. (B) CD11b mærkningen i samme synsfelt. (C) det flettede billede. Pilene finde eksempler på co-mærkning. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol dokumenterer en fremgangsmåde til anvendelse af rotte mesenterium kulturmodel som en ex vivo værktøj til time-lapse billeddannelse af mikrovaskulære netværk vækst. Tidligere arbejde i vores laboratorium har etableret brugen af vores model for 1) angiogenese 8, 2) lymfangiogenese 8, 3) pericyt-endotelcelle-interaktioner 8, og 4) antiangiogen drug test 9. Evnen til billeddannelse dyrkede rotte mesenterium væv på forskellige tidspunkter giver en kvantitativ analyse for at vurdere vævsspecifikke vækst responser og sporing af celle-celle-interaktioner under forskellige angiogene stimuli. Den øgede spredning af endotelceller under angiogenese og tilstedeværelsen af pericytter er i overensstemmelse med vores tidligere arbejde 8 og validere de dynamiske samspil mellem flere celletyper under angiogenese i dyrkede rotte mesenteriske væv.
in vitro cellekultursystemer, rotte mesenterium kulturmodel er unik, fordi vækst forekommer inden en intakt, real mikrovaskulære netværk. Tænk i modsætning aorta ring analysen, som blev etableret for at studere angiogene spiring fra aorta segmenter i en kollagen gel 10. Mens spiring i aortaringen involverer flere celletyper, kapillarspirer vokse ud af den udskårne segmenter af aorta, som er meget forskellig fra den in vivo scenario. Hjernen skive model er en anden ex vivo-model, men det er blottet for lymfekar. Desuden har hjernen skive modellen ikke vist sig at være i stand til time-lapse billeddannelse før og efter angiogen stimulation 11. En anden ex vivo-model, der for nylig er blevet indført, er nethinden kulturmodel. Fordelen ved nethinden model er, at angiogenese forekommer fra intakt microvascunende netværk i vævet 12, 13. For disse modeller, kan GFP-transgene mus stammer anvendes til at kunne observere kapillær spiring over tid, men desværre musen mesenterium er avaskulært 14, hvilket eliminerer GFP-transgene mus mesenteriet substitution for rotte mesenterium, som anvendt i vores model. Endvidere viser vi, at en simpel lectin mærkning af rotte mesenterium væv i kultur er tilstrækkelig til at bestemme væksten netværk på forskellige tidspunkter og i sammenligning med de andre ex vivo modeller, vores model giver mulighed for samtidig observation af både blod og lymfeendotelceller.
BSI-lectin blev anvendt i dette dokument til at visualisere mikrovaskulære netværk og detektere angiogene responser. Lectin er en proteinstruktur, der binder til glycoproteiner på endotelceller og blev udvalgt til denne protokol grund af sin korte inkubationstid sammenlignet med endotel AntibODY markører. Lectin er billigere end antistoffer, og det kræver ikke fastsættelse; den kan også let blandes i dyrkningsmedierne og erstattet med frisk medium Efter inkubationsperioden ender. Mens fremtidige studier er nødvendige for at belyse de potentielle virkninger af teknikken på den angiogene proces lektin mærkning, vores repræsentative resultater (figur 4) viser, at robust angiogenese kan induceres og tidligere arbejde 9 viser, at angiogenese i lectin mærkede netværk kan hæmmes via målrettet vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF). Antistofmarkører kan potentielt anvendes som en alternativ metode mærkning, når der er behov for mere specifikke markører, eller når der er behov for at undersøge andre celletyper, der er til stede i de mikrovaskulære netværk såsom glatte muskelceller, pericytter, og nerver. En anden potentiel metode til at visualisere celler ville være gentransfektion.
Fordelen ved at bruge time-lapse rotte mesenterium model er blevet fremhævet i de repræsentative resultater for denne protokol. Sammenligning af billeder før og efter behandling reducerer spørgsmål af variabilitet, der påvirker ikke-parrede statistisk analyse. Eksplantatet specifikke reaktioner varierede fra 20% til 233% stigning i fartøj tæthed og fra 40% til 3500% stigning i spire tæthed. De specifikke årsager til denne variation forbliver ukendte, men måling vækst i det samme væv med tiden præsentere evnen til at bekræfte vævsspecifikke reaktioner.
Sammenlignende analyse af billeder ved forskellige tidspunkter i løbet af mikrovaskulær vækst giver også mulighed for at spore endotelceller. For eksempel har vores laboratorium identificeret vaskulære øer som endotelcelle segmenter i nærheden af mikrovaskulære netværk, der er adskilt fra nærliggende netværk 15, 16. For at bekræfte, at disse øer forbindelse til nærliggende netværksindstillingerk som reaktion på angiogene stimuli, blev rotten mesenteriet kultur anvendte model. Som vist i figur 5, blev vaskulære øer spores efter væv stimulering med basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) eller VEGF plus blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF). Vi har også vist lignende resultater efter serumstimulering (data ikke vist her). Efter stimulering af angiogenese, findes de oprindeligt frakoblede vaskulære øer forbundet til netværk i nærheden.
Andre potentielle anvendelser af rotte mesenterium kultur model kunne udnytte evnen til at undersøge forholdet mellem lymfe og blodkar og deres respektive endotelceller og sporing af interstitiel celle skæbne. Time-lapse billeder af de samme mikrovaskulære netværk før og efter stimulering med 10% serum i denne model givet eksempler på potentielle lymfatisk-til-blodkar integration (figur 6). Før stimulering, lymfe og blod Vessels var skelnes baseret på fartøj morfologi. Efter stimulering, lymfe versus blodkar identitet blev mindre klar. Potentialet for lymfe / blod endotelcelle-interaktioner er støttet af observationen af PECAM + / Lyve-1- blod endotelceller forbinder med PECAM + / Lyve-1 + lymfatiske endotelceller (data ikke vist her). Disse observationer understøtter anvendelse af rotte mesenterium kulturmodel til undersøgelse lymfe / blod endotelcelle plasticitet. Figur 6A fremhæver også lectin mærkning af tilsyneladende interstitielle celler. Mens dette mærkning er inkonsekvent og uensartet fra væv til væv, det gør understrege tilstedeværelsen af endogene væv bosiddende celler. CD11b mærkning af dyrkede væv (figur 7) antyder, at disse lectin-positive interstitielle celler kunne være en undergruppe af makrofager. Givet den fremspirende interesse i makrofag involvering i angiogenese 20, en yderligere styrke afmodel kunne være brugen til at spore makrofag dynamik over tid.
Meget gerne andre ex vivo modeller, en strømbegrænsning studere angiogenese i rotter mesenteriet kultur model er den manglende blodgennemstrømning. Shear stress forårsaget af blodgennemstrømningen er blevet vist at spille en rolle i endotelcelle morfologi og spredning samt angiogenese 17, 18, 19. For de repræsentative resultater vist i figur 4, fraværet af forskydningsspænding alene kan have været tilstrækkeligt til at inducere et angiogent respons i de dyrkede net. Men vi ved, at baseret på vores første offentliggørelse karakteriserer rotte mesenterium kultur model 8, at medietjenesteudbydere kosttilskud medfører øget angiogenese versus medier alene. Fremtidige undersøgelser inkorporerer flow inden for de dyrkede mikrovaskulære netværk er uden tvivl behov for at mere nøje efterligner denin vivo scenario. Potentielle metoder til inkorporering af strømning kan omfatte kanylering af net feeding arterioler eller endda kanylering af yderligere opstrøms arterier inden fedt kant af mesenteriske vinduer. Men på trods af manglende flow, levedygtigheden af flere celletyper, opretholdelse af blod og lymfe mikrovaskulære netværk, og celledeling under angiogenese understøtter rotte mesenterium kultur model relative øget niveau af kompleksitet i forhold til cellebaserede in vitro-modeller.
Afslutningsvis denne protokol beskriver en enkel, reproducerbar ex vivo fremgangsmåde til billeddannelse af angiogeniske reaktioner i intakte mikrovaskulære netværk. En sådan metode tilbyder et alternativ til cellebaserede in vitro-modeller til evaluering angiogene celle dynamik på bestemte steder inden for et netværk miljø. Metoden giver også en roman redskab til undersøgelse angiogenese, lymfangiogenese og blod / lymfe mis-trippenning samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60 mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/mL |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
