Introduction
O objectivo deste estudo foi desenvolver uma tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT) metodologia base para quantificar o, in vivo, a absorção em tempo real de glucose a partir do fluxo de sangue para os tecidos específicos em ratos. Isto foi conseguido usando fluorodesoxiglucose 18 F-rotulado (FDG) para medir a absorção de glicose e de modelagem cinética para estimar as taxas de 18 captação F-FDG do plasma para o espaço intracelular, a taxa de transporte do espaço intracelular para o plasma e a taxa de 18 F-fosforilação de FDG.
Em roedores, 18F-FDG foi usado na avaliação pré-clínica de numerosos tratamentos contra o cancro 1, estudos de progressão do tumor e 2 metabolismo do tumor 3, bem como de imagem de depósitos de gordura marrom 4, 5 e neuroinflamation cérebro metabolismo 6
Os métodos tradicionais utilizados para examinar a absorção específica de tecido de glucose em ratinhos e ratos () geralmente envolvem o tratamento com 2-desoxiglucose marcada radioactivamente com qualquer 3 H ou 14 C, seguido por eutanásia, recolha de tecido e medição de radioactividade em cada tecido 7. O uso de PET / CT permite a determinação não invasiva da captação de glicose e do metabolismo em múltiplos órgãos e regiões simultaneamente em animais vivos. Além disso, como a eutanásia não é um requisito, esta técnica é adequado para utilização em estudos longitudinais.
Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado por um metabolismo perturbado glicose e hiperglicemia secundária a capacidade de resposta dos tecidos reduzida à insulina (resistência à insulina) e a incapacidade de -cells pancreáticas para produzir quantidades adequadas de insulina 8. análise cinética de absorção de glicose e do metabolismo pode fornecer importantes insights sobreo mecanismo de acção e eficácia de intervenções terapêuticas, bem como permitir a monitorização da progressão da doença avançada.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste estudo foram aprovados pelo Distrito de Saúde Sydney Local e Universidade de Comitês de Ética Animais Sydney e seguiu o Guia do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório, oitava edição (2011).
1. Preparação de animais
NOTA: Nesta db macho protocolo / db (BKS.Cg- Dock7 m + / + Leprdb / J) foram mantidas em habitação grupo com acesso ad libitum à comida e água até 6 semanas de idade. No momento da imagiologia, os ratinhos pesavam 30 g ~. Todos os ratos utilizados neste protocolo tinham jejum níveis de glicose no sangue entre 10 e 14 mmol / L.
- Se necessário, jejuar ratos. No presente exemplo, os ratos jejuar durante 5 h antes do procedimento experimental.
- Tratar os ratos com o agente desejado (por exemplo, droga, proteína, péptido) antes do início da imagiologia. Neste exemplo, administrar uma injecção subcutânea de insulina (3U / kg de insulina humana) ou o volume equivalente de PBS 30 min antes do início da imagiologia.
2. Defina o fluxo de trabalho
NOTA: Este protocolo foi implementado em um scanner PET / CT. Adquirir dados de PET primeiro, seguido por aquisição de dados CT.
- Configurações de estimação:
- Seleccionar isótopo como 18 F, definido de duração do varrimento a 3600 s, e discriminação do nível de energia superior e inferior a 350 keV - 650 keV (padrão) com uma janela de temporização coincidência de 3.432 ns (por defeito). dados de lista de modo histograma em 16 quadros (6 × 10 × 4 s, 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) para o período de 0-60 minutos após a injecção do marcador. Reconstruir emissão sinograms usando 2D-FBP com um zoom de 1,5.
NOTA: As imagens reconstruídas consistiu de 16 quadros dinâmicos, cada um com 128 × 128 × 159 voxels e um tamanho de voxel de 0,52 x 0,52 x 0,796 milímetros 3.
- Seleccionar isótopo como 18 F, definido de duração do varrimento a 3600 s, e discriminação do nível de energia superior e inferior a 350 keV - 650 keV (padrão) com uma janela de temporização coincidência de 3.432 ns (por defeito). dados de lista de modo histograma em 16 quadros (6 × 10 × 4 s, 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) para o período de 0-60 minutos após a injecção do marcador. Reconstruir emissão sinograms usando 2D-FBP com um zoom de 1,5.
- Configurações CT:
- Paraum varrimento CT todo o corpo, ajustar a corrente de 500 A, a tensão de 50 kV, tempo de exposição de 500 ms e 200 projecções mais de uma rotação de 360. Definir o campo de detector de visão (FOV) para 30722048, número de cama posições para três (para cobrir completa gama FoV PET), a sobreposição entre as posições de cama = 30,234713% e detector de arrumação de a 4.
NOTA: reconstrução CT foi realizada utilizando cone beam tomografia software de reconstrução de imagem com calibração HU, interpolação bilinear e filtro Shepp-Logan.
- Paraum varrimento CT todo o corpo, ajustar a corrente de 500 A, a tensão de 50 kV, tempo de exposição de 500 ms e 200 projecções mais de uma rotação de 360. Definir o campo de detector de visão (FOV) para 30722048, número de cama posições para três (para cobrir completa gama FoV PET), a sobreposição entre as posições de cama = 30,234713% e detector de arrumação de a 4.
- 18F-FDG:
- Ordem suficiente 18F-FDG (por exemplo 450 MBq em 0,5 mL) a partir de um fornecedor local para chegar ~ 30 minutos antes da primeira injecção. Alíquotas e diluir a 18F-FDG de modo que os animais recebem ~ 10 MBq de 18F-FDG em um volume final de 0,1 mL.
3. Protocolo de imagem
- Limpar abaixo câmara de indução e cama de imagem com 80% (v / v) de etanol para manter condições assépticas. Place o rato numa câmara de indução e anestesiar com 5% de isoflurano em oxigio.
- Colocar o rato sobre uma cama de imagens equipado com uma almofada de aquecimento eléctrico para manter a temperatura do corpo e uma precisão vaporizador cone de nariz para entregar isoflurano (manutenção, 1,5 - 2%) a um caudal de 1 L / min. Aplicar pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura, enquanto sob anestesia.
- Posicionar o rato em uma posição de bruços sobre uma almofada sensor para monitorizar a respiração e garantir uma adequada plano de anestesia é mantida.
- Aquece-se a cauda usando um aparelho de calor para 1 - 2 minutos para dilatar a veia lateral da cauda. Cateterize da veia lateral da cauda através da inserção de uma agulha de calibre 30 na veia lateral da cauda. Fixar a agulha no lugar com cola cirúrgica e fixar o cateter.
- imagiologia carga do leito no scanner e mover o leito através da máquina de forma que o cateter pode ser acedida a partir da parte traseira da máquina.
- Anexar o cateter para a seringa 18 F-FDG em um syrmotorista Inge. Calcular a exacta dose de 18 M-FDG (10 MBq) com base na actividade na seringa antes da injecção e o volume a ser administrado (<100? L, injectados ao longo de 10 s).
- Para minimizar o impacto da anestesia sobre a variabilidade da absorção de glicose, garantir uma constante de tempo entre a indução de anestesia e injecção de 18F-FDG (por exemplo, 30 minutos).
- Iniciar o PET scan imediatamente antes da injecção de 18F-FDG. Depois de terminar o varrimento de PET (3,600 s), executar um varrimento da TC (~ 10 min) para permitir que o co-registo de captação do radiofármaco com tecidos.
- Mover a cama de imagem para a posição de partida, remover o animal a partir do leito.
- Neste ponto eutanásia do animal ou permitir que ele se recuperar:
- Para a eutanásia, execute deslocamento cervical, embora ainda sob anestesia e recolher órgãos de interesse para análise posterior.
- Se permitir que o mouse para se recuperar, coloque o mouse na caixa de uma em uma almofada de aquecimento ouna frente de uma lâmpada de aquecimento. Monitore o rato até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Permitir que o mouse para se recuperar para 1 h antes de retornar ao alojamento em grupo.
4. Processamento de Imagem PET
NOTA: reconstrução imagem foi realizada utilizando aquisição local de trabalho v1.5.0.28 software e análise em v4.2 software trabalho de pesquisa.
- Co-registar imagens de CT e de PET e assegurar que o alinhamento está correcto em 3 dimensões.
- No menu 'File', selecione 'Pasta de Pesquisa / Import' e selecione a pasta que contém os dados. Selecione os dados PET e CT desejados e clique no separador 'Análise Geral.
- Classificar os dados para que o CR é designado 'Fonte' e PET é designado 'Target'. No menu 'Fluxo de Trabalho', selecione 'Registro'. Se as imagens exigir a regularização corretamente co-registrada, use as ferramentas no thMenu e 'Registro'.
- No menu 'Fluxo de Trabalho', selecione 'ROI Quantificação'.
- Use as funções 'Pan' e 'Zoom' no separador 'Imagem' para localizar a região desejada. No menu 'Ferramentas', selecione a guia 'Criar' e clique no ícone de pincel. Desenhe o ROI na imagem
- Extrair curvas de tempo-actividade, selecionando 'Salvar ROI Quantificação' no menu 'Save'. Salvar os dados como um arquivo CSV.
- Quantificar a captação de radioactividade como Bq por cm 3 de tecido. Converter os valores em percentagem de dose injectada por cm 3 (% ID / cm 3), carregando o ficheiro CSV para uma folha de cálculo.
Função 5. Input
- Para corrigir para a função de propagação ponto sistema, deconvoluir PSF sistema estimado para 5 iterações usando o método de desconvolução reblurred Van Cittert como anteriormente descrito 9.
NOTA: Isto é necessário devido ao pequeno tamanho da veia cava em um mouse. - Use imagens pós desconvolução para gerar uma curva de função de tempo-actividade de entrada de sangue como descrito acima.
6. Modelagem Kinetic
NOTA: O-dois tecido FDG modelo de compartimento (Figura 1) requer a função de entrada de plasma.
- Converter a função de entrada de sangue no CSV para a função de entrada de plasma utilizando a seguinte equação 10: Input_plasma = × Input_blood (0,386 e - 0.191t + 1,165).
- Na ferramenta de modelagem cinética clique no botão 'Kinetic'. Importar o tecido e atividade plasmática total contar arquivos CSV para a ferramenta de modelagem cinética, selecionando 'Load Tempo Actividade Curve' do 'Menu'.
- No menu 'Model' selecionar 2 compartimentos de tecido. Certifique-se de que a caixa ao lado de k4 é desmarcadae introduzir um valor de 0. Para a montagem inicial, desligue a caixa para VB (fracção de volume de sangue) e introduzir um valor de 2%.
- Clique no 'região atual Fit'. Corrigir a região extraída de interesse para dispersão 11, 12. Atingir este, minimizando o valor do qui-quadrado para o modelo de FDG para diferentes tempos de dispersão.
- Executar um segundo ajuste usando o valor vB flutuante (veja o quadro ao lado da caixa para VB) e o valor de dispersão optimizada para calcular as constantes da taxa de regionais (k -k 1 3). Calcular o influxo regionais constante como Ki = (k 1 × 3 k) / (k 2 + k 3).
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Representative Results
Nós já usou o modelo do rato db / db para investigar o impacto do aumento dos níveis plasmáticos apoA-I sobre a cinética de absorção de glicose e metabolismo 13. Neste estudo utilizou-se ratos db / db tratados com insulina para demonstrar a utilidade de imagiologia de PET / TC para monitorar a absorção de 18F-FDG do plasma para o músculo do gastrocnémio em tempo real.
Anestesiaram-se ratinhos db idade seis semanas e / db tratados com 3 L de insulina humana / kg, ou o volume equivalente de PBS por injecção subcutânea 30 min antes do início do varrimento de PET. Os ratinhos receberam 10 MBq de 18F-FDG através de injecção intravenosa e absorção medido por PET durante 60 min. A tomografia computadorizada foi realizada para referência anatômica.
Regiões de interesse foram desenhadas na vena cava e músculo gastrocnêmio usando as imagens CT (Figura 2). O tratamento de ratinhos db / db com insulina aumentaram a actividade de 18F-FDG na ROI gastrocnémio durante o período de tempo de aquisição (Figura 3A). Os valores obtidos para o ROI vena cava foram convertidas a partir de sangue para valores no plasma e não foram alterados por tratamento com insulina em insulina ratos tratados em relação ao controlo (Figura 3B).
As curvas de actividade de tempo foram carregados para a ferramenta de modelagem cinética para o cálculo dos parâmetros cinéticos. Os dados foram inicialmente ajustada a um método compartimento de dois tecidos com k 4 = 0 com um valor V b (fracção de volume de sangue) de 2% para calcular os valores de dispersão (80 s e 70 s para PBS e ratinhos tratados com insulina, respectivamente). Fitting foi então efectuada utilizando os valores de dispersão acima e um valor de b V flutuante.
Não houve diferença significativa na taxa de 18 F-Transporte de FDG a partir do plasma arterial para o espaço intracelular (k 1) ou a partir do espaço intracelular ao plasma (k 2) foi observada em ratos tratados com insulina, em comparação com o controlo (Tabela 1). A taxa de 18F-FDG fosforilação (k 3) foi significativamente aumentado em ratinhos tratados com insulina (7,06 ± 6,60 x 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 x 10 -2 min -1 para PBS e os grupos tratados com insulina, respectivamente; p <0,05 ). O tratamento com insulina também aumentou significativamente a constante de influxo (K i) em comparação com os animais tratados com PBS (5,51 ± 4,25 x 10 -4 vs 2,01 ± 0,28 x 10 -3 mL min -1 -1 g, respectivamente; p <0,05).
Figura 1: curvas de tempo-actividade da região foram ajustados a uma de duas tissu e, três modelo de compartimento, com C1 sendo a concentração de FDG no plasma e C2 e C3 a concentração de FDG e de FDG fosforilada em tecido, respectivamente. k 1 representa a taxa de absorção de FDG em tecido, k 2 a taxa de depuração a partir do tecido para trás para o compartimento do plasma e k 3 a taxa de fosforilação de FDG. A desfosforilação de FDG foi assumida como sendo insignificante (k 4 = 0).
Figura 2: Exemplo de desenho de regiões de interesse no músculo gastrocnémio (A) e vena cava (B) na imagem PET-CT um co-registado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: Curvas de tempo-actividade para regiões de interesse no músculo gastrocnémio (A) e vena cava (B). Murganhos db / db machos foram submetidos a jejum durante 4,5 h antes de receber a 3 U / kg de insulina (vermelho) ou o volume equivalente de PBS (branco). 18F-FDG (10 MBq) foi fornecido por meio de injecção intravenosa e 18 níveis F-FDG na vena cava e músculo gastrocnémio determinada por PET / CT durante 60 min. Os valores são média ± desvio padrão e expressa como percentagem de dose injectada, calculado a partir de um campo de visão (n = 4 / grupo). Modificado de Cochran et al. 13 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tratamento | k 2 | k 3 | K i | |
| (ml min -1 g-1) | (min-1) | (min-1) | (ml min -1 g-1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 x 10 -2 | 0,12 ± 0,11 | 7,06 ± 6,60 x 10 -3 | 5,51 ± 4,25 × 10 -4 |
| Insulina | 1,45 ± 0,59 x 10 -2 | 0,09 ± 0,05 | 2,26 ± 0,72 x 10 -2 * | 2,01 ± 0,28 x 10 -3 * |
Tabela 1: A análise cinética do aumento 18F-FDG a partir de plasma para o músculo do gastrocnémio de insulina tratada db /murganhos db. Os valores são média ± DP. * P <0,05 vs PBS de acordo com um teste de Mann-Whitney (n = 4 / grupo).
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Discussion
O protocolo aqui descrito representa uma metodologia sólida, não invasivo para determinar a cinética da captação de glicose da corrente sanguínea para o tecido e subsequente metabolismo em ratinhos.
O murganho db / db é um é um modelo animal bem estabelecido para a diabetes Tipo 2 14 que tem sido usado extensivamente para examinar a resistência à insulina e intervenções relevantes. No entanto, estudos anteriores têm apenas quantificado captação endpoint no coração 15 e músculo cardíaco e esquelético 16.
A utilização da análise cinética para determinar as constantes de velocidade fisiológicas e modelar a captação de 18F-FDG a partir de plasma para o tecido permite insights sobre o impacto de tratamentos antidiabéticos sobre a absorção de glicose e metabolismo. Além disso, estas experiências podem ser realizadas longitudinalmente para avaliar, por exemplo, o impacto da idade ou dieta sobre o metabolismo da glicose. Esta é advantageous sobre os métodos tradicionais que exigem a eutanásia e recolha de órgãos de interesse e, assim, fornecer informações apenas em um único ponto do tempo.
Enquanto anteriormente as funções de entrada foram determinados utilizando todo o coração 17, bem como coração, fígado e uma amostras de sangue de 18 em murganhos, o protocolo aqui descrito permite o cálculo da função de entrada utilizando uma região de interesse através da vena cava 19. Também é possível calcular as funções de entrada utilizando amostras de sangue arterial durante um estudo de PET. No entanto, este não é prático devido ao pequeno volume de sangue de ratinhos.
A utilização de uma função de entrada de plasma em vez de a 18 F-FDGsignal no sangue total é devido à absorção de 18F-FDG em células vermelhas do sangue do rato 20. Além disso, a actividade associada à célula de sangue vermelho representa 18F-FDG no interior das células vermelhas, e, portanto, énão facilmente disponível para o transporte em compartimentos de outros tecidos.
Neste protocolo, é crítica para assegurar a colocação correcta do cateter colocado na veia da cauda para a entrega do 18F-FDG bolus para a vena cava e por todo o corpo do rato. O aquecimento da cauda para dilatar a veia da cauda, melhora significativamente a facilidade de inserção deste cateter. Também é importante para garantir que as imagens de PET e CT são devidamente georeferenciados para que os ROIs desenhadas sobre a imagem CT correspondem corretamente ao sinal de PET.
Há algum debate sobre a escolha do agente anestésico em estudos que examinam a captação de glicose. Enquanto isoflurano é um anestésico veterinária vulgarmente utilizados, o uso de sevoflurano pode ser vantajoso em 18 experiências F-FDG PET 21. Neste protocolo, é importante garantir que qualquer enviesamento potencial associada com a anestesia isoflurano é minimizada mantendo o tempo betwindução een de anestesia e o início da constante de imagens.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
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