Introduction
本研究の目的は、 インビボで 、マウスにおける特定の組織への血流からのグルコースのリアルタイム取り込みを定量化するために陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法（PET / CT）ベースの方法を開発することでした。これは、細胞内の空間にプラズマから18 F-FDGの取り込みの速度を推定するために、細胞内空間からプラズマへの輸送の速度との速度のグルコース取り込みおよび動態モデリングを測定するための18 F標識フルオロデオキシグルコース（FDG）を使用して達成されました18 F-FDGのリン酸化。
げっ歯類では、18 F-FDGは、多くの癌治療1、腫瘍の進行2および腫瘍代謝3の研究だけでなく、褐色脂肪デポ4、神経炎症5と脳代謝6のイメージングの前臨床評価に使用されてきました
マウス（およびラット）におけるグルコースの組織特異的取り込みを調べるために使用される伝統的な方法は、一般に各組織7における放射能の安楽死、組織収集および測定した3 Hまたは14 Cのいずれかと2-デオキシグルコースの放射性標識を用いた治療を含みます。 PET / CTの使用は、生きた動物で、同時に複数の臓器や地域におけるグルコース取り込みと代謝の非侵襲的な決意することができます。安楽死が必要条件ではないように、さらに、この技術は、長手方向の研究で使用するのに適しています。
2型糖尿病（T2DM）は破壊グルコース代謝およびインスリンに対する減少組織応答に二次高血糖症（インスリン抵抗性）およびインスリン8の十分な量を生成するために、膵臓β細胞のできないことを特徴とします。グルコース取り込みと代謝の動態解析は重要な洞察を提供することができます治療的介入の作用及び効果の機構、ならびに、疾患の進行の高度な監視を可能にします。
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Protocol
すべてこの研究で説明する手順シドニー現地保健地区、シドニーの動物倫理委員会の大学によって承認され、 実験動物の管理と使用のための NIH ガイドに従った、第8版（2011年）。
1.動物の準備
注：このプロトコル雄のdb / dbマウス（BKS.Cg- Dock7 M + / + Lepr のdb / J）で6週齢まで固形飼料および水を随意アクセスの群ハウジングに維持しました。撮影時には、マウスは〜30グラムの重量を量りました。このプロトコルで使用されるすべてのマウスは、10及び14ミリモル/ Lの空腹時血糖値ました。
- 必要な場合は、マウスを高速。本実施例では、実験手順の前に5時間マウスを絶食。
- 撮像の開始前に所望の薬剤（ 例えば 、薬物、タンパク質、ペプチド）を有するマウスを治療します。この例では、インスリンの皮下注射を投与（3U / kgのヒトインスリン）又は等量のPBS 30分前に撮影を開始します。
2.ワークフローを設定します
注：このプロトコルは、PET / CTスキャナーに実装されました。 CTデータの取得に続いて、最初のPETデータを取得します。
- PETの設定：
- 650 keVの（デフォルト）3.432 NS（デフォルト）の一致タイミングウィンドウで- 18 F、3,600秒に設定し、スキャン時間、及び350 keVのに上下のレベルのエネルギー弁別として同位体を選択します。トレーサー注入後60分 - 期間0 16のフレーム（6×10秒、4×60秒、1×300秒、5×600秒）にヒストグラムリストモードデータ。ズーム1.5で2D-FBPを用いてサイノグラム放射を再構成します。
注：再構成画像16の動的フレーム、128×128×159ボクセルと0.52×0.52×0.796ミリメートル3のボクセルサイズを有する各々から成っていました。
- 650 keVの（デフォルト）3.432 NS（デフォルト）の一致タイミングウィンドウで- 18 F、3,600秒に設定し、スキャン時間、及び350 keVのに上下のレベルのエネルギー弁別として同位体を選択します。トレーサー注入後60分 - 期間0 16のフレーム（6×10秒、4×60秒、1×300秒、5×600秒）にヒストグラムリストモードデータ。ズーム1.5で2D-FBPを用いてサイノグラム放射を再構成します。
- CTの設定：
- ために全身CTスキャン、500 A、50キロボルトの電圧、露光時間500ミリ秒と360回転にわたって200個の突起で電流を設定します。 （完全なPET視野範囲をカバーする）3にベッド位置の数、30722048に検出器の視野（FOV）を設定し、4にベッド= 30.234713%位置と検出器ビニング間で重複。
注：CT再構成は、HU較正、バイリニア補間とシェップ - ローガンフィルタとコーン・ビーム断層撮影画像再構成ソフトウエアを用いて行きました。
- ために全身CTスキャン、500 A、50キロボルトの電圧、露光時間500ミリ秒と360回転にわたって200個の突起で電流を設定します。 （完全なPET視野範囲をカバーする）3にベッド位置の数、30722048に検出器の視野（FOV）を設定し、4にベッド= 30.234713%位置と検出器ビニング間で重複。
- 18 F-FDG：
- 十分な18 F-FDGを注文（例えば、0.5 mLの450 MBqの）ローカルプロバイダからは、最初の注射の前に約30分に到着します。動物は、0.1 mLの最終体積で18 F-FDGの約10 MBqのを受け取ることができるように、18 F-FDGをアリコートし、希釈します。
3.イメージングプロトコル
- 無菌状態を維持するために、80％（v / v）のエタノールで誘導チャンバーおよびイメージングベッドを拭います。プラ誘導チャンバ内にマウスをCEおよび酸素中の5％イソフルランで麻酔。
- 1L / minの流量で - （2％メンテナンス、1.5）イソフルランを送達するために、体温を維持するために電気加熱パッド及び精度気化器のノーズコーンが取り付けられた撮影台上にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を適用します。
- 呼吸を監視し、麻酔の適切な面が維持されることを保証するために、センサパッド上に腹臥位にマウスを置き。
- 外側尾静脈を拡張するために2分 - 1ための熱パックを使用して、尾を温めます。外側尾静脈に、30ゲージの針を挿入することにより、外側尾静脈にカテーテルを挿入。手術用接着剤で所定の位置に針を固定し、カテーテルを固定します。
- 負荷イメージングは、スキャナにベッドとカテーテルが機械の後方からアクセスできるように、機械を介してベッドを移動させます。
- SYRでの18 F-FDGシリンジにカテーテルを取り付けインゲドライバー。注射して投与される体積（<100μL、10秒かけて注入）の前にシリンジ内のアクティビティに基づいて、正確な18 F-FDGの用量（10 MBqの）を計算します。
- グルコース取り込みの変動に対する麻酔の影響を最小限に抑えるために、麻酔の誘導および（例えば、30分）、18 F-FDGの注射の間に一定の時間を確保します。
- PETは、18 F-FDGの注射の直前にスキャン開始。 PETスキャン（3600秒）を終えた後、組織と放射性トレーサー取り込みの共同登録を可能にするためにCTスキャン（〜10分）を行います。
- 開始位置に撮影台を移動させる、床から動物を削除します。
- この時点で、動物を安楽死させるか、それが回復することができます：
- 安楽死のために、麻酔下でまだながら頸椎脱臼を行い、その後の分析のための関心の臓器を収集します。
- マウスが回復することができた場合は、加熱パッドの上に単一のハウジング内にマウスを置きますか、加熱ランプの正面です。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでマウスを監視します。マウスは、グループハウジングに戻る前に1時間回復させます。
4. PET画像処理
注：画像の再構成は、研究職場ソフトウェアv4.2の中で取得職場ソフトウェアv1.5.0.28と分析を用いて行きました。
- CTとPET画像を同時登録及び位置合わせが全て3次元で正確であることを確認してください。
- 「ファイル」メニューでは、「フォルダの検索/インポート」を選択し、データを格納しているフォルダを選択します。希望PETとCTデータを選択し、「一般分析」タブをクリックします。
- ソートCRは、「ソースのデータを指定されているようにPETを「ターゲット」を指定されています。 「ワークフロー」メニューでは、「登録」を選択します。画像が正しく共同登録する調整が必要な場合は、番目のツールを使用E「登録」メニュー。
- 「ワークフロー」メニューでは、「ROI定量化」を選択します。
- 所望の領域の位置を特定するために「パン」と「画像」タブで「ズーム」機能を使用してください。 「ツール」メニューで、「作成」タブを選択し、絵筆のアイコンをクリックしてください。画像上にROIを描画
- 「保存」メニューから「保存ROI定量化」を選択することで、時間放射能曲線を抽出します。 CSVファイルとしてデータを保存します。
- 組織の1cm 3当たりベクレルなどの放射能の取り込みを定量化します。 CSVは、スプレッドシートにファイルをロードすることにより、1cm 3当たりの注射用量率（％ID / cm 3）との比率に値を変換します。
5.入力機能
- システムの点広がり関数を補正するために、以前に9に記載されているようreblurredヴァンCittertデコンボリューション法を用いて5回の反復の推定システムのPSFをデコンボリューション。
注：これが原因マウスにおけるヴェナ・キャバの小さなサイズに必要とされます。 - 上述したように、血液入力関数の時間 - 活性曲線を生成するために、ポストデコンボリューション画像を使用します。
6.キネティックモデル
注：FDG二組織コンパートメントモデル（ 図1）血漿入力関数を必要とします。
- Input_plasma = Input_blood×（ - 0.191トン + 1.165 0.386 E）：以下の式10を用いてプラズマ入力機能にCSVファイル内の血液入力関数を変換します。
- 運動モデリングツールでは「キネティック」ボタンをクリックしてください。組織および血漿総活性は、「メニュー」から「ロード時間の活性曲線」を選択することで、運動モデリングツールにCSVファイルをインポート数えます。
- 「モデル」メニューでは2つの組織区画を選択します。 K4の隣のボックスが選択されていないことを確認してくださいそして、VB（血液体積分率）のためのチェックボックスをオフにし、2％の値を入力し、初期フィッティングについては0の値を入力します。
- 「フィット現在の領域]をクリックします。分散11、12の対象の抽出された領域を修正します。異なる分散時間のためのFDGモデルのカイ二乗値を最小化することによって、これを達成。
- 地域の速度定数（k 1 -k 3）を計算するためにフローティングのVBの値（次のVBのためのボックスにチェックボックス）と最適化された分散値を用いて第2の適合を行います。 K iは =（K 1×K 3）/（K 2 + K 3）のような一定の地域の流入を計算します。
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Representative Results
我々は以前グルコース取り込みおよび代謝13の動力学にプラズマアポA-Iレベルの増加の影響を調査するために、db / dbマウスモデルを使用していました。本研究では、リアルタイムでの腓腹筋にプラズマからの18 F-FDGの取り込みを監視するためにPET / CTイメージングの有用性を実証するために、インスリンで処置したdb / dbマウスを使用しました。
6週齢のdb / dbマウスを麻酔し、30分のPETスキャンの開始前に、皮下注射を介して3 Uヒトインスリン/ kg、または等量のPBSで処置しました。マウスは60分間PETによって測定静脈注射および取り込みを介して18 F-FDGの10 MBqのを受けました。 CTスキャンは、解剖学的基準を行いました。
関心領域は、CT画像（Fを使用してヴェナ・キャバと腓腹筋上に描かれましたigure 2）。インスリンとのdb / dbマウスの処置は、取得期間（ 図3A）上腓腹筋ROIの18 F-FDGの活性を増加させました。ヴェナ・キャバROIについて得られた値は、プラズマ値に血液から変換し、制御（ 図3B）に対するインスリン処置したマウスにおいて、インスリン治療により変化しませんでした。
時間放射能曲線は、動力学的パラメーターの計算のための運動モデリングツールに装填しました。データは、最初に（PBSそれぞれインスリン処置したマウス、80のSおよび70 S）分散値を計算するために、2％のVのB（血液体積分率）値を有するK 4 = 0で2組織コンパートメント法に適合させました。フィッティングは、次いで、上記分散値とフローティングV b値を用いて行きました。
18の割合に有意な差がありませんF-細胞内空間（K 1）又は細胞内空間からの血漿（K 2）への動脈血漿からFDG輸送を制御した（ 表1）と比較して、インスリン処置したマウスで観察されました。 18 F-FDGのリン酸化（K 3）の速度を大幅に2.26±0.72×10 -2分-1それぞれPBSおよびインスリン処置群についての対インスリン処置マウス（7.06±6.60×10 -3に増加した; p <0.05 ）。インスリン治療はまた、有意に（それぞれ、2.01±0.28×10 -3 mLの分-1 G -1、対5.51±4.25×10 -4; P <0.05）、PBS処置動物と比較して、流入定数（K i）を増加させました。
図1：地域の時間-活性曲線は二TISSUに適合させましたすなわち、3つのコンパートメントモデル、C1は、プラズマとC2とC3それぞれの組織におけるFDG及びリン酸化FDGの濃度におけるFDGの濃度であることです。 K 1は、組織におけるFDG取り込み速度、バックプラズマ室及びK 3 FDGのリン酸化速度に対する組織からのK 2クリアランス速度を表します。 FDGの脱リン酸化は無視できる（K 4 = 0）と仮定しました。
図2：CO-登録PET-CT画像上の腓腹筋（A）における関心領域の描画とヴェナ・キャバ（B）の例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3：腓腹筋（A）及びヴェナ・キャバ（B）における関心領域のための時間-活性曲線。雄のdb / dbマウスは、前3 U / kgのインスリン（赤色）又は等量のPBS（黒）を受信することに4.5時間絶食させました。 18 F-FDG（10 MBqの）を60分間PET / CTによって決定腓腹筋及びヴェナ・キャバに静脈内注射し、18 F-FDGのレベルを介して送達しました。値は平均±SDであり、全視野（n = 4 /群）から計算し、注射した用量の百分率として表しました。コクランらから変更。 13 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 処理 | K 2 | K 3 | KのI | |
| （mLの分-1 G -1） | （分-1） | （分-1） | （mLの分-1 G -1） | |
| PBS | 1.31±0.42×10 -2 | 0.12±0.11 | 7.06±6.60×10 -3 | 5.51±4.25×10 -4 |
| インシュリン | 1.45±0.59×10 -2 | 0.09±0.05 | 2.26±0.72×10 -2 * | 2.01±0.28×10 -3 * |
表1：インスリン処置されたdbにおける腓腹筋へのプラズマからの増加18 F-FDGの動態解析/dbマウス。 値は平均±SDです。 * P <0.05対PBSマンホイットニー検定（n = 4 /群）に係ります。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、組織及びマウスにおける後続の代謝への血流からのグルコース取り込みの動態を決定するために、堅牢な非侵襲的方法を表します。
DB / dbマウスは、インスリン抵抗性と関連する介入を調べるために広く使用されている2型糖尿病14の十分に確立された動物モデルです。しかし、以前の研究では唯一の心15と心筋と骨格筋16にエンドポイントの取り込みを定量化しています。
生理学的速度定数を決定し、組織への血漿から18 F-FDGの取込みをモデル化するために動力学的分析の使用は、グルコースの取り込みおよび代謝における抗糖尿病治療の影響に洞察を可能にします。また、これらの実験は、例えば、評価するために縦方向にグルコース代謝の年齢や食生活の影響を行うことができます。これはアドバです関心の臓器の安楽死と収集が必要なので、単一の時点での情報を提供する従来の方法を超えるntageous。
入力機能は、以前に心臓全体17ならびに心臓、肝臓および血液サンプルマウス18を使用して決定されている一方で、ここで説明するプロトコルは、ヴェナ・キャバ19の上に関心領域を用いて入力関数の計算を可能にします。 PETの研究中に動脈血サンプルを使用して入力関数を計算することも可能です。しかし、これは、マウスの少量の血液量には非現実的です。
血漿入力関数ではなく、全血における18 F-FDGsignalの使用は、マウス赤血球20への18 F-FDGの取り込みによるものです。また、赤血球関連活性は、赤血球の内側に18 F-FDGを表し、それゆえであります他の組織区画への輸送のために容易に利用することができません。
このプロトコルでは、ヴェナ・キャバに、マウスの体全体に18 F-FDGボーラスの送達のために尾静脈に配置されたカテーテルの正確な配置を確実にするために重要です。大幅に尾静脈を拡張するために、尾の温暖化は、このカテーテルを挿入のしやすさを向上させます。 CT画像上に描画されたROIが正しくPET信号に対応するようにPETとCT画像が正しくcoregisteredされていることを確認することも重要です。
グルコース取り込みを調べた研究では麻酔剤の選択を超えるいくつかの議論があります。イソフルランは、一般的に使用される獣医の麻酔薬であるが、セボフルランの使用は、18 F-FDG PET実験21において有利であり得ます。このプロトコルでは、イソフルラン麻酔に関連する任意の電位バイアスがbetw時間を維持することによって最小化されることを保証することが重要ですEEN麻酔の誘導およびイメージング定数の開始。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
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