Summary
Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.
Abstract
Un des objectifs majeurs pour la médecine régénérative est la production et la maintenance de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dérivé des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs). Jusqu'à une date récente, efforts pour hPSCs se différencient en CSH ont généré principalement des progéniteurs hématopoïétiques qui manquent potentiel d’HSC et plutôt ressembler à l’hématopoïèse sac vitellin. Ces progéniteurs hématopoïétiques qui en résulte peuvent ont une utilité pour in vitro de modélisation maladie de divers troubles hématopoïétiques adultes, particulièrement ceux des lignées lymphoïdes limitée. Cependant, nous avons récemment décrit des méthodes pour générer l’érythro-myélo-lymphoïdes multilignées progéniteurs hématopoïétiques définitifs de hPSCs à l’aide d’un protocole spécifique au stade de différenciation dirigée, qui nous exposons ici. Par le biais de dissociation enzymatique du hPSCs sur la membrane basale enduit de matrice ustensiles en plastique, corps embryoïdes (EBs) sont forment. EBs sont différenciés au mésoderme par BMP4 recombinant, qui est spécifié par la suite au programme hématopoïétique définitif par l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021. Alternativement, l’hématopoïèse primitif est spécifiée par l’inhibiteur de la PORCN, IWP2. Hématopoïèse est plus entraîné par l’addition de recombinant VEGF et soutien hématopoïétique cytokines. Les progéniteurs hématopoïétiques résultants générés à l’aide de cette méthode ont le potentiel d’être utilisé pour la modélisation du développement, in vitroet de maladie.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont définis comme englobant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs) et ont la capacité unique non seulement en cours de renouvellement automatique dans des conditions appropriées de croissance, mais aussi, la capacité à se différencier en tous types de cellules dérivées des trois couches de germe : ectoderme, mésoderme et endoderme1. En raison de ces capacités uniques, hPSCs sont très prometteurs pour la médecine régénérative, modélisation de maladies et thérapies à base cellulaire2. Alors que plusieurs types de cellules ont été différenciés avec succès de hPSCs, un défi important est la spécification in vitro d’exclusivement adulte comme dérivé de hPSC les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et des progéniteurs hématopoïétiques définitifs.
Une barrière susceptible au développement du CSH humaine de hPSCs est la présence de multiples programmes hématopoïétiques dans l' embryon humain3. Le premier programme qui émerge, appelé « hématopoïèse primitif », prend sa source dans les tissus extra-embryonnaires sac vitellin et est mieux caractérisé par sa production transitoire des progéniteurs des érythroblastes (EryP-CFC), les macrophages et les mégacaryocytes. Notamment, ce programme ne donne pas lieu à CSH, ni il donne naissance à des progéniteurs lymphoïdes T et B. Toutefois, le sac vitellin transitoirement suscite restreints progéniteurs hématopoïétiques définitifs, tels que le progéniteur myéloïde érythro (EMP4,5,6,7,8) et le déficient érythroïdes lymphoïdes-amorcé multipotentes progéniteurs (PPSP9). Cependant, PGE ni LMPPs sont entièrement multipotentes, ou capable de prise de greffe de CSH-comme chez les receveurs adultes. En revanche, plus tard dans le développement, le programme hématopoïétique « définitif » classiquement définie est spécifié dans la région de l’aorte-gonades-celles de l’embryon proprement dit, donnant lieu à toutes les lignées hématopoïétiques adultes, y compris le HSC. La spécification de ces cellules hématopoïétiques définitifs intra embryonnaires se produit de manière Notch-dépendante, via une transition endothéliales-à-hématopoïétiques du hemogenic l’endothélium (il)3,10,11 ,12,13,14. En dehors de la capacité de reconstitution, le potentiel de multilineage et Notch-dépendance à l’égard de ces cellules peuvent être utilisé pour distinguer ces progéniteurs hématopoïétiques définitifs de l’EMP et le PPSP (révisé dans les références3,13 ).
Comprendre les mécanismes qui régissent la spécification hématopoïétique primitive et définitive de hPSCs est probablement essentiel à la production reproductible de progéniteurs hématopoïétiques définitifs dans un éventail de lignes hPSC. Jusqu'à tout récemment, des protocoles de différenciation hPSC qui pourraient séparer multipotentes progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives n’existaient pas de15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Beaucoup d’approches à l’aide de sérum fœtal (SVF) et/ou stromal co-culture tout d’abord souligné le potentiel hématopoïétique de différenciation hPSC, avec des mélanges de primitives et définitive hématopoïétiques potentiel15,16, 17,19,22,23,25. En outre, de nombreux protocoles sans sérum hématopoïétiques ont décrit les exigences en matière de signal pour la spécification du mésoderme de hPSCs qui abrite hématopoïétiques potentiels18,20,21, 24. Cependant, comme ces méthodes ont toujours donné lieu à des mélanges hétérogènes des deux programmes, leur utilisation dans des applications cliniques et de la compréhension des mécanismes du développement peut être limitée.
Nous avons récemment construit sur ces études, alors que nous avons décrit les exigences spécifiques au stade signal ACTIVIN/NODAL et signalisation WNT dans spécification hématopoïétique primitive et définitive du mésoderme dérivé hPSC18,26 . Ce dernier était particulièrement unique, car son utilisation de la manipulation de signaux spécifiques au stade WNT permet la spécification d’exclusive primitive ou exclusivement des progéniteurs hématopoïétiques définitif26. Au cours de la spécification du mésoderme, l’inhibition de la signalisation WNT canonique avec l’inhibiteur de la PORCN IWP2 se traduit par la spécification de CD43+ EryP-CFC et des progéniteurs myéloïdes, sans potentiel lymphoïdes détectable. Contraste, stimulation des canonique WNT signaling avec l’inhibiteur de la GSK3β, CHIR99021, au cours de la même étape de différenciation a provoqué l’absence totale de CD43 détectable+ EryP-CFC, tout en menant simultanément à la spécification du CD34+CD43− HE. Cette population possédait myéloïde, HBG-exprimant érythroïdes et lymphoïdes T potentiel. Les analyses subséquentes identifié ce qu’il manque l’expression CD7327,28 CD18428et son potentiel hématopoïétique était dépendante NOTCH28. En outre, unicellulaires analyses clonales ont démontré que ces lignées hématopoïétiques définitives pourraient provenir de cellules multipotentes28. Pris ensemble, ces études indiquent que stade WNT signaling manipulation permet de spécifier des progéniteurs hématopoïétiques primitives pures, ou multipotentes progéniteurs hématopoïétiques définitifs de NOTCH-dépendante.
Ici, nous exposons notre stratégie de différentiation qui génère des progéniteurs hématopoïétiques exclusivement primitifs ou définitifs, par manipulation de canonique WNT signalisation lors mésodermiques structuration et leur lignée hématopoïétique en aval des essais. Ce protocole est d’une grande utilité pour les chercheurs qui s’intéressent à la production de progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs de hPSCs pour les applications de la médecine régénérative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. réactifs
- obtenir cell lines ; CSEh ou hiPSCs 1, souris fibroblastes embryonnaires (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
- préparation du réactif
- préparer une solution à 0,1 % p/v de la gélatine dans du PBS. Stériliser à l’autoclave et conserver à 4 ° C après aliquotage.
- Prepare les ustensiles en plastique enduit de gélatine. Manteau 6 paraboloïdes avec 1,5 mL de solution de gélatine de 0,1 %. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Immédiatement avant l’emploi, aspirer la solution de gélatine restante.
- Préparer les médias MEF en faisant IMDM avec 15 % v/v FBS et 1 x antibiotiques. Compléter avec 2 mM de L-glutamine et 400 µM monothioglycerol (MTG) avant utilisation et conserver à 4 ° C.
- Préparer les milieux de culture hPSC comme solution de DMEM/F12 avec 20 % v/v knockout sérum de remplacement (KOSR), 1 x non essentiels des acides aminés (NEAA), 1 x antibiotiques, 55 µM β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine et 10 ng/mL bFGF. Filtre pour stériliser avec un filtre de 2 µm et stocker dans l’obscurité à 4 ° C.
- Préparer le milieu sans sérum médias de lavage comme une solution de DMEM/F12 avec 5 % v/v KOSR et HCl. filtre de 4 mM à stériliser avec un filtre de 2 µm, aliquot et stocker dans l’obscurité à 4 ° C.
- Faire une DNase 1 mg/mL j’ai solution en dissolvant la DNase I pour 3-4 h dans l’eau désionisée glacee, stérile sur la glace. Filtre pour stériliser avec un filtre de 2 µm et stocker les aliquotes à -20 ° C.
- Préparer la solution d’arrêt avec les médias de lavage : ajouter 10 % FBS et 10 µg/mL DNase I. La solution d’arrêt doit être préparée juste avant utilisation.
- Préparer la matrice de la membrane basale (p. ex., matrigel, dénommé MAT sur le connaissement) solution de mélange.
Remarque : Toutes les étapes de préparation et d’utilisation du mélange MAT doivent être effectuées sur la glace ou à 4 ° C. dégel congelés MAT dans la glace à 4 ° C durant la nuit. Diluer le MAT 1:1 en ajoutant 10 mL glacée IMDM et froid dans la glace à 4 ° C la nuit. Diluer le mélange MAT avec une autre 20 mL glacée IMDM et froid dans la glace à 4 ° C la nuit. Aliquote dans des tubes préalablement réfrigérées et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, décongeler MAT mélange nuit à 4 ° C. Plaques de culture cellulaire- manteau le MAT.
Remarque : Toutes les étapes de revêtement MAT plaques devraient être effectuées sur la glace. Plaques 6 puits et 24 plats pré refroidissement à-20 ° C pendant au moins 1 h. Lorsque vous êtes prêt à plaques de couche, placez-les sur la glace. Enrober chaque puits avec 4 x dilué MAT, enlever et réutiliser tout excédent de solution. Laissez sur la glace pendant 30 à 60 min et aspirer les tapis de l’excès. Sécher les plaques de revêtement MAT dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2 pendant au moins 3 h. utilisation dans les 72 h du revêtement.
- manteau le MAT.
- Préparez la solution de 10 % de sérum albumine Bovine (BSA) en dissolvant 10 % p/v BSA dans l’eau glacée, distillée, déminéralisée à 4 ° C pendant 3-4 h. filtre à stériliser avec un filtre de 2 µm dans un magasin et occultants bouteille à 4 ° C.
- Préparer la solution d’acide ascorbique. Lentement dissoudre une solution de 5 mg/mL d’acide L-ascorbique dans l’eau glacée, distillée, déminéralisée sur glace pendant 3-4 h. tourbillon parfois jusqu'à dissolution. Filtre pour stériliser avec un filtre de 2 µm et stocker les aliquotes à -20 ° C.
- Préparer les médias sans sérum différenciation (SFD) en faisant une solution de 75 : 25 de IMDM:Ham ' s F-12, puis ajouter 0,5 % de BSA, 1 x B27 et 0,5 x N2 suppléments. Conserver à 4 ° C. Ajouter 1 x L-glutamine, 50 µg/mL d’acide ascorbique, 400 µM MTG et 150 µg/mL holo-transferrine immédiatement avant d’utiliser.
- Préparation des milieux de culture sans sérum des cellules souches (p. ex., StemPro, dénommé SP34 sur le connaissement) par le fabricant ' instructions de s. Conserver à 4 ° C. Ajouter 1 x L-glutamine, 50 µg/mL d’acide ascorbique, 400 µM MTG et 150 µg/mL holo-transferrine immédiatement avant d’utiliser.
- Préparer la solution de collagénase II de 0,2 % par dissolution collagénase II à une concentration finale de 0,2 % p/v dans la solution de FBS:PBS de 1:4. Dissoudre au bain-marie à 37 ° C pendant au moins 15 min. filtre pour stériliser la solution avec un filtre de 2 µm et stocker les aliquotes à -20 ° C.
- Préparer le buffer de tri cellulaire activé par Fluorescence (FACS) comme une solution de 5 % FBS dans IMDM immédiatement avant d’utiliser.
- Préparer OP9 médiatique comme une solution de α-MEM, 20 % FBS, 2 mM de L-glutamine et 1 x antibiotiques. Filtre à stériliser avec un filtre de 2 µm et conserver à 4 ° C.
- Obtenir de méthylcellulose axée sur les médias (p. ex., MethoCult, dénommé MeC sur le connaissement) comme quantités pre-aliquotés 3 mL ou une bouteille de 100 mL. Si vous utilisez les 100 mL MeC, à son arrivée, diviser en parties aliquotes de 2,5 mL de tubes coniques 14 mL.
Remarque : Toutes les parties aliquotes doivent être conservés à moyen de MeC-20 ° C. parties aliquotes doivent être décongelés immédiatement avant d’utiliser.
- préparer une solution à 0,1 % p/v de la gélatine dans du PBS. Stériliser à l’autoclave et conserver à 4 ° C après aliquotage.
2. Mésoderme différenciation des hPSCs
- Grow la hPSC lignées cellulaires sur MEFs à confluence de 70 à 80 %, dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2.
Remarque : Le hPSCs doit avoir des frontières nettes et indifférenciées. - Ustensiles en plastique enduit MAT préparer 24h avant le passage de l’hPSCs.
Remarque : Le nombre total d’enduit MAT 6 puits plats varie dans l’ensemble de lignes hPSC. Normalement, trois plats de 6 puits suffisent par plat de 6 puits de hPSCs confluentes sur MEFs.- Effectuer un essai feeder-appauvrissement de la couche avec des ratios différents de puits hPSCs:MAT anastomosé (1:4, 1:3, 1:2, etc.) avant la première différenciation pour déterminer combien enduit MAT 6 puits plats doivent être utilisés pour des différenciations ultérieures.
Remarque : 24 h après le placage sur tapis, la hPSCs doit être anastomosé de 80 à 90 %, avec des touffes de cellule d’environ 10-20 cellules de taille.
- Effectuer un essai feeder-appauvrissement de la couche avec des ratios différents de puits hPSCs:MAT anastomosé (1:4, 1:3, 1:2, etc.) avant la première différenciation pour déterminer combien enduit MAT 6 puits plats doivent être utilisés pour des différenciations ultérieures.
- Aspirer les médias hPSC et ajouter 1 mL de 37 ° C 0,25 % trypsine-EDTA à chacun bien pendant 1 min. aspirer et ajouter 1 mL de milieu de STOP dans chaque puits. À l’aide d’un grattoir de cellules, gratter les cellules de la plaque. Ajouter 1 mL de tampon de lavage à chaque puits.
- Avec une pipette sérologique de 2 mL, triturer 3 - 5 fois pour casser vers le haut de grosses touffes de cellules et de transférer les cellules dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger le hPSCs à 330 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans un volume total de médias hPSC équivalent à 2 mL par puits des contenants de plastique MAT-enduit à utiliser. Ajouter 2 mL/puits de hPSCs dans les ustensiles en plastique et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO 2.
- 24 h plus tard, aspirer les médias et remplacer par 37 ° C 0,05 % trypsine-EDTA pour 1 min. aspirer la trypsine-EDTA et ajouter 1 mL de milieu de STOP. Grattez les cellules vigoureusement avec un grattoir de cellules. Ajouter 1 mL de milieu de lavage à chaque puits. Avec une pipette sérologique de 2 mL, triturer les cellules 1 ou 2 fois et transvaser dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger les cellules à 220 x g pendant 5 min.
Remarque : La durée de la trypsine-EDTA traitement shouLD déterminés par l’enquêteur pour chaque ligne de hPSC. Le traitement par la trypsine appliquer aussi longtemps que possible sans provoquer la dissociation de cellule unique. Cette étape devrait détacher tous les hPSCs sur les plaques de revêtement MAT, mais pas donné lieu à la dissociation des cellules individuelles. EBs qui en résulte doit être 6-10 cellules, enmoyenne. - Aspirer les médias. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, resuspendre doucement les cellules de 20 mL de milieu de lavage. Centrifuger à 220 x g pendant 5 min.
- Resuspendre doucement l’EBs dans médias jour 0 (tableau 1). Verser 2 mL de milieu de différenciation contenant EBs dans chaque cupule d’une boîte de culture cellulaire faible 6 puits adhérentes à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Place dans un incubateur à 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 (gaz).
Remarque : Médias de jour 0 : médias SFD additionné de 10 ng/mL BMP4 (tableau 1). Pour chaque deux plaques de hPSCs, utilisez une boîte de Petri de 6 puits peu adhérentes cellule. - 24 h plus tard, ajouter 2 mL 1 jour médias (tableau 1). Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur multi-gaz.
NOTE : Médias jour 1 : médias SFD additionné de 10 ng/mL BMP4 et 10 ng/mL bFGF dans chaque cupule (tableau 1). - 18 h plus tard, doucement récolter l’EBs avec une pipette sérologique de 5 mL et un essorage à 100 x g pendant 5 min. laver et combiner les cultures entières 10 ml IMDM. Essorage a 100 x g pendant 5 min. aspirer les médias.
Remarque : Les débris existera dans les cultures. Cette étape de centrifugation à faible vitesse (100 x g) va supprimer les débris. - Resuspendre doucement l’EBs dans les médias SFD additionnés de jour 2 médias (tableau 1) et puis diluer 2 mL par puits dans des plaques de culture cellulaire 6 puits peu adhérentes. Incuber dans un incubateur multi-gaz à 37 ° C pour 30 h.
NOTE : Médias jour 2 : 10 ng/mL BMP4 et 5 ng/mL protéine et l’approprié WNT agoniste ou un antagoniste (tableau 1).- Ajouter 3 µM CHIR99021 pour spécifier les progéniteurs hématopoïétiques définitifs. Sinon, ajouter 3 µM IWP2 et 1 ng/mL activine A pour spécifier des progéniteurs hématopoïétiques Primitives.
- Continuer à la Section 3 pour la spécification des cellules souches hématopoïétiques.
3. spécification du CD34 + progéniteurs hématopoïétiques
- après 30 h, isoler l’EBs avec une pipette sérologique de 2 mL au jour 3 de différenciation. Transvaser dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 330 g pour 5 min. Resuspendre doucement et laver avec 10 mL d’IMDM. Centrifuger les cellules à 330 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension l’EBs en milieu de journée 3 (tableau 2) et verser 2 mL dans chaque puits de plaques 6 puits peu adhérentes. Incuber les cellules dans un incubateur multi-gaz à 37 ° C pendant 72 h.
NOTE : Médias jour 3 : SP34, additionné de 15 ng/mL VEGF et bFGF 5 ng/mL (tableau 2). Ajouter des éléments multimédias plus / puits si le pH du milieu récoltés le jour 3 de différenciation a changé considérablement (c.-à-d. médias jaune-orange). Alternativement, utiliser moins d’EBs / puits au jour 0. - Après 72 h d’incubation, ajouter 2 mL de jour 6 médias (tableau 2) dans chaque puits. Incuber dans un incubateur à 37 ° C multi-gaz pour une supplémentaire 48 h.
NOTE : Médias jour 6 : médias SP34 additionné de 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 UI OEB, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 et 50 ng/mL de IGF-1 (tableau 2). Si plusieurs médias a été ajouté à l’étape 3.1, puis ajouter la quantité équivalente de médias à l’étape 3.2 pour que les concentrations de cytokine final restent le même. - Isoler l’EBs traités CHIR99021 sur 8 jours de la différenciation. Passez à la Section 4.
- IWP2-EBs traitées sont récoltées sur 8 jours de différenciation dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 330 x g pendant 5 min. Resuspendre doucement au jour 8 médias (tableau 2). Incuber pendant 24 heures dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2 en bas plats adhérentes. Passez à la Section 4.
NOTE : Médias jour 8 : SP34 milieux supplémentés avec 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL de IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L et 30 ng/mL IL-3 (tableau 2).
4. Enzymatique de Dissociation de l’EBs et isolement de progéniteurs hématopoïétiques
tube- isolat l’EBs avec une pipette sérologique dans une conique de 50 mL. Centrifuger à 330 x g pendant 5 min aspirer hors du surnageant.
- Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA à l’EBs. Vortexer pendant 5 s. Incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 8 min. Ajouter 5 mL de solution d’arrêt. Centrifuger à 330 x g pendant 5 min aspirer hors du surnageant.
- Remettre en suspension l’EBs dans 5 mL de collagénase II. Vortexer pendant 5 s et incuber dans un bain-marie à 37 ° C. Après 60 min, Vortexer pendant 5 s et ajouter 5 mL de solution d’arrêt. Tournant à 330 x g pendant 5 min. aspirer hors du surnageant.
- Dans 1 mL de tampon de FACS, remettre les cellules en suspension. Passer les cellules à travers un tamis de cellule de 40 µm. Cette opération supprime tout amas de cellule non dissocié.
- Compte les cellules non vides. Aliquote 1 x 10 6 cellules dans un tube conique 14 mL. Faire tourner les cellules à 330 x g pendant 5 min. remettre les cellules à une concentration de 5 x 10 6 cellules/mL dans le tampon de FACS. Aliquote et piscine 10 % des cellules dans chaque État pour les contrôles de couleur de cytométrie en flux. Incuber les cellules en anticorps pendant 30 minutes sur la glace, dans l’obscurité.
NOTE : Voir a suggéré un fluorophore combinaisons dans la Table des matières.- Les cellules traitées pour IWP2, utiliser des anticorps anti-CD34 et anti-CD43.
- Les cellules traitées pour CHIR99021, utiliser des anticorps anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 et anti-CD184.
- Rincer les cellules deux fois à l’aide de tampons de FACS. Tourner à 330 g pour 5 min. remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules/mL.
- Analyser ou isolat cellules par cytométrie en flux. Pour les progéniteurs hématopoïétiques primitives, analyser l’expression CD34 et CD43 ( Figure 2 a). Pour les progéniteurs hématopoïétiques définitifs, isoler le HE (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) par FACS ( Figure 2 b). Recueillir les cellules dans des tubes contenant un tampon de FACS réfrigéré.
- Pour évaluer le potentiel hématopoïétique définitif d’isolée HE, continuer à la Section 5 pour la transition endothéliales-à-hématopoïétique ou Section 7 pour essai T-lymphoïdes. Pour les tests de CFC hématopoïétiques primitives, continuer à la Section 6.
5. Transition endothéliales-à-hématopoïétiques
- Spin le CD34 isolé + CD43 − CD73 − CD184 − cellules à 330 x g pendant 5 min. remettre en suspension les cellules il médias à 200 000 cellules/mL ( Tableau 2). Distribuer les cellules dans 50 µL d’extraits dans une plaque de culture de cellules de 96 puits peu adhérentes. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à multi-gaz 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2.
Remarque : Il médias : médias SP34 additionné de 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, IU 2 EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL de IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL de l’angiotensine II et 100µm Losartan potassium à 2 x 10 5 cellules/mL (tableau 2). - Préparer les plaques de revêtement MAT 24 puits (voir étape 1.2.7.1), suff.
- Les cellules regroupera en amas de cellules de 6 à 10 du jour au lendemain. Pour chaque volume de 50 µL de cellules reaggregated, transférer doucement les cellules au centre d’une plaque de couche de MAT de 24 puits sur le lendemain matin. Placez délicatement la plaque en incubateur multi-gaz 37 ° C pendant 4 à 6 h, jusqu'à ce que les cellules sont attachés.
- Ajouter 1 mL de supports HE neufs dans chaque puits, après que les cellules sont attachés. Incuber les cellules dans un incubateur à multi-gaz 37 ° C 5 % CO 2 5 % O 2 jusqu'à ce que les cellules hématopoïétiques sont visibles (en général 5 à 7 jours ; figure 2D). Visualiser à l’aide d’un microscope optique à grossissement X inférieures à 100.
- Récolte les progéniteurs hématopoïétiques définitifs en retirant doucement les médias HE de cellules. Passer ce média à travers un tamis de cellule 40 µm et collecter. Pour les cellules adhérentes dans le puits, ajouter 0,5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 0,5 mL STOP solution à chaque puits. Passer à travers les cellules à travers le même tamis de cellule 40 µm pour mettre en commun tous les adhérentes et non adhérentes ensemble. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
- Pour évaluer le potentiel de CFC de cette culture en vrac, passez à la Section 6.
- Laver les cellules deux fois en mémoire tampon de FACS. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à 5 x 10 6 cellules/mL. Colorer les cellules avec des anticorps anti-CD45 et anti-CD34 pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité (suggère fluorophores sont dans la Table des matières).
- Laver les cellules deux fois en mémoire tampon de FACS. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
- Isoler le CD34 + CD45 + cellules de FACS ( Figure 2E). Trier les cellules réfrigérée tampon FACS.
- Évaluer le CD34 définitif + CD45 + des progéniteurs hématopoïétiques comme nécessaires (test de CFC dans la Section 6, potentiel lymphoïde dans la Section 7 ou un autre dosage menée à l’initiative).
6. Dosage de CFC
- décongeler des parties aliquotes de MeC pour chaque échantillon utilisé pour le dosage de la CFC.
- Ajouter les cellules pour être analysées (étapes 4.5, 4.7, 5.5 ou 5,9) en MeC. Vortex soigneusement et laissez les cultures de MeC représentent pendant 5-10 min jusqu'à ce que les bulles d’air se dissipent, selon le fabricant ' instructions de s. À l’aide d’un 16 ½ aiguille sur une seringue de 3 mL de calibre, retirer délicatement les 2 mL du VEM.
NOTE : Électrodéposition typique densités varient de 1 000-20 000 cellules/mL, selon la fréquence de progéniteurs attendu. - Soigneusement, diluer 1 mL de mélange cellulaire MeC dans chacune des deux plats de vitroplants de 35 mm. Répartir uniformément le MeC dans les plats de 35 mm en tapant doucement faisant tourner le plat. Chacun des plats ci-dessus placer dans un plat de culture de tissu de 15 cm rempli d’eau. Incuber dans un incubateur à 37 ° C 5 % CO 2.
- Visualiser les cultures de MeC à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 40 X. Quantifier les différents CFC obtenus. Analyser les dosages de CFC Primitive 8-10 jours après l’ensemencement ( Figure 2). Analyser les tests définitifs CFC 14 jours après l’ensemencement. Morphologies de colonie représentant CFC dosage peuvent être vu dans la Figure 2F.
7. Dosage des lymphocytes T à établir définitivement hématopoïétiques potentiels
- Grow la DL4-OP9 cellules jusqu’au confluent dans un 100 mm vitroplants plat 30 , 31 , 32.
- dégel la DL4-OP9 cellules 72-96 heures avant les essais sur des cellules de T de placage. Remettre en suspension les cellules OP9-DL4 dans 10 mL OP9 médias et verser dans une plaque de 10 cm. Grandir dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2 jusqu'à 70-90 % anastomosé.
- De récolter les cellules OP9-DL4 d’un plat de 100 mm, retirez le support et ajouter 5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA pendant 5 min. arrêter l’activité de la trypsine par 5 mL OP9 médias. Faire tourner les cellules à 330 x g pendant 5 min. remettre les cellules en 1 mL OP9 médias et compter les cellules non vides.
Remarque : Une plaque de 10 cm de OP9-DL4 confluentes produira environ 10 x 10 6 cellules OP9-DL4. - 48 h avant le test de lymphocytes T, cellules 6 plaque 2 x 10 à 12 mL OP9 médias dans un plat de 24 puits (0,5 mL par puits). Grandir dans une étuve à 37 ° C 5 % CO 2.
- Ajouter 2 000-10 000 cellules à doser (tel qu’obtenu en étapes 4.5, 4.7, 5.5 ou 5,9) à 1 bien de cellules OP9-DL4 OP9 milieux additionnés : 30 ng/mL SCF (6 premiers jours uniquement), 5 ng/mL IL-7 et 5 ng/mL FLT3-L. Incuber à 37 ° C 5 % CO 2 inc ubator. Aucun changement de médias se produire à cette étape.
- Tous les 4 - 5 jours, passage les progéniteurs des lymphocytes T sur des cellules stromales OP9-DL4 fraîches dans un plat de 6 puits. Triturer les cellules avec une pipette de 1 mL et passer à travers un filtre de 40 µm pour éliminer les touffes. Tournant à 330 x g pendant 5 min. aspirer hors des médias. Remettre en suspension les cellules dans 2 mL de frais OP9 médias additionné de 5 ng/mL IL-7 et 5 ng/mL Flt3-L et lieu sur des cellules fraîches OP9-DL4.
Remarque : 48 h avant le passage, sur plaque de 2 x 10 6 cellules fraîches de OP9-DL4 dans 12 mL OP9 médias et distribuer 2 mL par puits dans des plats de 6 puits. - Après au moins 21 jours de culture mixte, triturer les cellules vigoureusement et passent à travers un filtre de 40 µm pour éliminer les débris cellulaires. Tourner à 330 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
- Laver les cellules deux fois dans le tampon de FACS froid. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à 5 x 10 6 cellules/mL. Tache de cellules avec des anticorps anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 et CD8-anti pendant 30 minutes sur la glace dans l’obscurité (fluorophore suggérée combinaisons sont dans la Table des matières). Appliquer une tache live/dead cell (DAPI, etc.) afin d’éliminer les débris de l’analyse.
- Laver les cellules deux fois en mémoire tampon de FACS. Tourner à 330 x g pendant 5 min.
- Analyser les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux afin d’évaluer la présence de géniteurs de lymphocytes T ( Figure 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un schéma illustrant l’induction des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitives de hPSCs est illustré à la Figure 1. Mésoderme structuration par canonique WNT signaling se produit pendant les jours 2 et 3 de la différenciation, suivie de la spécification des cellules souches hématopoïétiques.
Représentatif de cytométrie et formant les dosages de méthylcellulose de cultures hPSC dérivé de la différenciation hématopoïétique des colonies sont indiquées à la Figure 2. Cultures imprégnées d’insecticide IWP2 différenciation produiront un CD34 distincts+CD43− et CD34faible /−CD43+ habitants, tandis que les cultures imprégnées de CHIR différenciation aura < 1 % CD43+ cellules sur 8 jours de 26de différenciation (Figure 2 aB). Les progéniteurs hématopoïétiques primitives dérivées dans des conditions IWP2 isolées sur 9 jours donnera lieu à prédominance primitive érythroïdes (EryP-CFC) et des progéniteurs myéloïdes dans les essais de méthylcellulose, tandis que les cultures traitées CHIR sera largement dépourvue de CFC potentiel à ce stade (Figure 2F). Au lieu de cela, le CD34+CD43– dérivée du traitement CHIR99021 de la population est une population hétérogène, contenant des cellules souches endothéliales ainsi que CD34+CD43–CD73–CD184– il ( Figure 2 b), qui, une fois isolée par FACS, formeront au départ une monocouche de cellules endothéliales (Figure 2D, panneau de gauche), qui subit alors une transition endothéliales-à-hématopoïétiques, aboutissant à la ronde, non réfringents adhérents cellules hématopoïétiques (Figure 2D, panneau de droite). Ces cellules hématopoïétiques peuvent être évaluées par cytométrie de flux pour l’expression de CD34 et CD45 (Figure 2E). Les progéniteurs hématopoïétiques isolées de l’ISE des essais peuvent être utilisés pour des tests de méthylcellulose et donnent lieu à grand éclat semblable érythroïdes unités formant des colonies (BFU-E), unités formant des colonies de petites érythroïdes (CFU-E) et des progéniteurs myéloïdes (CFU-M ; Figure 2F).
La figure 3 illustre les analyses par cytométrie en flux flux représentant les essais de T-lymphocyte potentiels de CD34 dérivé CHIR99021+CD43 CD73−−CD184− progéniteurs hématopoïétiques (Figure 3 a) et dérivés de IWP2 CD34 (Figure 3 b)+CD43− progéniteurs hématopoïétiques, après 21 jours de co-culture OP9-DL4. La présence d’un CD45+CD56−CD4+CD8+ population de cellules souches dérivées de CHIR est révélateur de potentiel hématopoïétique définitif le CD34 d’entrée+ population. CD34+ et CD43+ cellules souches isolées de différenciations IWP2 dérivés ne donnent pas lieu à lymphocytes T dans ce test, en vertu de ces différenciation des conditions18,26.
Figure 1 : schéma de principe du protocole pour la spécification des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitifs. Représentation des principales étapes expérimentales et un calendrier de la différenciation de l’EBs de progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitifs. EBs sont générés au jour 0 de hPSCs sur les contenants de plastique enduit MAT. EBs sont cultivées dans des milieux SFD contenant BMP4 dans un incubateur multi-gaz. Le jour 1 de différenciation, cultures sont nourris avec les milieux supplémentés avec BMP4 et bFGF. Le jour 2, un changement de support se produit avec la manipulation de WNT grâce à l’ajout de CHIR99021 (CHIR) pour des progéniteurs hématopoïétiques définitifs et IWP2 pour les progéniteurs hématopoïétiques Primitives. Le jour 3, les médias est remplacée par SP34, additionné de VEGF et bFGF. Au jour 6, cultures sont nourris avec les milieux enrichis de cytokines hématopoïétique. Le jour 8 du cahier des charges hématopoïétiques primitives, les médias sont changé et cellules sont placés dans un incubateur à2 CO 5 % pendant 24 h, suivie de l’analyse de cellules (HPC) de cellules souches hématopoïétiques. Jour 8 de spécification définitive hématopoïétique CD34+CD43–CD73–CD184– cellules sont isolées par FACS et dosés pour hemogenic définitif potentiel endothéliale ou lymphoïdes T potentiel (non représenté). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse des cultures de différenciation et de la production de progéniteurs hématopoïétiques Primitives. (A) analyses de cytométrie de flux flux représentatif des progéniteurs hématopoïétiques primitives de traités IWP2 EBs sur 8 jours. (B) par cytométrie en flux analyses des flux représentatif de traités CHIR99021 EBs sur 8 jours. Hemogenic l’endothélium (il) peut être identifié et isolé comme un CD34+CD43–CD73–CD184– population. (C) potentiel de formatrices de progéniteurs hématopoïétiques jour 9 de IWP2 - et CHIR99021 - (CHIR) traités de cultures de différenciation. n = 3, barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne, les astérisques indiquent une signification statistique, en utilisant le test t de student *** p < 0,0001. (D) photographies représentatives d’isolé il cellules après 4 jours (à gauche) ou 7 + jours (à droite) de la croissance sur les contenants de plastique enduit MAT. Grossissement original, 100 X. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (E) représentant cytométrie en flux de l’expression définitives progéniteurs hématopoïétiques CD34 et CD45 après 9 jours de culture. (F) photographie représentative montrant la morphologie des EryP-CFC (à gauche), CFU-M (au milieu), BFU-E et CFU-E (à droite). Grossissement original, 40 X. Barreaux de l’échelle = 100 µm. les flèches indiquent le nom des colonies. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse du potentiel hématopoïétique définitif. Analyses de cytométrie de flux des flux représentatif du lymphocyte T potentiel des dérivés de CHIR CD34+CD43 CD73−−CD184− progéniteurs hématopoïétiques (A) ou dérivé de IWP2 (B) CD34+CD43 − progéniteurs hématopoïétiques, 28 jours après la co-culture avec OP9-DL4 cellules. Le potentiel de T-lymphocyte auprès d’un échantillon est considéré comme positif s’il n’y a plus de 100 CD45+ événements détectés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : médias axés sur les SFD pour jours 0 - 2.
| SP34 Media | Jour 3 | Jour 6 | Jour 8 | IL |
| VEGF | 15 ng/mL | 15 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| bFGF | 5 ng/mL | 5 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| EFC | – | 200 ng/mL | 100 ng/mL | 100 ng/mL |
| OEB | – | 4 UI | 2 UI | 2 UI |
| IL-6 | – | 20 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-11 | – | 10 ng/mL | 5 ng/mL | 5 ng/mL |
| IGF-1 | – | 50 ng/mL | 25 ng/mL | 25 ng/mL |
| TPO | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| FLT - 3L | – | – | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-3 | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| BMP4 | – | – | – | 10 ng/mL |
| SHH | – | – | – | 20 ng/mL |
| Angiotensine II | – | – | – | 10 µg/mL |
| Losartan potassium | – | – | – | 100 ΜM |
Tableau 2 : médias SP34 pour 3 jours - 8 et il a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit une méthode rapide, sans sérum, exempt de stroma de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs. Mésodermiques spécification des progéniteurs hématopoïétiques primitives ou définitifs peut être réalisée de façon fiable utilisant notre protocole, qui exploite uniquement des petites molécules inhibitrices de la signalisation WNT canonique. Activation de WNT spécifiques au stade de l’inhibiteur de la GSK3β CHIR9902133 donne lieu à mésoderme hématopoïétique définitif, alors que WNT l’inhibition par l’inhibiteur de la PORCN IWP234 spécifie mésoderme hématopoïétiques primitives26. À noter, cette méthode ne donne pas robuste lieu à une population de HSC-comme engraftable (non illustrée). Toutefois, les progéniteurs hématopoïétiques définitifs générés grâce à cette approche sont maîtrisables induite par le transgène greffe potentielle35, mettant en évidence leurs applications potentielles à l’avenir translationnelles.
Un facteur déterminant à la différenciation hPSC réussie est la taille initiale de l’EBs qui se forment par hPSCs. Idéalement, l’EBs devrait être autour de 6-10 cellules de taille. Les cultures de différenciation peuvent spécifier aberrantly un mélange des deux programmes si l’EBs sont trop gros, peut-être due à l’activation de mauvais signal au sein de l’organe exécutif. Cultures de différenciation doivent être inspectés visuellement pour taille EB optimale durant le premières 24 h de différenciation. Alternativement, si les hPSCs sont complètement dissociés de cellules individuelles, les hPSCs subissent plutôt anoikis cellule mort36, ce qui entraîne une différenciation hématopoïétique pauvre.
Une différenciation réussie donnera lieu à exclusivement des progéniteurs hématopoïétiques primitives lorsque IWP2 est utilisée au cours de la spécification mésodermiques les jours 2 et 3 du présent protocole de différenciation. Sur 8 jours de la différenciation, la culture dérivée de IWP2 devrait être composée de CD34 distincts+CD43−, CD34milieu/basCD43+et CD34−CD43+ populations (Figure 2 a). Le CD34milieu/basCD43+ population engendre érythroïdes primitives et des progéniteurs myéloïdes ; alors que le CD34−CD43+ population engendre principalement progéniteurs érythroïdes limitée myéloïde potentiels18. Le potentiel hématopoïétique primitif peut être confirmé par le dosage de méthylcellulose pour la présence de EryP-CFC (Section 6), qui sera principalement exprimer la globine embryonnaire HBE comparativement aux foetus HBG26, 28,37. De même, la présence de CD43+ des progéniteurs hématopoïétiques à ce stade peuvent être fiable utilisés pour indiquer la présence de progéniteurs hématopoïétiques primitives18,23,26. Il est à noter que CD43 expression n’est pas exclusive aux ancêtres du programme hématopoïétiques primitives18,23,26et ne peut servir de la métrique unique pour évaluer primitive hématopoïétique potentiels, comme les lymphoblastiques et NOTCH-dépendance de l’être humain EMP reste indéterminé (évaluée à3).
Lorsque CHIR99021 est utilisée au cours de la structuration mésodermiques pendant les jours 2 et 3 de différenciation, une population d’exclusivement des progéniteurs hématopoïétiques définitives est précisée. Le jour 8 du protocole de différenciation, les cultures dérivées de CHIR99021 devraient être composés d’un distinctif CD34+CD43− population, avec peu ou pas d’expression CD4326. Le CD34+CD43− population est une population hétérogène de cellules endothéliales avec potentiel hématopoïétique, veineuse et artérielle qui peut être délimitée basée sur l’expression CD73 et CD184, avec HE cellules dépourvues l’expression de ces deux 27,,28. Définitif, il est isolé, après avoir subi un encoche dépendant endothéliales-à-hématopoïétique de transition (Section 5)28 il engendrera CD34+CD45+ des progéniteurs hématopoïétiques qui donneront naissance à BFU-E et les cellules myéloïdes dans méthylcellulose, mais pas EryP-CFC26,28 (Figure 2). En outre, les colonies BFU-E peuvent être isolés et évalués pour l’analyse de la globine, dont principalement de la volonté express de la globine HBG en comparaison de l’embryonnaire HBE (non illustré)26,28, 37. en revanche, le potentiel lymphoïde peut être évalué directement partir isolé HE, que la transition endothéliales-à-hématopoïétiques NOTCH dépendant se produit sur les OP9-DL4 stroma18,26,28. Le définitif QU'IL spécifié avec cette méthode contient des progéniteurs érythro-myélo-lymphoïdes à un clonale niveau28, qui le distingue sur le plan fonctionnel de notre compréhension actuelle de l’EMP ou PPSP progéniteurs3. Ainsi, la présence de T-lymphoïdes et HBG-exprimant érythroïdes potentielle, associée à une absence de potentiel EryP-CFC, peut servir à indiquer avec fiabilité la spécification définitive hématopoïétique de hPSCs. À noter, évaluant uniquement pour les cellules souches qui peuvent donner lieu à HBG-exprimant les érythroblastes ne peut pas déterminer avec précision le potentiel définitif, comme, semblable à celle décrite ci-dessus, l’EMP humaine et ses exigences de signal, n’a pas été caractérisés à ce jour (revu en référence3).
Cette stratégie de différentiation simple est très puissante car il permet la génération d’exclusivement primitive ou exclusivement définitifs progéniteurs hématopoïétiques, qui permet des études comparatives des deux programmes de CISP patient dérivé de modélisation de la maladie ou hPSCs modifiées. De même, les processus de développement humains peuvent être interrogées, comme découvrir quels signal supplémentaire ou les mécanismes sont nécessaires pour conférer la capacité d’autorenouvellement, d'où HSC-comme potentiel, les progéniteurs hématopoïétiques définitifs.
En résumé, manipulation de WNT lors mésodermiques structuration dans hPSCs spécifie CD43 primitif+ ou définitif CD34+CD45+ des progéniteurs hématopoïétiques, qui peuvent être isolés et utilisés pour étudier l’hématopoïèse dérivé de hPSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Department of Internal Medicine, Division d’hématologie, Washington University School of Medicine. CD a été pris en charge par T32HL007088 du National Heart, Lung, and Blood Institute. CMS a été pris en charge par une société américaine d’hématologie Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
