Introduction
心筋細胞の核および細胞周期の状態の正確な同定は、心筋の代謝回転および再生の決意するための極めて重要です。これは、細胞周期活性を同定するための、そのようなpHH3、のKi-67、またはチミジン類似体のような核マーカーの使用のために特に当てはまります。哺乳類成体心筋細胞の増殖能が1非常に小さいので、心筋細胞核の増殖マーカーについて陽性の核の偽の身分証明書は、増殖アッセイの結果で決定的な違いを作ることができます。また、心筋細胞は倍数体および多核細胞ではなく、細胞分裂につながるような核内倍加およびacytokinetic有糸分裂などの細胞周期の変化、になりやすいです。この目的のために、一般的な細胞周期マーカーに対する抗体染色の解釈は、全ての場合において決定的ではありません。
ここで、我々は、直forwaのための方法を提示します RDマウス心筋細胞の認識とそれらの核の明確な同定により生後および成体の段階でネイティブ単離された細胞と厚い組織切片でのnuclearity。そのために、MYH6プロモーターの制御下にヒトヒストンH2BおよびmCherryをからなる融合タンパク質（MYH6-H2B-MCH）の心筋細胞特異的発現を有するトランスジェニックマウス系統は、2を使用しました。 、のeGFP-anillin融合タンパク質の発現は、CMVエンハンサー（CAG-EGFP-anillin）を有するユビキタスニワトリアクチンプロモーターの制御下にあるトランスジェニック増殖インジケータマウス株、このマウス系統を交配することが可能細胞周期状態の決意。足場タンパク質のanillinは、具体的には、アクティブセル3細胞周期で発現され、細胞周期の間に、その差動細胞内局在は、M相の高解像度でライブトラッキング細胞周期の進行を可能にEF "> 4になるので、二重トランスジェニックマウスは、増殖性心筋細胞および細胞周期変動を受けるものとを区別するために使用することができる。これは、in vitroでの増殖を誘導する物質のスクリーニングに特に有用であることを証明。
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Protocol
動物を含むこのプロトコルのすべての手順は、ボン大学の倫理基準に従ったし、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する指令2010年欧州議会の/ 63 / EUからのガイドラインに準拠します。
生後心筋細胞における細胞周期活性のin vitro可視化1.
- 生後心筋細胞解離
- 予備実験の準備
- 培地（IMDM、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％非必須アミノ酸、0.1％βメルカプトエタノール）を調製。培地1：2％にFCSを追加します。媒体2：20％のFCSを追加します。
- コート96ウェル培養皿（半成長面積15 平方ミリメートル）のPBS溶液中の0.1％ゼラチンです。
- ハート解剖
- PBS 15mLでペトリ皿を準備し、氷の上に保管します。乾燥したガラスビーズ滅菌器に入れることにより、2つのピンセットと小さなハサミを滅菌します。 断頭により新生児トランスジェニックマウス（CAG-EGFP-anillin / MYH6-H2B-MCH）を生け贄に捧げます。 Ehler らに記載されているように、心を解剖、胸部を開きます。 、2013（Jヴィス経験.;（79）：50154 DOI：10.3791 / 50154）、および氷冷PBSに転送します。次のマウスに移動します。
- 非ホモ接合繁殖ペアを使用している場合は、蛍光顕微鏡でトランスジェニック心を識別します。蛍光顕微鏡下でPBSに心を置きます。 eGFP-anillin発現を確認してください（例：488 nmの;エム：509 nm）をH2B-MCH式（例：587 nmで、エム：610 nm）で、適切なフィルターセットとを。
- 心筋細胞の単離
- 新生児心臓解離キットを使用して、選択された心を解離します。 5分間37℃で酵素混合物1をインキュベートします。最終酵素ミックスの1ミリリットルを得るためには、酵素ミックス2μLの55に酵素ミックス1の945μLを追加します。
- P3マウスまたはP4から最大2ハート - - 4 P1から心まで移し、1.5 mLのrにP6マウスeaction酵素ミックスの1 mLを含むチューブとは、はさみで小片に心をカット。 15 mLの反応チューブにソリューションを転送します。
- 15分間37℃でインキュベートします。組織と酵素との間の接触を最大化するために、インキュベーター内でほぼ水平に15 mLチューブを置きます。 5-mLのピペットで上下に10回 - 5をピペットで混ぜます。この手順を3回繰り返します。
- 酵素反応を停止するために媒体2の7.5ミリリットル（20％FCS）を加えます。 70μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。媒体2の3 mLのセルストレーナーを洗浄します。
- 15分間、300×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てます。媒体1の500μLにペレットを再懸濁。赤血球の溶解は、さらなる実験のために必要とされません。細胞計数室への細胞懸濁液のピペットで10μLの細胞の数を決定します。
- 96ウェルプレートの場合：中1の120μLでシードウェルあたり10,000細胞（2％FCS）。場所インキュベーターへの細胞（37℃、5％CO 2）トランスフェクションに直ちに進みます。
- 予備実験の準備
- siRNAまたはmiRNAを持つ新生児心筋細胞のトランスフェクション
- RNアーゼを除去するためにRNaseを除染液でベンチを拭いてください。 10μL、100μL、および200-μLピペットとアイスボックス：RNアーゼ除染液で、次の材料をきれいにしてください。氷上で解凍するsiRNAの株式の一定分量（100μM）。
- 低血清培地（低血清培地+ 2μLのsiRNAの100μMストックの98μL）中のSi / miRNAの2μM作業株式を準備します。作業ストックは、同じ日に使用する必要があります。凍結が推奨されていません。
- （;：〜57 nMの140μLで最終のsi / miRNAの濃度1 96ウェル用量）0.5 mLの反応チューブに減少した血清培地の6μLに2μM株式の4μLを追加します。特定のsi / miRNAを用いてトランスフェクトする井戸の数のための適切なボリュームを選択してください。
- トランスフェクション試薬のマスターミックスを調製します。 （96ウェルの合計）各ウェルについて、10μL（低血清培地のトランスフェクション試薬+ 9.4μLの0.6μL）を使用します。
- SIを追加/ miRNAは、トランスフェクション試薬ミックスに混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。ピペットで各ウェルに20μL。 37℃で48時間、5％CO 2のために細胞をインキュベートした後、24時間以上経過した後の媒体1の120μLで各ウェルに培地を交換し、固定および免疫蛍光染色に進みます。
- 固定および免疫蛍光染色
- 培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄します。 20分間、4％ホルムアルデヒド溶液で細胞を覆います。ホルムアルデヒド溶液を外し、PBSで細胞を1回洗浄してから、保存のためにPBSでそれらを覆ったり、免疫染色に進みます。
- 少なくとも2時間、0.2％のTriton-Xおよび5％ロバ血清中（製造者の指示に従って濃度）を一次抗体と共にインキュベートします。4℃で一晩、汚れ;：αアクチニン（モノクローナル抗αアクチニン400希釈1）についての染色の場合。
- 一次抗体を除去し、PBSで3回洗浄します。ヘキスト溶液1中に二次抗体を希釈：400、光から保護し、室温で1時間インキュベートします。 、抗体を除去し、PBSで3回洗浄し、そして4℃で貯蔵のためにPBSで細胞を覆います。
- 共焦点ビデオ顕微鏡
- 画像取得のための共焦点顕微鏡を使用してください。イメージングソフトウェアを開きます。 「A1plus設定」を開き、CH1、CH2、およびCH3のためのチェックボックスをオンにします。プルダウンメニューをクリックしてCY4にCy3のにeGFPを、CH3にDAPI、Ch2のにCh1のを設定し、Ch4を。
- チャネルごとに、HVをクリックし、スライダバーを使用して、80に設定してください。スライダバーを使用してオフセットを0に設定し、ホームポジションにピンホールを設定するには、「ホーム」ボタンをクリックします。プルダウンメニューをクリックすることで、1,024×1,024スキャンサイズを設定します。
- 開くには、最適化をクリックしてください「XYZサイズの設定」ウィンドウ。 「推奨手順（z）は「下」パーフェクトボクセル」チェックボックスをオンにします。画像は露出不足や露出過多でもないまで、レーザー強度を増加させます。
注：たとえば、 CH1（DAPI）：16％、Ch2の（EGFP）：12％、CH 3（Cy3の）：100％、Ch4を（Cy5の）：1％。 0のすべてのチャンネルのオフセットを設定します。
- 20X目標（200X倍率）を使用して写真を撮ります。タイル画像からなる大きな画像をスキャン（ 例えば、3×3）。
- イメージングソフトウェアでは、「獲得」に移動し、プルダウンメニューから「大きな画像をスキャン」を選択します。下の「エリア」を選択した3×3をクリックするプルダウンメニューと設定された「XとYのフィールドの数」から「現在の位置が左上隅にある「「スキャン」。
- 画像取得のための共焦点顕微鏡を使用してください。イメージングソフトウェアを開きます。 「A1plus設定」を開き、CH1、CH2、およびCH3のためのチェックボックスをオンにします。プルダウンメニューをクリックしてCY4にCy3のにeGFPを、CH3にDAPI、Ch2のにCh1のを設定し、Ch4を。
- 画像解析
- H2B-Chの信号およびαアクチニン信号をカウントすることにより、心筋細胞の数をカウントすることにより、心筋細胞核の数を定義します。
- <LI>「測定」をクリックし、プルダウンメニューから「手動測定」を選択します。次のプルダウンメニューから「カウント」を選択します。それによりマーキングし、それらを数え、H2B-MCH信号と核をクリックします。心筋細胞の数を取得するαアクチニン陽性細胞についても同様にします。
- H2B-Chの信号およびαアクチニン信号をカウントすることにより、心筋細胞の数をカウントすることにより、心筋細胞核の数を定義します。
- 核のeGFP-anillin信号（EGFP-anillin + / H2BmCh +核）とS / G2期の心筋細胞をカウントします。 「測定」をクリックし、プルダウンメニューから「手動測定」を選択します。次のプルダウンメニューから「カウント」を選択します。マークそれらをクリックしたeGFP-anillin信号とH2B-MCH信号との核。
- このような細胞質シグナル、収縮リング、およびmidbodiesなどの有糸分裂固有のeGFP-anillin信号（ 例えば、 図1FおよびG）、との心筋細胞をカウントします。 「測定」をクリックし、プルダウンメニューから「手動測定」を選択します。次のPULから「カウント」を選択します。ldownメニュー。マークは、それらをクリックすることにより、有糸分裂固有のeGFP-anillin信号（ 例えば、 図1FおよびG）、細胞質シグナル、収縮リング、およびmidbodiesで心筋細胞。
ランゲンドルフ解離と厚い組織切片大人の心筋細胞における核の2.決意
- ランゲンドルフ解離によって成人心筋細胞の単離
- 心臓解剖前の準備
- ヘパリンとインスリン注射器（30ゲージ針）（20単位/ g体重）を満たします。首筋によってマウスをつかみ。注射のために腹部を露出するように後方にマウスを持ち上げて回します。
- 腹腔内注射を行います。バックケージにヘパリン処理したマウスを入れ、心臓解剖を開始する前に少なくとも15分を待ちます。すすぎ、5とランゲンドルフ装置を換気 - （潅流緩衝液の10mLの灌流バッファー：135mMのNaClを、4のKCl、1mMのMgCl2、2.5 mMのHEPES、5mMのグルコース、およびのddH 2 O中の25mM BDM、NaOHでpH7.4に調整）。
- ハート解剖
- 冷蔵（4℃）PBSで10-cmのシャーレを用意し、氷の上に置きます。 PBSでカニューレ（20ゲージ）に接続された1 mLのシリンジを記入し、換気してください。ペトリ皿の境界線上に粘土でカニューレを修正しました。少しPBS面の下にカニューレチップを置きます。
- 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 70％エタノール溶液で腹部を拭いてください。手術用ハサミで胸骨に半ば腹部からの切開を行います。振動板を取り外し、手術用ハサミで、左右胸部を切りました。
- 持ち上げ、20ゲージの針で胸骨を固定し、胸腔を開き、優しく解剖学的鉗子で心をつかみます。心を持ち上げて、流出路の血管を切断することにより、肺や血管系から取り外します。
注：と心を置き、大動脈を識別するためにその腹側を上に。これは、両方の心房との間の距離が減少するので、その分枝を有する大動脈が心房間見出すことができます。大動脈の主要な枝がまだ十分に長い場合、個々の心のアーキテクチャに応じて、枝を除去することができます。 - 冷PBSを含む10-cmのペトリ皿に心を移し（ステップ2.1.2.1を参照）。組織の損傷を避けるために、振動マルチツールによって平滑化されたG20x1 1/2注入カニューレ、上行大動脈を引っ張ることによって、心臓にカニューレを挿入。カニューレ上のスレッドに大動脈を修正しました。ゆっくりとシリンジプランジャーを押すことによって、過剰な血液を除去するためにPBSで心をすすぎます。心のわずかな拡大が表示されるはずです。
- ランゲンドルフ心臓解離
- ランゲンドルフ灌流装置でのルアーロックアダプタに迅速にカニューレを挿入し、心臓を接続します。 1滴/秒の流速で5分間、37℃で酸素潅流緩衝液30mLで心臓を灌流。目電子流量は減圧弁（0〜200ミリバールの圧力）を使用してランゲンドルフ装置内のO 2流量を調節することによって適合させることができます。
- 6 UコラゲナーゼB、10,000台トリプシン、および50μMのCaCl 2との潅流緩衝液：使用直前に消化緩衝液を準備します。灌流緩衝液を除去し、（37°C）暖かく、酸素消化緩衝液の30ミリリットルを追加することにより、酵素消化を開始します。
注：コラゲナーゼBの量は、異なるロットの活性に応じて滴定される必要があります。 - 1滴/秒の速度への流れを調整し、10のために心をダイジェスト - 13分。汚染を避けるために、再び流出を使用しないでください。消化緩衝液5mLで10-cmのペトリ皿に心を移します。鉗子の一組と心を保持し、小片に心をリッピングする他のペアを使用して鉗子を使用して手動で組織を解剖。
注：このステップでは、心房を分離することができ、小にカット（虹彩はさみで）個、および単離された心房細胞を得るために、37℃のインキュベーター中で消化緩衝液750μLで30分間消化しました。 1 mLのピペットを用いて、純粋な心房心筋細胞、ピペットを上下に数回を取得します。停止液750μLを添加することにより酵素反応を停止します。 - 停止溶液5mL（5％FBSおよび50μMCaCl 2を灌流緩衝液）を添加することによって消化を停止します。血清学的ピペットを使用して、100μmの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルタリングし、50 mL遠心管に細胞を収集します。室温で1分間、80×gで濾過した細胞懸濁液を遠心。
- 上清を捨て、ゆっくりと10 mLの血清学的ピペットを使用して停止液10mLに細胞ペレットを再懸濁します。室温で1分間、80×gで細胞懸濁液を遠心。
- 遠心分離に続いて、上清を捨て、20％FCを含む培養培地（IMDM 1mLの細胞を再懸濁します培養のための非必須アミノ酸、50μg/ mlのペニシリンおよびストレプトマイシンの各々、およびβメルカプトエタノール0.1mMのS、0.1ミリモル）。代わりに、「、免疫蛍光染色を」、2.2に進み、細胞を固定します。
- 24ウェルプレートを、少なくとも3時間、37℃、5％CO 2で培地500μLで24ウェルプレート中の8μg/ mLのラミニンでコーティングしたカバーガラス上にウェル当たり単離された細胞のプレート万の固定用。
- 心臓解剖前の準備
- 懸濁液中のランゲンドルフ分離された心筋細胞上の免疫蛍光染色
- 室温で15分間、PBS中の4％PFAを1mL、pH7.4中ランゲンドルフ分離された心筋細胞を修正しました。 、室温で2分間、800×gで細胞懸濁液を遠心固定液を除去し、PBSで2回細胞を洗浄します。
- 1mLのPBS中で固定した心筋細胞を再懸濁し、いずれかの免疫蛍光染色を進めるか、ウェルあたりに500μlのPBSに格納4℃で24ウェルプレート。マイクロ遠心チューブに - （200μL〜100）の細胞懸濁液の一部を転送します。室温で2分間、800×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てます。
- 透過処理、ブロック、および1希釈した一次抗体200μLを添加することにより、αアクチニンに対する一次抗体で細胞を染色：室温で1時間、0.2％トリトンX-100および5％ロバ血清を含むPBS中で400。
- 室温で2分間、800×gで遠心分離し、上清を捨てます。室温で2分間、800×gで細胞をPBSでペレットと遠心分離機を洗ってください。上清を捨て、アレクサ・フルーア結合二次抗体（抗マウスIgG1）の200μLでインキュベート1に希釈：ヘキスト染料で400（ワーキング溶液：を1μg/ mL）を光から保護し、室温で1時間、ため。
- 室温で2分間、800×gで遠心分離し、上清を捨てます。この手順を繰り返します。光から試料を保護します。 R200のセルesuspend - PBSの500μLを100転送 - 顕微鏡室のウェルに細胞懸濁液300μLを。チャンバーの蓋を閉め、イメージングまで4℃で細胞を保存します。光から保護します。
- ランゲンドルフ分離された心筋細胞のnuclearityの分析
- 250X倍率に対応する、25Xの目的でαアクチニン染色心筋細胞から画像を取ります。唯一の定期的αアクチニンで染色し、典型的な棒状の形態を示すため、そのままであると仮定されているこれらの心筋細胞においてH2B-MCH +核の数を数えます。
- 三つの異なる心から少なくとも100心筋細胞をカウントします。単核、二核、および三核心筋細胞の割合を計算します。
注： - 三核細胞および核の大きい番号を持つものは（まれであるが、<、<、ランゲンドルフ分離された心筋細胞における1％を90％一般的に、二核細胞が約80を構成する必要があります厚さにスライス3％）。心房の心筋細胞は、心室心筋細胞よりも有意に小さいです。一般的に、単核細胞が総人口の90％を占めています。
- 単離、固定、および厚さにスライスするための準備として、大人の心の凍結保存
- ハイデルベルグの延長管と第2の3方活栓で3方コックに50 mLの注射器を接続することにより、固定用の灌流装置を組み立てます。フロースルーが重力によって有効にされるように、スタンドに注射器を固定してください。 PBS 15mLでシステムを入力します。
- 手順2.1.2.1-2.1.2.4、次のとおり「心の準備を。」無気泡-PBSで満たされた灌流装置のルアーロックアダプタに心をG20x1 1/2注入カニューレを接続し、PBSでそれを灌流。その後、心臓を灌流するPBS中の4％ホルムアルデヒドの15ミリリットル、 - 10でシステムを入力します。浸漬は一晩、4％ホルムアルデヒド溶液中で心を修正します。
- 4％ホルムアルデヒドを交換してくださいPBSを含む溶液と室温で8時間、150 rpmで水平シェーカー上でPBS中で心を洗います。 4℃で一晩の心を脱水するために20％ショ糖溶液でPBSを交換します。
- 小さな金型内で凍結包埋媒体中で心をフリーズします。
- 2-メチルブタンで満たしたビーカーを設定し、ドライアイスの箱に入れてください。以前に凍結包埋媒体で半分満たされた凍結金型に心を入れて、凍結包埋剤で完全にそれをカバーしています。慎重2-メチルブタンで凍結包埋媒体の接触を防止、風邪ビーカーに金型を配置します。使用するまで-80℃で凍結した組織を保管してください。
- 厚い心臓切片の調製
- -18〜-20°Cのオブジェクトの温度、-21 -23℃のチャンバ温度、4°のナイフホルダーに決済角、フェザーR35ミクロトームブレード：以下cryotomeでセットアップを使用してください。
- 凍結保存し、Oを取ります冷凍コンテナからrganと急速凍結棚を使用して、クライオ包埋媒体で試料ディスクにそれを修正。切片が頂点で始まるように心を置きます。
- でも、切断面が達成され、臓器が見えるようになるされるまで、50μmの切片を切り落とします。遅い速度でとナイフ上に配置されたアンチロールプレートとマニュアルモードでcryotomeを使用して、50ミクロンの組織切片をカットします。生理食塩水処理した顕微鏡スライド上にマウントスライス。スライスは、室温で30分間乾燥し、直接Cや汚れ-80℃でスライドを保存してみましょう。
- 厚い心臓切片の染色（核および細胞膜）
- 37℃で1時間キュベットに洗浄緩衝液（0.5 M塩化ナトリウム、0.1 MトリスpHが7.5、及び50mM EDTA）中にRNアーゼA（20μg/ ml）で心臓切片を扱います。室温で30分間、洗浄緩衝液中の0.2％のTriton-Xで切片をインキュベートします。上キュベットに洗浄緩衝液で5分間ずつ二回のスライスを洗っ室温で水平シェーカー。
- ステイン一晩1μMTO-PRO3ヨウ化（661分の642）およびフルオレセイン結合コムギ胚芽凝集素（WGA、1：100）で4℃で洗浄バッファーインチ水平シェーカー上キュベット内洗浄緩衝液で5分間ずつスライスを3回洗浄し、抗退色試薬とカバーガラスとポリビニルアルコール封入剤でそれらをカバーしています。
- 画像収集
- 理想的には、40X / 1.15 NAの水浸漬対物レンズを備えた倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡を使用しています。縦方向に並んで心筋細胞で構成されたスライス内の領域のための目で検索。その目的のために、フルオレセイン-WGAチャネル（例：488 nm）が最も適しています。
注：心筋細胞の上限と下限は、後の分析のためのzスタック内で表示する必要があるとして、この手順は、必須です。撮像深さは30ナノメートル〜に限定されるものではなく、スライスの厚さが50μmであるように、IMすることは不可能ですこれらの細胞の年齢の断面（セル長：〜120ミクロン）。 - イメージングソフトウェア内の設定を調整します。イメージングソフトウェアを開きます。オープンA1plus設定とCH2、CH3、およびCh4をチェックボックスをオンにします。プルダウンメニューをクリックしてAlx546にEGFP、CH3にCh2のを設定し、Alx647にCh4を。
- チャネルごとに、HVをクリックし、スライダバーを使用して、80に設定してください。オフセットスライダバーを使用して、0に設定してください。ホームポジションにピンホールを設定するには、「ホーム」ボタンをクリックします。プルダウンメニューをクリックすることで、1,024×1,024スキャンサイズを設定し、「XYZサイズの設定」ウィンドウを開くために最適化する]をクリックします。 「推奨手順（z）は「下」パーフェクトボクセル」チェックボックスをオンにします。
- 「ライブスキャン」をクリックして、個々のチャンネル上のスライダーバーをクリックすることで、レーザー強度を調整します。 「ND取得」ウィンドウの「Zシリーズ」のボックスをチェックし、「一番上のボタンによって定義された「ボックスをクリックします。トップを定義し、顕微鏡にフォーカスを調整した後、適切なボタンをクリックして、zスタックのボタン。 0.5μmとのzステップ幅を設定します。
注：zスタックの深さは、組織内の光の浸透及び信号対雑音比によって制限されます。 - 「A1plus設定」に移動し、プルダウンメニューをクリックして、2-4の線積分の平均を/設定します。微調整レーザー強度;ピンホールは、焦点面で画像化するためにできるだけ小さくすべきです。
- 理想的には、40X / 1.15 NAの水浸漬対物レンズを備えた倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡を使用しています。縦方向に並んで心筋細胞で構成されたスライス内の領域のための目で検索。その目的のために、フルオレセイン-WGAチャネル（例：488 nm）が最も適しています。
- 核形成の分析
- 画像解析ソフトウェアを開き、関心のzスタックをロードします。
- 手動でスタック内に完全にある細胞を同定するために、スタックの異なる層をスクロールすることにより、Zスタック内の核形成を決定します。これはWGA染色はすべての次元で表示されている場合です。核の数をカウントします（それらのほとんどは二核になります）とソフトウェアにおけるアノテーションで分析された細胞をマーク。 <李は> CM核（H2B-MCH +）と単一チャネル（ 図2D）のための3次元再構成における（TO-PRO3 +）合計核の数を決定します。イメージングソフトウェアでは、「バイナリ」をクリックし、プルダウンメニューから「しきい値3Dの定義」を選択します。総核の数のためのCMの核またはAlx647数のチャネルプルダウンメニューのいずれかAlx546からお選びいただけます。適切な矢印をクリックすると、「スムーズ4X」、クリーン1Xにプログラムを設定し、上の穴を埋めます。 「サイズ」ボックスをチェックし、スライダーバーを使用して5μmのに設定します。別々のオブジェクトが表示されるまで、スライドバーを使用してしきい値を設定します。
注：断片化を適用した後、結果ウィンドウを定量化イベントや画像の着色フラグメンテーションの表を示します。いくつかの核とが直接接触するように、手動で正しくソフトウェアで区切られていない可能性がありダブレット、の自動測定結果を補正します。
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Representative Results
in vitroでの出生後の心筋細胞の細胞周期活性に対するsiRNAを/ miRNAの効果を分析するために、二重トランスジェニックMYH6-H2B-MCH / CAG-EGFP-anillinマウスの心筋細胞は、生後3日目（P3）で単離し、でトランスフェクトしました細胞周期活性誘導miR199 5は、siRNA P27、およびsiRNA Fzr1。陰性対照（ 図1A）と比較して、miR199-（ 図1B）およびsiRNA p27-（ 図1C）の写真は、心筋細胞が細胞周期活性の誘導を示すトランスフェクトしました。 Fzr1の阻害がトランスフェクトされた細胞の核内でのeGFP-anillin融合タンパク質の蓄積をもたらし、Fzr1の損失がAPCの阻害をもたらすようにeGFP-anillinマウスモデルにおいて、Fzr1に対するsiRNAは、トランスフェクションコントロールとして使用することができますFzr1。 Fzr1はプロテアのためanillinをターゲットと後期促進複合体のE3リガーゼの補因子であり、OMAL劣化。 図1Dは、〜45％のトランスフェクション効率を示す、トランスフェクションの3日後にsiRNAをFzr1トランスフェクト心筋細胞の共焦点概観写真を示します。 （P27 6のノックダウンした後に、例えば ）核内倍加を行う心筋細胞はもっぱら核のeGFP-anillin発現（ 図1E）を示すかのeGFP-anillin陰性（説明を参照）です。核内倍加のみエンドS期（EGFP-anillin陽性）およびエンド- G相（EGFP-anillin陰性で構成として彼らは、典型的なM相のローカライズ（ 図1FおよびG）におけるEGFP-anillinを発現しません）。エンド-Gの段階では、APCは、プロテアソームにおけるEGFP-anillinのユビキチン化および分解の結果、アクティブです。
成人期におけるモノおよび二核心筋部の定量化は、ラン後の単一細胞レベルでのいずれかで行うことができますMYH6-H2B-MCHトランスジェニックの心臓のまたはトランスジェニック心の厚いcryoslicesでgendorff解離。ランゲンドルフ装置、心房及び心室における心臓組織の酵素消化後に機械的に分離され、互いに独立して分析することができます。核H2B-MCHの発現によって示されるように、 図2Aは 、二核心筋度の高いランゲンドルフ分離後の非固定H2B-MCHトランスジェニック心室の心筋細胞の代表的な画像を示しています。対照的に、心房心筋細胞の大部分が（ 図2B）単核されています。酵素消化は100％単セルにならないように、αアクチニン染色によって明らかにされたクロスストライエーションのパターンは、二核心筋細胞（クロスストライエーションの連続パターン、 図2C）と細胞ダブレット間の識別を容易にします。 図2Dは 、中二核心筋細胞の識別の例を示しています田舎のスライス。
成人MYH6-H2B-MCHトランスジェニックの心臓の厚いスライスの3D再構成は、組織内の生理学的条件下で心筋細胞核の割合を決定することができます。 図2Eに示すように、イメージングソフトウェアの3Dモジュールを使用して、ヘキスト染色した核およびH2B-MCH陽性核は、自動的に検出し、計数することができます。最終的な結果は、この場合には、互いに直接手を触れ核を意味し、二重のために手動で修正する必要があります。厚いスライスにおける心筋細胞の核の指標を分析するために、核が1 z平面内にない、必要な嘘がそうであるように、手動で、スタックをスクロールすることが必要です。 WGA染色は、セルの枠線の検出を可能にします。
図1：In の例siRNAによるトランスフェクション後の生後心筋細胞における細胞周期活性の in vitro 可視化。 （AD）αアクチニン（白）について染色のeGFP-anillin / MYH6-H2B-MCHの心からP3心筋細胞。心筋細胞核はヘキスト核色素（青色）によってのeGFP-anillin信号（緑色）、及び核によってH2B-MCH信号（赤）、細胞周期活性によって同定されます。スクランブルsiRNAをトランスフェクト（A）P3の心筋細胞は、陰性対照としての役割を果たす。バーは100μmです。 （B）P3の心筋細胞は、コントロール（A）よりのmiRNA-199ディスプレイかなり多くのeGFP-anillin信号をトランスフェクトしました。バーは100μmです。 （C）のp27のsiRNAでトランスフェクションした後に、もっぱら核のeGFP-anillin信号の例、核内倍加を示します。バーは80μmです。 （D）トランスフェクション効率の決意ためFzr1に対するsiRNAのトランスフェクション。 eGFP-anillin交流として、eGFP-anillin +心筋細胞の数は、トランスフェクション効率を示し、累積。バーは80μmです。 （EG）細胞周期の間の心筋細胞におけるEGFP-anillin（緑）の異なるローカライズ：核局在化（Eの矢印）、収縮環（F中の矢印）、および中心体の局在化（G中の矢印）。バーは、（E）中の20ミクロンと（FとG）で10μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：H2B-MCHマウスからの心筋細胞のランゲンドルフ分離により多核化の評価のため、厚いスライスの3D解析による例。 （A、B）心室（A）及び心房（B）成体H2から心臓から心筋細胞ランゲンドルフ解離によって分離した後、B-MCHトランスジェニックマウス。バーは50μmです。 αアクチニン（緑色）について染色MYH6-H2B-MCHの心から（C）心筋細胞。心筋細胞核はH2B-MCH信号（赤）によって識別されます。バーは10μmです。厚いスライス（矢印）中の（D）二核の心筋細胞。心筋細胞核はH2B-MCH信号（赤）、TOPRO3による細胞WGA染色によって境界（緑）および核（白）によって識別されます。バーは50μmです。 （E）ワークフローの厚さにスライスにおける二核性の3D分析のため。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
心筋細胞は、細胞周期を再入力し、損傷後や組織の恒常性の間に分割することができるかどうかをめぐる論争があります。心筋細胞の基本的な売上高の値は1％1と80％7の範囲で与えられています。 40％7 - 、心臓病変後、細胞周期活性の誘導および新しい心筋細胞の生成は、0.0083％〜8と25の間の値と、境界域で報告されています。これらの不一致は、部分的に心臓の核を同定するための異なる実験的アプローチ、9組織切片の細胞分裂の間に非常に困難なプロセスによって説明することができます。心筋細胞は、細胞周期の変動を受けやすいように、倍数体および多核細胞をもたらす核内倍加およびacytokinetic有糸分裂、より本格的な細胞分裂を区別するために決定的に重要です。ために細胞分裂の同定は、そのような収縮リングとmidbodiesなどの細胞分裂の特徴を視覚化するだけでなく、二核心筋細胞のパーセンテージを決定する必要があります。我々は、詳細に心筋細胞における細胞周期活性を分析し、単離された細胞または厚い部分でnuclearityの程度を決定するための技術を開発しました。
eGFPの-anillinシステムは対称的収縮環（ 図1F）と中心体（ 図1G）、および核内倍加およびacytokinetic有糸分裂のための間接的な証拠の可視化を通じて、細胞分裂の直接の証拠を提供することに留意することが重要です。前述のように、収縮環の一方的な侵入の発生は二核性10の指標であり、これはのeGFP-anillinシステムで観察することができます。
核内倍加は無収縮環またはMI限りとして示唆されていますdbodyは必須これらのローカライズを検出する確率の計算を行いいる、観察されます。 25時間の細胞周期の継続時間、20分の収縮環の可視性の平均期間、および1時間の中心体の永続性を仮定すると、100分周のeGFP-anillin陽性細胞と4 midbodiesで1収縮環があるはずです。統計的に言えば、25のeGFP-anillin陽性細胞の最小値は、細胞周期の変動から細胞分裂を識別するために分析される必要があります。 （多くの場合不明である）は、細胞周期の持続時間が増加または減少すると、この数はそれに応じて変化します。これはまた、（1E図 ）のeGFP-anillin信号の大部分が核になることを意味し、M-相として、非核のローカライズを持つ唯一の相は、わずか約1時間持続します。
生後発育の間に、二核性は、マウス心臓で起こると心室の心筋細胞に90％まで（〜ヒトでは25％）11を上昇させます。フォー心臓における再生の分析をR、二核性の程度を決定することが重要です。すなわち、ランゲンドルフ解離および心臓組織の厚い部分の作成：私たちは、この重要な形態学的特徴に対処するための2つの方法を説明します。ランゲンドルフ分離は、簡単かつ迅速ですが、厚い部分の形態は、より多くの時間がかかるだけでなく、より正確です。興味深いことに、我々はランゲンドルフ分離は、二核心筋細胞の割合を過大評価することを見出しました。これは、このむしろ剛性の手順中の単核及び二核細胞の異なる生存率が原因である可能性があります。
出生後の心筋細胞における増殖の誘導は、心臓の再生に新興のアプローチであるように、このプロトコルは、2つのトランスジェニックマウス系統、MYH6-H2BmChとCAG-EGFP-anillinを組み合わせることにより、スクリーニングシステムを説明しています。生後日のP1上の心臓から単離された心筋細胞 - P6は簡単に培養し、miRNAをトランスフェクトすることができますかsiRNAまたは小分子のライブラリーで処理しました。心筋細胞の核を手動または自動ソフトウェアアルゴリズムによって検出することができ、潜在的な「ヒット」は、MCH +核数の増加によって決定することができます。核内倍加およびacytokinetic有糸分裂の細胞分裂の識別は、eGFPを-anillin信号の異なる局在の定量化によって行うことができます。このシステムは、出生後の心筋細胞の増殖を根底にある調節機構の上にいくつかの新しい光を当てるべきであり、心臓疾患の治療のための新たな治療薬の発見につながる可能性があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
- Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
- Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
- Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
- Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
