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Immunology and Infection

Développement d'un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

Ce protocole est une alternative rentable pour exprimer l'ADN plasmidique nu dans la peau de la souris. L'objectif général du protocole est de délivrer des gènes liées au système immunitaire dans le tissu de la peau pour délimiter le rôle fonctionnel d'un gène spécifique dans l'inflammation cutanée.

Abstract

Dysrégulation de la réponse immunitaire dans la peau est associée à de nombreux troubles de la peau humaine. transfert direct de gènes liées au système immunitaire dans les tissus de la peau est une approche fascinante pour étudier la modulation immunitaire de l'inflammation cutanée dans les modèles de souris de maladies humaines. Nous présentons ici un protocole rentable qui a livré l'ADN nu dans la peau de la souris et conduit à l'expression du transgène. Le procédé est inventé « acufection », désignant l' ADN trans fection acu à médiation par la perforation. Pour effectuer acufection, la peau de souris a été perfusée avec de l'ADN dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ensuite piquer légèrement avec un faisceau d'aiguilles d'acupuncture pour faciliter l'absorption de l'ADN et la transfection dans les cellules. L'ADN plasmidique est sans doute repris par le kératinocyte et les cellules dendritiques (CD) dans la peau et exprimé en protéine. Piqûre mécanique avec les aiguilles en tant que tel n'a pas causé de dommages à la peau ou induire l' activation des kératinocytes. L'expressiondes gènes transfectés a été détecté dans la peau à la fois des niveaux transcriptionnels et traductionnels suivants acufection pendant 2 jours et maintenus jusqu'à 7 jours. L'objectif principal pour le développement de cette méthode de acufection était d'étudier une isoforme précédemment définie de l'IL-15. En utilisant cette méthode, une IL-15 isoforme de l'exon 7 (IL-15ΔE7) partiellement supprimé alternativement épissé a été exprimée dans la peau et ensuite traité avec un récepteur de type Toll 7 agoniste (TLR7), imiquimod (IMQ), pour induire une inflammation. IL-15ΔE7 livré Acufection en peau supprimé la prolifération des kératinocytes, l'épaisseur de l'épiderme et le recrutement de neutrophiles dans l'inflammation cutanée induite par IMQ. Avec l'intérêt croissant pour identifier les mécanismes de régulation de l' inflammation cutanée, le protocole décrit ici fournit une alternative rentable et polyvalent pour le système de canon à gènes ou microseeding pour la délivrance d'ADN in vivo. Il peut potentiellement permettre la découverte de la fonction d'un romangène dans la peau ou pour enquêter sur un nouveau traitement pour les maladies cutanées.

Introduction

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La peau est la première ligne de défense de l'hôte. Kératinocvtes (KCS) sont le principal type de cellules dans la peau des humains et des souris. En réponse à des stimuli de l' environnement (par exemple la lumière du soleil, de l' oxygène, les produits chimiques et l' invasion pathogène), KCs sont activés et produisent une grande variété de cytokines et de chimiokines pro - inflammatoires telles que l' IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF - a α et GM-CSF 1. Ensemble, ils déclenchent le recrutement de cellules immunitaires de la peau. Aggravé l' inflammation cutanée est souvent associée à de nombreuses maladies humaines , y compris la dermatite de contact extra - utérine aiguë et l' inflammation T à médiation cellulaire chronique (par exemple la dermatite de contact allergique et le psoriasis) 2. La modulation des réponses pro-inflammatoires dans la peau en inhibant l'activation KC est une approche plausible pour traiter l'inflammation cutanée. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour exprimer transitoirement un gène de cytokine dans l'épiderme afin d'étudier res immunitairesponse en conséquence un tel traitement de la peau.

L'épiderme compose la couche la plus superficielle de la peau. Il sert de barrière physique en gardant des substances externes, tels que des acides nucléiques et des agents pathogènes de pénétrer dans les couches profondes de la peau. Plusieurs techniques sans aiguille ont été établies pour le transfert d'ADN de l' épiderme 3, 4. ADN en solution ou associés à des liposomes cationiques ou des vecteurs d'adénovirus a été directement appliqué sur l'épiderme modifiés par des techniques telles que l'élimination de la couche cornée ou le traitement avec un réactif d'épilation. L' élimination de l'épithélium kératinisé facilite l' ADN traversant la barrière épidermique et l' interaction avec les kératinocytes et les cellules de Langerhans pour induire des réponses immunitaires 5. Alors qu'une grande surface est disponible pour le transfert d'ADN et cette approche ne comporte pas d'aiguilles, il y a des inconvénients, y compris l'exigencepour les grandes quantités d'ADN (10 à 100 ug), le traitement dure sur la peau par décapage, et les résultats incohérents dans l' induction d'une réponse immunitaire chez les animaux immunisés sans assistance de délivrance d'ADN 6. L' administration intracellulaire à médiation microparticule d'ADN nu à la peau a été montré très efficace et reproductible pour induire une réponse immunitaire 7, 8. Un canon à gènes tenu à la main a été utilisé pour bombarder le site cible de la peau avec le plasmide particules d'or enrobées d' ADN 2 um de diamètre en taille au moyen d'écoulement d'air de l' hélium sous pression 9. L'ADN plasmidique est probablement absorbé par les cellules dendritiques KCsand (CD) dans la peau et la protéine est exprimée localement ou transporté à ganglions lymphatiques drainants par les CD 10. Bien que le système de canon à gènes est simple et nécessite une expérience technique limitée, le coût pour la préparation et la livraison des "ADN bullaisser "( par exemple des poudres d'or, gaz d'hélium) et pour le canon de gène lui - même a limité son application générale. En outre, l'exigence d'un système de distribution de gaz d'hélium limite la facilité du transport des armes à feu génétique lorsque les expériences sont menées à des endroits différents. Microseeding a été démontrée pour parvenir à une plus grande efficacité de transfert de gène à injection unique et un bombardement de particules 11. Microseeding utilise un pistolet de tatouage pour délivrer l' ADN de la peau sans l'utilisation de perles de particules 11. oscillante microaiguilles sur la peau en utilisant cette approche est susceptible de gratter directement la membrane cellulaire et ainsi transférer l'ADN à plusieurs cellules en même temps. Cependant, la douleur associée au grand nombre d'injections avec des aiguilles 0,254 mm de diamètre est un inconvénient.

Nous fournissons ici une approche alternative à la livraison d'ADN in vivo. Le « acufection » IMQ-12. Alors que acufection se révèle être une dema facile et moinsProcédé nding pour la délivrance d'ADN in vivo, la quantité optimale d'ADN de différents gènes et les temps de piquer la peau doivent être soigneusement optimisées pour obtenir des résultats reproductibles.

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Protocol

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Des souris femelles à 8 - 12 semaines ont été utilisés pour cette étude. C57 / BL6 de type sauvage (WT) et l' IL-15 déficiente (IL15 - / -) souris ont été achetés auprès de Centre national des animaux de laboratoire (NLAC), Taiwan et Taconic Farm, respectivement. IL-15 déficient (IL15 - / -) et de l' IL-15-dominant (+/- IL15 et l' IL15 + / +) ont montré un rapport 1: 3 dans la deuxième génération de la croix des hétérozygotes de IL15. Le génotype de IL15 - / - souris a été confirmée par une analyse par PCR. Les souris ont été maintenues dans l'installation spécifique exempt d'organismes pathogènes (SPF) au Laboratoire Animal Center (BAC), l'Université nationale de Taiwan (NTU) College of Medicine. Toutes les procédures d'animaux, y compris les matériaux anesthésiques et les méthodes ont été effectuées conformément au protocole animal approuvé par l'Université nationale de Taiwan College of Medicine et College of Institutional Animal Care santé publique et le Comité d'utilisation (IACUC) (Affidavit d'approbation du Protocole des animaux 20130225).

<p class = "jove_title"> 1. Préparation des aiguilles d'acupuncture

REMARQUE: Les aiguilles d'acupuncture sont des dispositifs médicaux composés d'un manche et une extrémité d'aiguille (Figure 1A). Les diamètres de l'aiguille d'acupuncture variait de 0,2 mm (36 G) à 0,35 mm (28 G). Nous choisissons le meilleur point de l'aiguille pour éviter les dommages potentiels cellulaire excessive pendant la peau repiquage. Il y a 4 longueurs différentes de l'aiguille de 0,2 mm dont 13 mm (0,5 in), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 in) et 50 mm (2,0 in) de longueur. Un faisceau de 10 aiguilles d'une longueur de 13 mm à condition que la poignée meilleur confort pendant oscillant l'aiguille sur la peau de souris C57BL / 6. Les paramètres peuvent être modifiés si la méthode est appliquée à la peau des plus grands animaux ou réalisée par des chercheurs avec de grandes mains.

  1. Retirer les aiguilles d'acupuncture de l'emballage stérile, apyrogène. Placez les aiguilles sur un champ stérile.
  2. Utiliser du ruban d'étiquetage adhésif pour lier ensemble les aiguilles 10 ina faisceau (figure 1B).
    REMARQUE: Les 10 aiguilles sont géométriquement agencées pour former une forme de cylindre. Pour plus de commodité, utiliser un morceau de film de paraffine pour stabiliser l'agencement avant d'appliquer le ruban adhésif. Assurez-vous que tous les points d'aiguille sont sur le même plan. L'utilisation d'un faisceau au lieu d'une seule aiguille facilite la perfusion d'ADN maximale en augmentant la surface de contact entre les aiguilles et la peau.

2. Préparation d'une grande quantité et d'endotoxines sans ADN plasmidique

  1. Transformer des cellules bactériennes chimiquement compétentes avec l'ADN du plasmide.
  2. Sélectionner et inoculer une seule colonie bactérienne dans 3 ml de milieu LB contenant des antibiotiques et incuber à 37 ° C dans un agitateur pendant une nuit.
  3. Intensifier la culture par dilution de la culture bactérienne à 1: 100 dans 250 ml de milieu LB avec des antibiotiques et agitation pendant une nuit à 37 ° C
  4. Préparer une grande quantité d'ADN en utilisant une haute quality, kit de préparation de plasmide endotoxines suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE: Le protocole de Acufection nécessite une grande pureté et une grande quantité d'ADN plasmidique. Utilisation d'une haute qualité, une endotoxine libre et l'ADN de plasmide purifié colonne est recommandée.
  5. Éluer l'ADN dans de l'eau stérile. ADN de magasin en petites portions à -20 ° C jusqu'à ce prêt pour acufection.
    REMARQUE: Éviter le gel et le dégel répété de l'ADN pour assurer l'expression de l'ADN plasmidique cohérent.
  6. Diluer l'ADN de plasmide à 1 mg / mL dans du PBS stérile pour acufection.

3. Procédure de Acufection

REMARQUE: La quantité optimale de l'ADN et de l'aire de la surface de la peau cible peut varier pour les différents gènes et doivent être encore optimisé. La force de piquage et le nombre de fois pour détacher la couche cornée de la peau peut également varier en fonction de l'épaisseur de la peau. Ces conditions doivent être soigneusement déterminées après évaluation du niveau d'expression du gene transcri acufectedpts par qRT-PCR.

  1. Peser les souris et administrer tribromoéthanol (400 ug par g de poids corporel) par injection peritoneale.
    NOTE: 2,2,2-tribromoéthanol est un agent anesthésique injectable qui a été couramment utilisé chez la souris. Les solutions sont préparées par dissolution d'une qualité non pharmaceutique 2,2,2-tribromoéthanol (2,5 g) dans de l'eau distillée (200 ml) contenant 2,5% de 2-méthyl-2-butanol.
  2. Appliquer une pommade vétérinaire sur ophtalmologiques yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    REMARQUE: un effet anesthésiant sera induit dans 1 - 2 min. Vérifiez le réflexe de pincement de l'orteil pour assurer une profondeur suffisante de l'anesthésie avant l'opération.
  3. Raser la peau du flanc dorsal et appliquer la crème épilatoire pour dissoudre les protéines de kératine dans l'arbre de cheveux.
    REMARQUE: L'utilisation de la crème épilatoire pour enlever les poils facilitera la perfusion d'ADN dans la peau.
  4. Utilisez des boules de coton imbibé d'eau pour essuyer la crème épilatoire.
    NOTE: La crème épilatoire est soluble dans l'eau. L'élimination complète de la crème will empêcher une surface grasse et d'assurer un meilleur résultat picotement.
  5. Utilisez un coton-tige stérile imbibé d'éthanol à 70% pour désinfecter la surface de la peau.
  6. Marquer la zone cible (1 cm x 1 cm) sur la peau épilée avec un pochoir pré-mesuré. NOTE: Pour marquer le site cible vous aidera à appliquer le faisceau d'aiguilles vers le haut et vers le bas dans une zone définie. Ceci est important pour assurer la livraison de la même quantité d'ADN à une surface spécifique afin de minimiser la variation expérience à l'expérience.
  7. Placer une goutte de 10 ul d'ADN de plasmide (10 pg) sur la peau sensible.
    REMARQUE: La quantité d'ADN pour acufection varie en fonction de différents gènes et le type de vecteur d'expression. La quantité d'ADN utilisé doit être soigneusement avant de procéder à titrer l'expérience d'intérêt. Le 10 ul est une petite goutte de liquide et il se trouve bien sur la peau rasée et épilée sans rouler vers le bas en piquant. Inclure un groupe témoin de souris traitées avec 10 ul d'ADN vecteur vide pour le comparer avec une souriscufected avec le gène de l'étude.
  8. Tenir le faisceau d'aiguilles d'acupuncture (figure 1B) et piquer la surface marquée avec un mouvement de va-et-vient à 100 fois ou jusqu'à ce que l'humidité de l' ADN dans du PBS sur la peau disparaît. REMARQUE: une rougeur de la surface de la peau peut se produire. Évitez de faire des coupes profondes qui saignent. Le nombre de va-et-baisse des mouvements piquage sur la surface de la peau est fonctionnellement déterminée lorsque l'humidité de l'ADN dans du PBS (10 ul) disparaît sur la peau. Nous avons décidé 100 fois en 30 s, car il a donné les résultats les plus constants de gènes livrés acufection. Le cas échéant, les aiguilles peuvent être réutilisés jusqu'à 6 de la peau aiguillons cible (1 cm x 1 cm chacun). Rincer les aiguilles dans 70% d'éthanol et entre acufection PBS. Changer de nouvelles aiguilles quand ils sont ternes ou pour différents ADN plasmidique pour éviter la contamination croisée.
  9. Placer les souris acufected sur un coussin chauffant pour maintenir la température du corps jusqu'à éveillé.
  10. Retour souris dans leur cage quand ils ontrepris conscience suffisante. Remarque: Gardez les souris acufected dans une cage séparée (moins de 5 animaux par cage) de la cage de souris un-acufected.
  11. Mettez une bouteille d'eau en place et retourner la cage au rack IVC (cage ventilée individuellement).

4. Les soins postopératoires

  1. Pour les premières 48 heures après la procédure, suivre de près les souris pour tout inconfort, y compris des changements de comportement (agitation, agitation ou trouble de l'alimentation) ou apparence anormale (poil rugueux ou posture recroquevillée).

5. L'imiquimod (IMQ) Traitement de l'IL-15ΔE7-acufected peau

REMARQUE: l'expression transcriptionnelle et la production de protéines du gène acufected sont détectables au jour 3. Les souris acufected avec le plasmide d'intérêt peut être traité avec différents types de stimulants 3 jours après la transfection. Nous illustrons ici en traitant la peau de la souris acufected IL-15ΔE7 à la crème IMQ. IMQ est un f approuvé amine imidazoquinolinou le traitement de verrues génitales externes et périnatales 13. IMQ traitement topique est représenté à induire des troubles de la peau comme le psoriasis, l' homme chez la souris avec la manifestation de la peau squameuse, la prolifération de l' épiderme et de l' infiltration des neutrophiles dermique 12, 14, 15.

NOTE: Le vecteur de plasmide contenait souris de longueur totale de l'IL-15 d'ADNc, sous la régulation du facteur 1 d'allongement α (PEF), flanqué d'un peptide signal de l'IL-2 et un marqueur FLAG à l'extrémité C-terminale (pEF-IL- 15, 5859 paires de bases), qui a été construit comme décrit par Bamford et al. 16. Le plasmide est utilisé comme un modèle de l'IL-15 pour supprimer les 16 premiers acides aminés au niveau des résidus 33-48 dans l'exon 7 de l'IL-15 gène de IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 paires de bases) par SOE (synthèse par extension de chevauchement) de la méthode PCR 17. Des colonies bactériennes qui ont été avec succèstransformée avec IL-15ΔE7 ont été vérifiées par digestion par enzyme de restriction et suivie d' un séquençage d'ADN 12, 18. Une grande quantité d'ADN plasmidique exempt d'endotoxine est préparé comme décrit dans l'étape 2 du protocole.

  1. Anesthésier les souris acufected par injection intraperitoneale de tribromoéthanol (400 ug par g de poids corporel) et appliquer une pommade ophtalmologique vétérinaire sur les yeux pour empêcher sec sous anesthésie. Vérifiez le réflexe de pincement de l'orteil pour assurer une profondeur suffisante de l'anesthésie avant le début des procédures opératoires. NOTE: Depuis un 2 cm x 2 peau cm sera traitée pour IMQ, 2 doses de s'acufected sur 2 sites cibles d'ADN plasmide pIL-15ΔE7 (10 ug dans 10 ul de PBS par dose) (1 cm x 1 cm chacun).
  2. Mark peau flanc (2 cm x 2 cm) recouvrant la zone acufected.
  3. Utilisez applicateur Q-tip pour appliquer par voie topique de la crème IMQ sur l'aire de surface marquée. Note: l'étape 5.1 est effectué uniquement pour la première dose (60 mg / dose).Les doses suivantes consécutives sont appliquées à des souris non anesthésiées.
  4. Documenter les changements de la peau dorsale traitée IMQ quotidienne avec un caméscope haute définition. Remarque: Une personne tient la souris tandis qu'un autre enregistrement. Les images fixes sont prises et modifiées ultérieurement.
  5. Euthanasier des souris par injection d'une surdose de tribromoéthanol (800 ug par g de poids corporel) suivie d'une dislocation cervicale au jour 4 ou 7 jours après le traitement IMQ. La peau est excisée et traitée (étapes 04.01 à 04.05).

6. homogénat peau de souris

  1. Utiliser une paire de ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe horizontale à partir de la base de la queue. Procéder bilatérale à la base de la patte arrière et continuer à couper verticalement le long du flanc à la base de la patte antérieure.
  2. Retirer délicatement la peau du tissu sous-jacent de postérieur à l'antérieure. Utilisez les ciseaux pour couper la peau dorsale. Placez la peau sur une boîte de Pétri stérile.
  3. Utilisez un scalpel pour exciser ciblela peau et les congeler dans de l'azote liquide immédiatement. Remarque: la même taille de la peau sans acufected (1 cm x 1 cm) ou avec un traitement IMQ (2 cm x 2 cm) est fixé pour chaque souris pour minimiser les variations expérience-à-expérience.
  4. Placez le tissu de la peau congelée au centre d'une pré-refroidie de mortier à 2 compartiments avec des poignées et un pilon. Utilisez un marteau de plomb sur le mortier pour pulvériser le tissu.
  5. placer rapidement le tissu pulvérisé dans un nouveau tube contenant 500 ul de réactif de lyse de cellules pour l'extraction de l'ARN ou à un tube contenant 50 ul de PBS 1x et cocktail d'inhibiteurs de protease pour obtenir un lysat de protéine.

7. H & E et Immunohistochimique de la Section de la peau

  1. Placez le tissu de la peau dans une cassette et la plonger dans 4% paraformaldéhyde du jour au lendemain.
  2. Intégrer et section du tissu, ce qui dans notre cas a été réalisée par le laboratoire de pathologie à BAC, NTU. Remarque: La section est coupé à une épaisseur de 5 um. Placer le tissu sections sur des lames chargées positivement.
  3. Chauffer les lames à 65 ° C pendant 15 min.
  4. Placer les lames dans un rack de coloration. Immerger le support dans le réservoir correspondant contenant substitut du xylène pendant 5 minutes deux fois, suivie par immersion successive dans 100%, 95%, 80%, 75%, 60% et 50% d'éthanol (5 min chacun) pour la réhydratation. Immergez les lames dans l'eau du robinet pendant 3 min avant la coloration.
  5. Effectuer hématoxyline et éosine. Remarque: H & E tache a été réalisée sur demande au laboratoire de pathologie à BAC, NTU.
  6. Pour colorant immunohistochimique, bloquer la section avec une solution de bloc à température ambiante pendant 5 min pour réduire la coloration de fond non spécifique. Remarque: La solution de bloc est développé dans le commerce avec des techniques d'immunocoloration. Pas de sérum animal est contenue dans ce produit.
  7. Plonger la lame dans du PBS pour rincer la solution de blocage.
  8. Diluer la solution de bloc dans du PBS à 01:10 et ajouter 2% de sérum bovin fœtal (FBS) (solution de diluant).
  9. Colorer une section en série dans le même essai avec la même solution en omettant l'anticorps primaire pour contrôler la liaison non spécifique de l'anticorps secondaire.
  • Laver les lames trois fois dans du TBS plus 0,1% de Tween-20 (solution de TBST) pendant 5 minutes chacun. Changement solution entre les lavages.
  • Pipeter une goutte de polymères marqués à chaque section et incuber à température ambiante pendant 40 min. Remarque: le polymère marqué est préparé dans le commerce en combinant des polymères d'acides aminés avec la peroxydase et un anticorps secondaire qui se réduit à un fragment Fab ». Le réactif est prêt à l'emploila coloration immunohistochimique de coupes de tissus de souris.
  • Laver les lames trois fois dans TBST pendant 5 minutes chacun. Changement solution entre les lavages.
  • Pipette 3,3'-diaminobenzindine solution tétrachlorhydrate (DAB) sur la section de tissu et laisser reposer à température ambiante jusqu'à ce qu'un précipité brun est visible sous un microscope en champ clair. Remarque: Le temps de DAB pour précipiter en présence de peroxydase est d'environ 30 min.
  • Immerger les lames dans l'eau pour arrêter l'activité peroxydase. Tremper les lames en solution verte méthyle pour la coloration nucléaire. Laver les lames trois fois dans du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
  • Placer une lamelle couvre-objet sur la section colorée qui est recouverte d'un milieu de montage permanent (8 pi par section).
  • 8. Photographie et analyse des Stained Section des tissus

    1. Visualiser des coupes de tissus colorées H & E et IHC sous un microscope à champ clair. appareil de capture d'images à l'aide de dispositifs à couplage de charge (CCD) fixé au microscope. pour qanalyse QUANTITATIVE, logiciel d'imagerie peut être utilisé
      1. Numérisez l'ensemble des sections colorées à l'aide d'un ScanScope avec un objectif 20X.
      2. Mesurer l'épaisseur de l'épiderme dans un segment de 1 mm de l'épiderme et de compter le nombre de cellules immunoréactives Ki67 dans le segment.
        NOTE: L'analyse quantitative est réalisée grâce à l'automatisation et le logiciel d'analyse d'images au microscope. épaisseur de l'épiderme est définie par la distance entre la couche de base et la couche la plus externe de l'épiderme.
      3. Compter le nombre de cellules immunoréactives Ly6G dans la région du derme (230 x 270 um2 rectangle) immédiatement en dessous de la peau topique traité IMQ.

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    Representative Results

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    Alors que quelques rougeurs était évidente dans la première heure après avec des aiguilles d' une piqûre acupuncture, la peau éclaircit le jour 2 et aucune réaction cutanée indésirable jusqu'au jour 7 a été observée après repiquage (figure 2A). Picotement de l' aiguille induit très faible niveau de orthokératosiques épidermique et infiltration cutanée minimale par l' analyse H & E par rapport à la peau non traitée (figure 2B). L'épaisseur de l' épiderme (figure 2C) et le nombre de cellules Ki67 + (Figure 2D) étaient comparables entre la peau de l' aiguille-dressées et non traitées, ce qui démontre que la peau acupuncture aiguille piquée n'a pas provoqué de perturbation notable des tissus ou la prolifération cellulaire dans l'épiderme. Par rapport à l'aiguille de seringue (1,067 mm de diamètre) 12, piquant avec des aiguilles d'acupuncture induit des taux réduits de l'expression de la chimiokine CXCL-1 cytokine pro - inflammatoire et l' IL-6 au jour 2 qui a continué à diminuer au jour 5 (figure 3A). Pour valider l'expression du transgène acufected dans la peau de souris, un plasmide exprimant l'ADNc de l'IL-15 a été acufected dans la peau de souris C57BL / 6 (IL-15 KO) IL-15 déficiente. Bien que de faibles niveaux de transcription de l' ADN de plasmide acufected ont été observés dans la peau épilée, oscillation avec des aiguilles d'acupuncture amélioré le niveau de transcription du gène (figure 3B). La production d' IL-15 a été détectée le jour 2 et est resté stable jusqu'à 7 jours (figure 3C). Ces résultats démontrent que acufection insuffle efficacement l'ADN plasmidique et permet l'expression de la protéine codée dans la peau sans provoquer une activation excessive des kératinocytes.

    souris WT ont été acufected avec un plasmide codant pour IL-15ΔE7. Les souris exprime l'ARNm de l'IL-15ΔE7 et la protéine jusqu'à 3jours après la transfection (figure 4A). Les souris ont ensuite été traités par voie topique avec de la crème IMQ au jour 3. Bien que le traitement IMQ flocons argentés induits dans la lutte contre les souris WT, les flocons argentés IMQ induites ont été réduites chez les souris IL-15ΔE7 acufected WT (figure 4B). Fait intéressant, l' expression de IL-15ΔE7 acufected significativement inhibée Ly6G + infiltration des neutrophiles dans la peau traitée IMQ-par rapport à la peau unacufected WT (Figure 4C) 12. Par acufection, nous avons démontré la nouvelle fonction de l'IL-15ΔE7 dans la peau. IL-15ΔE7 module IMQ induisant une infiltration de neutrophiles.

    Figure 1
    Figure 1. Illustration des aiguilles d'acupuncture. (A) L'aiguille d'acupuncture (36 G x 0,5" ) est composé d'unmanipuler et à une extrémité de l'aiguille. (B) Dix aiguilles d'acupuncture sont liés en un faisceau en utilisant des rubans adhésifs. La longueur du faisceau est d'environ 4 cm, mesurée par la règle (panneau inférieur). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 2
    Figure 2. Piquer par les aiguilles d'acupuncture ne cause pas de dommages Notables peau ou Kératinocyte Activation. (A) les sites marqués en triple carrés gris sur la peau du flanc rasé et épilé de la souris a été piqué 100 fois par chacune des aiguilles d'acupuncture. Les photographies ont été prises à la première heure et jusqu'à 7 jours après le repiquage pour surveiller les dommages de la peau. peau rasée et épilée sans piqûre d'aiguille a été utilisée comme contrôle. <strong> (B) H & E, l' analyse des coupes de peau inclus dans la paraffine fixés au formol à partir de la peau de souris non traitées ou aiguille piquée. Barre d'échelle: 100 um. (C) un millimètre changements de sections colorées H & E de la peau de souris non traitées ou piqué-aiguille a été sélectionné pour la mesure de l'épaisseur de l' épiderme (la distance de base à la couche la plus externe). Chaque barre représente la moyenne de l'épaisseur de l'épiderme mesurée à partir de 3 sections de peau. barre d'erreur représente l'erreur type de la moyenne (SEM). L'importance de la différence entre les groupes a été testé par le test t de Student non apparié. (D) des sections en série des mêmes échantillons ont été colorés avec des anticorps anti-Ki67 pour l' analyse immunohistochimique. Chaque barre représente la moyenne de cellules Ki67 + localisées dans chaque 150 um d'épiderme de longueur pour 1 segment mm. barre d'erreur représente l'erreur type de la moyenne (SEM). L'importance de la différence entre les groupes a été testé par deux voies ANOVA folldue par le test post hoc de Bonferroni. (ns: non significatif). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    figure 3
    Figure 3. Acufection exprime efficacement la protéine d'intérêt sans provoquer de Notables Kératinocyte Activation. (A) rasée et la peau épilée de flanc a été laissé non traité (CNT), l' abrasion avec 1,067 mm de diamètre (19 G) aiguille de seringue (Syr.) Ou 100 fois par piqûre des aiguilles d'acupuncture (ACU.). Les niveaux de transcription de CXCL-1 et IL-6 au jour 2 et le jour 5 ont été mesurées par qRT-PCR (n = 3). (B) rasée et la peau épilée de souris IL-15 déficient a été appliqué par voie topique d'une goutte d'un ADN de plasmide exprimant l' IL-15 without (dépilation) ou avec piqûre d'aiguille d'acupuncture (dépilation + piqûre). La transcription d'IL-15 dans chaque groupe le jour 2 a été mesurée par qRT-PCR TaqMan. La transcription d'IL-15 était indétectable dans le contrôle PBS (NTC) de souris IL-15 déficientes. (C) IL-15 production de IL-15 déficiente en peau de souris qui a été traitée pendant plusieurs jours ou de l' IL-15-acufected (un tissu pour chaque jour) ont été mesurés par ELISA IL-15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 4
    Figure 4. Démonstration de l' IL-15ΔE7 Atténue induite par IMQ Silvery floconneux peau et inhibitions neutrophile Infiltration. (A) Le niveau de la transcription et la production de protéines d'IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6; E7) ou de la peau vecteur de contrôle vide (WT / pEmpty) ont été mesurées par qRT-PCR et ELISA (n = 2, chaque point de temps), respectivement. (B) par vecteur vide ou l' IL-15ΔE7-acufected peau de flanc au jour 3 a été traitée par voie topique avec de la crème IMQ (60 mg). Les photographies de WT / pEmpty et le flanc de la souris WT / pIL-15ΔE7 au jour 6 après le traitement. IMQ (C) des coupes de peau provenant de souris WT / pEmpty ou WT / PIL-15ΔE7 après le traitement IMQ aux jours 3 et 6 ont été colorées avec un anticorps anti-Ly6G et dénombrées. Chaque barre représente la moyenne des cellules Ly6G + à partir de 4 souris traitées IMQ. barre d'erreur représente l'erreur type de la moyenne (SEM). L'importance de la différence entre les groupes a été testé par deux voies ANOVA suivi du test post hoc de Bonferroni. Les panneaux A et C sont modifiées avec l' autorisation du Journal of Investigative Dermatology, numéro de licence 3901890227597. S'il vous plaît cliquer surici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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    Discussion

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    L'étape la plus critique pour assurer l'expression de l'ADN de plasmide est acufected à osciller de manière uniforme et desserrer la couche cornée de la peau. Tout en poussant les aiguilles doucement sans couper la peau, la force devrait être assez dur pour appuyer sur la surface. Afin de faciliter l'absorption de l'ADN dans une solution de 10 ul sur un 1 cm x surface de 1 cm, les aiguilles doivent osciller vers le haut et vers le bas pour environ 100 fois dans les 30 s. On peut déterminer la force qui doit piquer la peau et en notant le nombre de fois qui est nécessaire pour obtenir le meilleur niveau d'expression du gène acufected.

    Modification de la quantité d'ADN plasmide appliqué pour atteindre un niveau d'expression satisfaisante après acufection peut être nécessaire car il peut varier pour différents gènes. des expériences de titrage doivent être effectuées pour déterminer la quantité optimale de l'ADN plasmidique à appliquer avant l'expérience aussi bien. Les résultats de l'analyse quantitative RT-PCR contribueront à déterminer l'optimal quantité d'ADN plasmidique et les meilleures conditions afin d'obtenir des résultats reproductibles.

    Le mécanisme précis du processus de acufection reste à préciser. Bien que la transcription à partir du plasmide ADN est produite dans la peau tondue et épilée délivré par voie topique au niveau bas, une piqûre par des aiguilles d'acupuncture amélioration de l' efficacité de transfection (Figure 3B). Par analogie de protocole microseeding dans lequel de multiples perforations avec le pistolet de tatouage 11, l' ADN de plasmide délivré acufection-est probablement facilitée par le grattage de la membrane cellulaire de kératinocytes et les follicules pileux 19, 20. Stimulation de l'épiderme par l' épilation, le réactif d' épilation et l' oscillation de l' aiguille peuvent induire l' activation des kératinocytes dans une certaine mesure et en outre d' améliorer l' absorption d'ADN par les DC Langerhans et 6. Une limitation de ce protocole est que la quantité d'ADN plasmidique reprispar les cellules ne peuvent pas être contrôlées avec précision. Nous ne suggérons pas d'utiliser cette méthode pour traiter une grande surface de la peau. Pour minimiser les variations dans les niveaux d'expression du gène délivré entre expériences, le volume de la solution d'ADN et la taille de la surface de la peau cible doivent être fixés pour la même série d'expériences. Pour générer des résultats reproductibles, il est souhaitable que des expériences répétées doivent être effectuées par la même personne.

    En ce qui concerne le dispositif de canon à gènes et microseeding, l'utilisation d'un faisceau d'aiguilles d'acupuncture pour délivrer l'ADN nu est peu coûteux. Les procédures sont aussi simples. Il ne nécessite que très peu d'expérience technique pour suivre le protocole acufection. Acufection provoque un traumatisme minime aux animaux et aucune perte de poids se trouve après l'opération. Le niveau de la douleur est faible à en juger par l'absence de changement significatif de comportement après l'opération de acufection.

    En résumé, en utilisant des aiguilles d'acupuncture pour desserrer lacouche cornée de la peau pour l'absorption d'ADN par des cellules hôtes fournit une méthode alternative économique pour exprimer une protéine dans la peau de souris. Un large éventail de gènes liées au système immunitaire doivent encore être caractérisé fonctionnellement dans la peau 21, et cela met en évidence la nécessité d'une étude rapide d'un nouveau gène sur la peau. En utilisant cette méthode, on peut facilement déterminer si le produit du gène d'intérêt a une fonction nouvelle. Ce protocole de acufection fournit un outil pratique et réalisable pour de nouvelles découvertes dans la modulation de la réponse immunitaire de guérir la maladie cutanée.

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    Disclosures

    Les auteurs ont aucun intérêt financier à divulguer.

    Acknowledgments

    Ce travail a été soutenu par la subvention du ministère de la Science et de la technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Nous remercions les Drs. Betty Wu-Hsieh et Chien-Kuo Lee à NTU, Leigh Zerboni à l'Université de Stanford et le Dr Peter Hoffmann à l'Université de Hawaii pour lire le manuscrit, Yun Chien à NTU pour l'assistance technique, et le Dr Wen-Chi Wei à la biotechnologie agricole Centre de recherche à l'Academia Sinica pour des conseils techniques.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

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    References

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    Développement d&#39;un ADN Système économique Livraison par « Acufection » et son application à la recherche de la peau
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    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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