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Immunology and Infection

"Acufection"와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다.

Abstract

피부 면역 반응의 조절 장애는 수많은 인간의 피부 질환과 연관되어 있습니다. 피부 조직에 면역 관련 유전자의 직접 전송은 인간의 질병의 마우스 모델에서 피부 염증의 면역 변조를 조사 할 수있는 매력적인 방법입니다. 여기에서 우리는 마우스의 피부에 벌거 벗은 DNA를 전달 유전자 발현에 이르게 비용 효율적인 프로토콜을 제시한다. 상기 방법은 천공 ACU 매개 DNA 트랜스 fection를 나타내는 "acufection"를 만들어 낸된다. acufection을 수행하려면 마우스 피부 제 인산 완충 용액 (PBS)에 DNA 주입 후 세포 내로의 DNA 및 형질 흡수를 용이하게 침 다발로 가볍게 찔러 하였다. 플라스미드 DNA는 아마도 각화 세포 및 피부의 수지상 세포에 의해 용해 단백질로 발현된다. 바늘 자체와 기계 녀석은 피부 손상을 일으키거나 각질 세포의 활성화를 유도하지 않았다. 표현형질 전환 된 유전자의 2 일간 acufection 다음 전사 및 번역 모두 수준에서 피부에서 발견 된 7 일까지 유지했다. 이 acufection 방법의 개발에 주 목적은 IL-15의 미리 정의 이성체를 조사 하였다. 염증을 유도하기 위해, 피부에 표현하고이어서 수신자 같은 수용체 7 (TLR7) 작용제, 이미 퀴 모드 (IMQ) 처리이있어서, 부분적으로 삭제 엑손 7 (IL-15ΔE7)와 다르게 스 플라이 싱 된 IL-15 이성체이었다 사용. Acufection-전달 피부는 IL-15ΔE7 IMQ 유도 된 피부 염증의 각질 세포 증식, 상피 두께 및 호중구 모집을 억제 하였다. 피부 염증의 조절기구를 식별하는 관심이 증가함에 따라, 프로토콜은 여기에 기재된 생체 내에서 DNA 전달을위한 유전자 총 시스템 또는 microseeding에 비용 효과적인 다목적의 대안을 제공한다. 잠재적으로 새로운 기능의 검색을 허용 할 수있다피부 또는 피부 질환에 대한 새로운 치료법을 조사하는 유전자.

Introduction

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피부 숙주 방어의 첫 번째 라인이다. 각질 세포 (KCS)는 인간과 쥐의 피부의 주요 세포 유형입니다. 환경 적 자극 (예를 들면 태양 광, 산소, 화학 물질 및 병원균 침입)에 응답하여, 관세청 활성화 및 IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 다양한 생산되고 α 및 GM-CSF 1. 이들은 피부에 면역 세포의 채용을 트리거합니다. 악화되는 피부 염증은 종종 급성 자궁외 접촉 피부염 및 만성 T 세포 매개 성 염증 (예를 들어 알레르기 성 접촉 피부염 및 건선) 2 등 다양한 인간 질병과 연관되어 있습니다. KC 활성화를 억제함으로써 피부의 염증 반응을 조절하는 것은 피부 염증을 치료하는 그럴듯한 방법입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 면역 고해상도를 연구하기 위해 표피에서 사이토 카인 유전자를 표현하는 새로운 접근 방식을 설명합니다피부에 이러한 치료에 결과적 ponse.

표피는 피부의 가장 표층을 구성한다. 그러한 피부의 심층 들어가는 병원체 핵산과 같은 외부 물질을 유지하는 물리 장벽으로서 기능한다. 여러 바늘없는 기술은 표피 DNA 전달 3, 4 설립되었다. 용액 중의 DNA 또는 양이온 성 리포솜 또는 아데노 바이러스 벡터와 연관된 직접 이러한 각질층의 제거 또는 시약과 함께 탈모 치료 기법으로 변성 표피에 적용되었다. 각질화 된 상피를 제거하여 DNA는 면역 반응을 유도하는 5 각화 세포 및 랑게르한스 세포, 표피의 장벽 작용을 넘어 용이하게한다. 큰 표면적이 DNA 전송을 위해 사용할 수 있으며이 방법은 바늘을 포함하지 않지만, 요구 사항을 포함하여 단점이있다스트리핑에 의해 - (100 μg의 10), 피부 가혹하고 DNA 전달 부스터 6 않고 면역화 된 동물에서 면역 반응을 유도하는 일관성있는 결과 DNA의 대량 대한. 피부 벗은 DNA의 미립자 - 매개 세포 내 전달은 면역 반응을 7, 8을 유도하는 고효율 및 재현성 것으로 밝혀졌다. 휴대용 유전자 총 가압 헬륨 기류 (9)의 수단에 의해 크기가 2 ㎛의 직경의 플라스미드 DNA 코팅 된 금 입자는 피부의 표적 부위 도배 사용되고있다. 플라스미드 DNA는 아마도 피부 KCsand 수지상 세포에 의해 흡수되고, 단백질은 로컬 표현 또는 수지상 10 림프절로 이송된다. 유전자 총 시스템은 간단하고 제한된 기술 경험은 "DNA의 BUL을 준비하고 제공하기위한 비용이 필요하지만하자 "(즉, 금 분말, 헬륨 가스)와 유전자 총을위한 자체는 일반 응용 프로그램을 제한하고있다. 실험은 서로 다른 위치에서 수행 할 때 또한, 헬륨 가스 공급 시스템에 대한 요구 사항이 유전자 총 수송의 용이성을 제한합니다. Microseeding 단일 분사 입자 충격 (11)에 비해 유전자 전달의 높은 효율을 달성하는 것으로 입증되었다. Microseeding 입자 비드를 사용하지 않고 피부에 DNA를 전달하기 위해 문신 총을 사용한다 (11). 진동이 방법을 이용하여 피부에 미세 바늘이 가능성 직접 동시에 여러 세포에 DNA를 전송하므로 세포막을 긁어. 그러나, 0.254 mm 직경의 바늘 주사 다수과 관련된 통증이 단점이다.

여기에서 우리는 생체 내에서 DNA 전달에 대한 대안 접근 방식을 제공합니다. 은 "acufection" (12)을 이용하여 증명되었다. acufection가 증명하는 동안 쉽고 덜 DEMA 수생체 내에서 DNA 전달을위한 방법을 웍 다른 유전자와 피부를 찌를 수있는 시간에 대한 DNA의 최적의 양은 신중하게 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최적화되어야한다.

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Protocol

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8에서 여성 마우스 - 연령 12 주 본 연구에 사용되었다. C57 / BL6 야생 - 타입 (WT)와 결핍 IL-15 (IL15 - / -) 마우스는 각각 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만, 타 코닉 농장에서 구입 하였다. IL15 +/- 이형의 단면으로부터 제 3 세대의 비율 결핍 IL-15 (IL15 - - /)IL-15을 보이면서 (+/- IL15IL15은 + / +) 1을 나타내었다. IL15의 유전자형 - / - 생쥐는 PCR 분석에 의해 확인 하였다. 마우스는 실험 동물 센터 (LAC), 국립 대만 대학교 의학 (NTU) 대학에서 특정 병원체 무료 (SPF) 시설에서 유지되었다. 마취 대상 및 방법을 포함한 모든 동물의 절차는 공중 보건 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (동물 프로토콜 20130225 승인의 진술서)의 국립 대만 대학 의과 대학 및 대학의 승인 동물 프로토콜에 따라 수행되었다.

<P 클래스 = "jove_title"> 1. 침의 제조

참고 : 침술 바늘은 핸들과 바늘 끝 (그림 1A)로 구성된 의료 장치입니다. 침술 바늘의 직경은 0.35 mm (28 G)는 0.2 mm (36 G)에서이었다. 우리는 피부를 따끔 따끔하는 동안 잠재적 인 과도한 세포 손상을 방지하기 위해 바늘의 최고 지점을 선택합니다. 13mm (0.5)에 25 mm (1.0)에 40 mm (1.5) 및 길이 50 ​​mm (2.0)를 포함하는 0.2-mm 바늘 길이의 4 가지가있다. 13mm 길이 10 개 바늘의 번들 C57BL / 6 마우스의 피부에 바늘을 진동하는 동안 가장 편안한 그립을 제공했다. 이 방법은 큰 동물의 피부에 이상 손으로 연구자에 의해 수행되는 경우 매개 변수를 수정할 수 있습니다.

  1. 멸균, 비발 열성 패키지에서 침을 제거합니다. 멸균 드레이프에 바늘을 놓습니다.
  2. 난 10 바늘을 함께 결합하는 접착 라벨 테이프를 사용NA 번들 (도 1b).
    참고 : 10 개 바늘 기하학적 원통 모양을 형성하도록 배치된다. 편의를 위해, 접착 테이프를 적용하기 전에 구성을 안정화 파라핀 필름의 조각을 사용한다. 모든 바늘 포인트가 동일 평면 상에 있는지 확인합니다. 대신 하나의 바늘의 번들을 사용하면 바늘과 피부의 접촉 면적을 증가시켜 최대 DNA 주입을 용이하게합니다.

2. 많은 양의 준비 및 독소가없는 플라스미드 DNA

  1. 플라스미드 DNA 화학적 유능한 박테리아 세포를 형질.
  2. 선택한 LB 배지 함유 항생제 3ml를 단일 박테리아 콜로니를 접종하고, 밤새 진탕하에 37 ℃에서 배양한다.
  3. C. 항생제를 LB 배지 100 250 mL로 37 ℃에서 밤새 진탕 : 1의 세균 배양을 희석하여 배양을 확장
  4. 고해서 양질를 사용하여 DNA를 대량으로 준비Y, 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 플라스미드 준비 키트.
    참고 : Acufection 프로토콜은 높은 순도와 플라스미드 DNA를 대량으로 필요합니다. 고품질의 사용은, 내 독소 무료 및 열 정제 플라스미드 DNA를 권장합니다.
  5. 멸균 수에 DNA를 용출시켰다. acufection에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 작은 씩에 ​​보관 DNA.
    참고 : 일관성있는 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 DNA의 반복 동결과 해동을 피하십시오.
  6. acufection 무균 PBS에 1 ㎎ / ㎖로 플라스미드 DNA를 희석.

Acufection 3. 절차

주 : DNA의 최적 량 및 대상 피부면의 면적이 다른 유전자 변화 및 더 최적화 될 필요가있다. 찌름 힘 횟수 피부 두께에 따라서 달라질 수있다 또한 피부의 각질층 느슨하게. 이러한 조건은주의 깊게 acufected 진 트랜스크리의 발현 수준을 평가 한 후 결정해야한다QRT-PCR에 의한 점.

  1. 마우스 체중을 복막 주사 tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)을 관리.
    참고 : 2,2,2- tribromoethanol 일반적으로 마우스에 사용 된 주사 마취 에이전트입니다. 용액은 2- 메틸 -2- 부탄올 중 2.5 %를 함유하는 증류 물 (200 mL) 중이 아닌 약제 학적 등급 2,2,2- tribromoethanol (2.5 g)를 용해시킴으로써 제조된다.
  2. 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다.
    참고 : - 2 분 마취 효과는 1에서 유도됩니다. 수술 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다.
  3. 지느러미 측면 피부를 면도하고 모발에 케라틴 단백질을 용해 제모 크림을 적용합니다.
    참고 : 머리를 제거하는 제모 크림의 사용은 피부에 DNA의 주입을 용이하게합니다.
  4. 제모 크림을 닦아 물을 적신 면봉을 사용합니다.
    주 : 제모 크림은 물에 용해입니다. 크림 줘야의 완전 제거L은 기름기 표면을 방지하고 더 나은 찌름 결과를 확인합니다.
  5. 피부 표면을 소독하기 위해 70 % 에탄올에 적신 멸균 면봉을 사용합니다.
  6. 마크 미리 측정 스텐실 면도 한 피부의 목표 영역 (1cm X 1cm). 참고 : 대상 사이트를 표시하는 것은 위아래 정의 된 영역 내에서 바늘 번들을 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 이 실험 실험 간 변동을 최소화하는 표면적 DNA에 동일한 양의 전달을 보장하는 것이 중요하다.
  7. 피부에 표시된 플라스미드 DNA (μg의 10)의 10 μL 강하를 놓는다.
    참고 acufection위한 DNA의 양은 다른 유전자 발현 벡터의 종류에 따라 달라진다. 사용되는 DNA의 양을주의 깊게 관심의 실험을 수행하기 전에 적정해야한다. 10 μL 작은 액적이며 ​​샤프트 동안 굴러없는 면도를 면도하고 피부에 잘 앉는다. 마우스 A를 비교하는 10 μL 빈 벡터 DNA로 처리 된 마우스의 대조군을 포함연구 유전자 cufected.
  8. 침술 바늘 번들 (그림 1B)를 누른 상태에서 100 배 또는 피부가 사라집니다 PBS의 DNA에서 수분까지 상하 운동으로 표시된 표면을 찌르. 참고 : 피부 표면의 일부 홍반이 발생할 수 있습니다. 피가 깊은 상처를 피합니다. PBS에서 DNA로부터 수분 (10 μL)을 피부에 사라지면 피부 표면에서의 움직임을 샤프트 위아래의 수는 동작 가능하게 결정된다. 이 acufection-전달 유전자 가장 일관된 결과를 제공했기 때문에 우리는 30 초에 100 번을 결정했다. 해당하는 경우, 바늘은 최대 6 개의 표적 피부 찌르는 (1cm X 1cm 각)에 대해 재사용 될 수있다. acufection 사이에 70 %의 에탄올과 PBS에서 바늘을 씻어. 그들이 무딘 또는 교차 오염을 방지하기 위해 다른 플라스미드 DNA에 대한 때 새 바늘로 변경합니다.
  9. 웨이크까지 체온을 유지하기 위해 가열 패드 acufected 마우스 놓는다.
  10. 그들이있을 때 자신의 케이지에 마우스를 반환회복 충분한 의식. 참고 : 않은 acufected 쥐의 케이지에서 별도의 새장에 acufected 마우스를 유지 (케이지 미만 5 동물).
  11. 장소에 물병을 넣고 IVC (개별 환기 케이지) 랙에 새장을 반환합니다.

4. 수술 후 케어

  1. 시술 후 첫 48 시간 동안, 밀접하게 행동 변화 (불안, 교반 또는 섭식 장애) 또는 비정상적인 모양 (거친 털 코트 또는 구부리고 자세)를 포함한 모든 불편에 대한 마우스를 모니터합니다.

IL-15ΔE7-acufected 스킨의 제 퀴 모드 (IMQ) 치료

참고 : acufected 유전자의 전사 발현과 단백질 생산은 관심의 플라스미드가 삼일 형질 전환 후 각성제의 다른 유형으로 처리 할 수와 acufected 일 3. 마우스에 감지 할 수 있습니다. 우리는 IMQ 크림과 IL-15ΔE7-acufected 마우스 피부를 처리하여 여기에 설명한다. IMQ는 imidazoquinolin 아민 승인 F이고또는 외부 생식기 및 주 산기 사마귀 (13)을 치료. 국소 IMQ 처리는 판상 피부 표피 증식 및 피부 호중구 침윤 12, 14, 15의 발현과 마우스에서 인간 건선과 같은 피부 질환을 유발하는 것으로되어있다.

주 : 플라스미드 벡터는 C 말단 (PEF-IL-에서 IL-2 신호 펩티드 및 FLAG 태그 측면 연장 인자 -1 α의 조절 (PEF)하에 전장 마우스 IL-15의 cDNA를 포함 뱀 포드 등에 의해 기술 된 바와 같이 제조 하였다 (15), 5859 염기쌍). (16). 플라스미드 잔기에서 처음 16 개 개의 아미노산을 삭제하기 위해 IL-15 주형 33 사용 - SOE 의해 IL-15ΔE7 (PEF-IL-15ΔE7, 5,811 염기쌍)에 IL-15 유전자의 엑손 7 48 (합성 오버랩 연장) PCR 방법 (17). 성공적이었다 세균성 식민지IL-15ΔE7 형질는 제한 효소 절단에 의해 확인되고 DNA 서열 12, 18 따랐다. 프로토콜 2 단계에서 설명 된 바와 같이 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 대량으로 제조 하였다.

  1. tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 acufected 마취 하에서 건조를 방지하기 위해 눈 안과 의사 연고를 적용한다. 수술 절차를 시작하기 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. 주 : 2cm X 2cm 피부가 IMQ 치료되기 때문에, 필 - 15ΔE7 플라스미드 DNA (용량 당 10 μL PBS에서 10 μg의) 2 투여 2 개 표적 부위에 acufected된다 (1cm X 1cm 각).
  2. 표 피부 (2cm X 2cm)을 acufected 면적의 측면.
  3. 국소 표시된 면적에 IMQ 크림을 적용하는 Q-팁 어플리케이터를 사용합니다. 주의 : 단계 5.1 첫 번째 투여 하였다 (60 mg / 투여 량)에 대해 수행된다.다음 연속 투여가 아닌 마취 된 쥐에 적용됩니다.
  4. 고화질 캠코더와 함께 매일 IMQ 처리 지느러미 피부의 변화를 문서화합니다. 참고 : 한 사람이 또 다른 기록하는 동안 마우스를 보유하고 있습니다. 스틸 사진을 촬영하고 나중에 편집됩니다.
  5. IMQ 처리 후 4 일째 또는 7 일째 경추 탈구 하였다 tribromoethanol의 과량 (GM 체중 당 800 μg의)을 주입하여 마우스를 안락사. 피부는 절개되고 처리된다 (- 4.5 4.1 단계).

마우스 피부 6. 균질 현탁액

  1. 꼬리의 기지에서 수평 컷을 만들기 위해 수술 가위를 사용합니다. 사지의베이스에 양자 진행하고 앞다리의베이스에 측면을 따라 수직으로 절단하는 것을 계속한다.
  2. 조심스럽게 앞쪽에 후부에서 하부 조직으로부터 피부를 벗겨. 등쪽 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 멸균 페트리 접시에 피부를 놓습니다.
  3. 대상을 절제하기 위해 메스를 사용하여피부 즉시 액체 질소에 동결. 참고 실험 실험 간 변동을 최소화하기 위해 각각의 마우스에 대해 고정 된 동일한 acufected없이 피부의 크기 (1cm X 1cm) 또는 IMQ 처리를하여 (2cm X 2cm).
  4. 핸들과와 유 봉, 사전 냉장 2 칸 박격포의 중심에 냉동 피부 조직을 놓습니다. 조직을 분쇄하기 위해 박격포에 리드 망치를 사용합니다.
  5. 신속 RNA 추출 또는 단백질 용 해물을 얻기 위해 50 μL의 PBS 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 튜브에 세포 용해 시약 500 μL를 포함하는 새로운 튜브로 분쇄 된 조직을 놓는다.

스킨 부분의 제 H & E 염색과 면역

  1. 카세트에서 피부 조직을 놓고 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에 젖어.
  2. 우리의 경우에는 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서 수행 하였다 퍼가 부 조직. 주 : 단면 5 ㎛의 두께로 절단한다. 장소 조직 섹션에 ì양전하를 슬라이드 위에 기능.
  3. 15 분 동안 65 ° C에서 슬라이드를 가열한다.
  4. 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 회 100 %, 95 %, 80 %, 75 %, 60 % 및 재수 50 % 에탄올 (각 5 분)에 순차 침지 한 다음 5 분간 크실렌 대체물을 포함하는 탱크에 대응하는 랙을 담근다. 염색 전에 3 분 동안 수돗물 슬라이드를 담근다.
  5. 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 수행합니다. 주 : H & E 염색은 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서의 요청에 따라 수행 하였다.
  6. 면역 조직 화학 염색을 위해, 비특이적 백그라운드 염색을 감소시키기 위해 5 분 동안 실온에서 차단 용액으로 차단 부. 참고 : 블록 솔루션은 상업적으로 면역 염색 기술로 개발되고있다. 어떤 동물 혈청이 제품에 포함되지 않습니다.
  7. 블록 솔루션을 씻어 PBS에서 슬라이드를 찍어.
  8. 1:10 PBS에서 차단 용액을 희석하고, 2 % 소 태아 혈청 (FBS) (희석액)을 추가한다.
  9. 동일한 용액은 이차 항체의 비특이적 결합에 대해 제어하는 ​​차 항체를 생략과 동일한 실행 한 직렬 섹션 얼룩.
  • 세척을 5 분마다 TBS 세 번 더하기 0.1 % 트윈 -20 (TBST 용액)을 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다.
  • 각 구역에 표지 된 중합체의 한 방울을 피펫 및 40 분 동안 실온에서 배양한다. 주 : 표지 중합체 상업적 된 Fab '단편 감소 옥시다아제 및 이차 항체 아미노산 중합체를 조합하여 제조된다. 시약은 사용 준비가마우스 조직 절편의 면역 조직 화학 염색.
  • 워시는 5 분마다 TBST에 세 번 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다.
  • 피펫 3,3'- diaminobenzindine 조직 섹션 위에 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션과 갈색 침전물이 밝은 필드 현미경 아래에 보일 때까지 실온에 서 보자. 주 : DAB는 퍼 옥시 다제의 존재 하에서 석출하는 시간은 약 30 분이다.
  • 과산화 효소 활동을 중지하기 위해 물에 슬라이드를 담가. 핵 염색 메틸 녹색 솔루션의 딥 슬라이드. 워시는 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드.
  • 영구 장착 매체 (부 당 8 μL)으로 덮여 염색 섹션 위에 커버 슬립을 놓는다.
  • 제 사진 및 분석 스테인드 조직 절편의

    1. 명 시야 현미경으로 H & E 염색 IHC 조직 절편을 시각화. 현미경에 연결된 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 이미지를 캡처. Q 들어uantitative 분석, 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다
      1. 20 배 목표와 scanscope를 사용하여 전체 스테인드 섹션을 검색합니다.
      2. 표피의 1 mm 세그먼트 내의 표피 두께를 측정하고, 세그먼트 내의 Ki67 면역 세포의 수를 계산.
        참고 : 정량 분석은 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 표피 두께 기저층과 표피의 최 외곽 층 사이의 거리에 의해 정의된다.
      3. 바로 국소 IMQ 처리 피부 아래의 피부 영역 (230 X 270 μm의 구형 2)에 Ly6G 면역 세포의 수를 계산.

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    Representative Results

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    일부 붉은 침술 바늘로 찌르는 후 첫 시간 이내에 분명 동안, 피부는 하루 2 지워지고 7 일까지 불리한 피부 반응 (그림 2A)를 따끔 따끔 후 관찰되지 않았다. 바늘 찌름 미처리 피부 (도 2b)과 비교하여 H & E 분석 표피 orthokeratosis 최소한의 피부 침투를 매우 낮은 수준의 유도. 표피 두께 (도 2C) 및 Ki67 + 세포 수 (도 2d)는 그 침 바늘이 꽂힌 피부 표피에 띄는 조직 파쇄 또는 세포 증식을 일으키지 않았다 보여주는 바늘이 꽂힌 미처리 피부와 비슷 하였다. 침과 CXCL 케모카인의 발현 유도의 감소 레벨을 샤프트 주사기 바늘에 비해 (직경 1.067 mm) 12-1 및 염증성 사이토 카인 IL-6 일 2 일 (5) (도 3a)에 지속적으로 감소. 마우스 피부에 acufected 유전자의 발현을 확인하기 위해, IL-15의 cDNA를 발현하는 플라스미드는 IL-15 결핍 C57BL / 6 (IL-15 KO) 마우스의 피부 acufected 하였다. acufected 플라스미드 DNA로부터 전사의 수준이 낮은 면도 한 피부에서 관찰되었지만, 침과 진동은 유전자 전사의 레벨 (도 3b)을 향상. IL-15 생산은 2 일에서 7 일 감지되고 (도 3c)까지 안정적으로 유지 하였다. 이러한 결과는 acufection 효과적으로 플라스미드 DNA를 불어 과다 각질 세포 활성화를 유발하지 않고 피부에 상기 인코딩 된 단백질의 발현을 허용하는지 보여준다.

    WT 생쥐 플라스미드 인코딩 IL-15ΔE7 acufected으로 하였다. 마우스는 IL-15ΔE7의 mRNA 및 단백질 3까지 표현일 트랜 (도 4A) 후. 제어 WT 마우스에서 IMQ 처리 유도 된 빛 박편, IMQ 유도 빛 박편 IL-15ΔE7 감소 WT 마우스 (도 4b)를 acufected 이었는 마우스이어서 국소 일 3. IMQ 크림으로 치료 하였다. 흥미롭게도, IL-acufected 15ΔE7의 발현이 크게 unacufected WT 피부 (도 4c) (12)와 비교 IMQ 처리 된 피부에 Ly6G + 호중구 침윤을 억제 하였다. acufection함으로써 피부 IL-15ΔE7의 신규 기능을 선보였다. IL-15ΔE7은 호중구 침윤을 IMQ는 유도 변조한다.

    그림 1
    그림 1. 침술 바늘의 그림입니다. (A) 침술 바늘 (36 G × 0.5 ")는 (A)의 구성되어처리하고 바늘 끝. (B) 텐 침이 접착 테이프를 이용하여 다발로 묶여있다. 다발의 길이는 눈금자 (하부 패널)에 의해 측정 된 약 4cm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    그림 2. 침술 바늘로 찌르는 것은 눈에 띄는 피부 손상 또는 케 라티노 사이트 활성화가 발생하지 않습니다. (A) 트리플 사이트는 침 100 회를 찔려 된 마우스의 수염을 깎고 면도 한 측면 피부에 회색 사각형으로 표시. 사진은 피부 손상을 모니터링 할 수 따끔 따끔 후 7 일에 첫 번째 시간에까지 촬영했다. 백 보지와 바늘 찌름없이 면도 한 피부는 대조군으로 사용되었다. <미처리 또는 바늘이 꽂힌 마우스 피부 포르말린 고정 파라핀 피부 부의 강한> (B) H & E 분석. 스케일 바 : 100 μm의. (C) 치료 또는 바늘이 꽂힌 마우스 피부에서 H & E 염색 섹션 중 하나 밀리미터 세그먼트 표피 두께 (최 외층에 기부까지의 거리)를 측정하기 위해 선택되었다. 각 막대는 3 부 피부로부터 측정 표피 두께의 평균을 나타낸다. 오류 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 그룹 간 차이의 중요성은 쌍을 이루지 학생의 t 시험으로 확인 시험을 실시하고 있습니다. 같은 샘플의 (D)는 직렬 섹션에 대한 면역 조직 화학 분석을 방지 Ki67 염색 하였다. 각 막대는 1mm 당 세그먼트 길이마다 150 μm의 표피에 국소 Ki67 + 세포의 평균을 나타낸다. 오류 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 그룹 간 차이의 중요성은 양방향 ANOVA의 FOLL에 의해 테스트되었습니다페로 니의 포스트 특별 시험으로 빚. (NS : 중요하지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    그림 3. Acufection 효과적으로 눈에 띄는 케 라티노 사이트 활성화를 유발하지 않고 관심의 단백질을 표현합니다. (A) (19 G) 주사기 바늘 (시르.) 1.067 mm 직경으로 연마 또는 침 100 번 샤프트 면도하고 피부를 면도 한 측면은 (NTC)를 방치 하였다 (ACU.). 2 일째와 5 일째에 CXCL-1 및 IL-6의 전사 수준을 측정 하였다 QRT-PCR (N = 3). (B) 면도 IL-15 결핍 마우스의 피부를 면도 국소 IL-15 발현 플라스미드 DNA의 방울 도포 without (탈모) 또는 침술 바늘 찌름 (탈모 + 찌름)와. 둘째 날에 각 그룹에서 IL-15의 전사는의 TaqMan QRT-PCR에 의해 측정 하였다. IL-15의 전사는 IL-15 결핍 마우스의 PBS 제어 (NTC)에서 탐지되었다. (C) 또는 미처리이었다 IL-15 결핍 마우스 피부에서 IL-15 생산 (매일 한 티슈) IL-15 ELISA에 의해 측정 된 여러 날 동안 IL-15-acufected. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    그림 4. IL-15ΔE7 실증 IMQ 유도 빛 비정상적 피부 감쇠 호중구 침윤을 억제한다. (A)의 전사 수준의 단백질 생산은 IL-15ΔE7-acufected (WT / PIL-156; E7) 또는 빈 벡터 제어 (WT / pEmpty) 피부 각각 QRT-PCR 및 ELISA (N = 2, 각 시점)에 의해 측정 하였다. (B)는 3 일째에서 빈 벡터 - 또는 IL-15ΔE7-acufected 플랭크 피부 국소 IMQ 크림 하였다 (60 mg)으로 처리 하였다. IMQ 처리 후 6 일째에 WT / pEmpty 및 WT / PIL-15ΔE7 마우스 측면의 사진. (C) 3 일 6 IMQ 처리 후의 WT / 또는 WT pEmpty / PIL-15ΔE7 마우스에서 피부 절편 항 Ly6G 항체로 염색 열거 하였다. 각 막대는 4 IMQ - 처리 된 마우스에서 Ly6G + 세포의 평균을 나타낸다. 오류 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 그룹 간 차이의 중요성은 ANOVA는 페로 니의 포스트 특별 시험 다음에 양방향으로 확인 시험을 실시하고 있습니다. 패널 A와 C는 조사 피부과, 라이센스 번호 3901890227597.의 저널의 허가 수정 을 클릭하십시오여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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    Discussion

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    acufected 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 가장 중요한 단계는 균일 진동과 피부의 각질층을 느슨하게한다. 피부를 절단하지 않고 부드럽게 바늘을 누르는 동안, 힘이 표면을 누르기 힘든 충분해야한다. 1cm X 1cm의 면적에 10 μL의 용액에서 DNA의 흡수를 용이하게하기 위해, 바늘은 30 초에 100 회 상하 진동을한다. 하나는 피부를 찌를 필요가 힘을 결정하고 acufected 유전자의 최고 발현 수준을 산출하기 위해 필요한 횟수를 주목하여 할 수 있습니다.

    플라스미드 DNA의 양에 대한 수정은 상이한 유전자에 따라 달라질 수 있기 때문에 acufection가 필요함 후 발현의 만족스러운 수준에 도달하기 위해 적용 하였다. 적정 실험은 플라스미드 DNA의 최적 량은 물론, 실험 전에 적용되도록 결정하도록 수행되어야한다. 정량적 RT-PCR 분석의 결과는 O를 결정하는 데 도움이 될 것입니다플라스미드 DNA의 양 ptimal하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 가장 좋은 조건.

    acufection 과정의 정확한 메커니즘은 명확히 남아있다. 국소 전달 플라스미드 DNA의 전사는 형질 전환 효율 (도 3b) 강화 침으로 샤프트, 로우 레벨을 면도하고 피부를 면도에서 일어났다. 문신 총 11 배수 구멍이 acufection 배달 된 플라스미드 DNA 가능성 라티노 사이트 및 모낭 (19), (20)의 세포막을 통해 촉진 크레이프 된 microseeding 프로토콜 유추. 제모, 제모 시약 바늘 진동에 의해 표피의 자극은 어느 정도 각질 세포 활성화를 유도하고 상기 랑게르한스 및 수지상 세포 (6)에 의해 DNA 흡수를 향상시킬 수있다. 이 프로토콜의 제한은 플라스미드 DNA의 양을 흡수한다는 것이다세포에 의해 정확하게 제어 될 수 없다. 우리는 큰 피부 영역을 치료하기 위해이 방법을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 실험 사이의 전달 유전자의 발현 수준의 변화를 최소화하기 위해, DNA 용액의 용적 및 대상 피부면의 크기는 실험의 동일한 집합에 대해 고정한다. 재현 가능한 결과를 생성하기 위해서는 복제 실험은 동일한 개인에 의해 수행되도록 것이 좋습니다.

    유전자 총 microseeding 장치와 관련하여, 침 다발의 사용 벗은 DNA가 저렴 제공한다. 절차는 간단합니다. 그것은 acufection 프로토콜을 따르는 약간의 기술적 인 경험이 필요합니다. Acufection 동물에 최소한의 외상을 유발하고 더 체중 감소는 수술 후 발견되지 않는다. acufection 동작 후의 중요한 행동 변화의 유무에 의해 판단 통증의 수준은 낮다.

    요약하면, 침술 바늘을 사용하면을 풉니 다숙주 세포에 의한 DNA 흡수를위한 피부의 각질층은 마우스 피부의 단백질을 발현 할 수있는 경제적 인 대안 방법을 제공한다. 면역 관련 유전자의 광범위한 기능적 아직 피부 (21)에있어서 수 있고, 이는 피부의 신규 유전자의 빠른 연구의 필요성을 강조한다. 이 방법을 채용 한 용이 관심의 유전자 생성물의 어떤 신규 한 기능을 구비하고 있는지의 여부를 판정 할 수있다. 이 acufection 프로토콜은 피부 질환을 치료하는 면역 반응을 조절에서 새로운 발견을위한 편리하고 가능한 도구를 제공합니다.

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    Disclosures

    저자는 공개 재정적 이해에는이 없습니다.

    Acknowledgments

    이 작품은 과학 기술부에서 부여에 의해 지원되었다 (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). 우리는 박사 감사합니다. 원고를 읽기위한 베티 우 셰 행정 원장과 하와이 대학에서 스탠포드 대학 박사 피터 호프만에서 NTU에 치엔 쿠오 리, 리 저보니, 농업 생명 공학의 기술 지원 NTU에서 윤 치엔 박사 웬 - 치 웨이 기술 자문에 대한 중앙 연구원에서 연구 센터.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

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    References

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    &quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발
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    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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