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Immunology and Infection

Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por "Acufection" y su aplicación a la investigación de la piel

doi: 10.3791/55206 Published: April 19, 2017

Summary

Este protocolo es una alternativa rentable para expresar ADN plasmídico desnudo en la piel del ratón. El objetivo general del protocolo es para suministrar genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel para delinear el papel funcional de un gen específico en la inflamación cutánea.

Abstract

La desregulación de la respuesta inmune en la piel se asocia con numerosos trastornos de la piel humanos. La transferencia directa de genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel es un enfoque fascinante para investigar la modulación inmune de la inflamación cutánea en modelos de ratón de enfermedades humanas. Aquí se presenta un protocolo rentable que entregó ADN desnudo en la piel del ratón y conduce a la expresión del transgen. El método se acuñó "acufection", que denota acu ADN punción mediada fection trans. Para realizar acufection, la piel del ratón se infundió primero con el ADN en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se pincha ligeramente con un manojo de agujas de acupuntura para facilitar la absorción de ADN y transfección en células. El ADN plásmido se presumiblemente tomado por el queratinocito y las células dendríticas (DC) en la piel y se expresó en una proteína. Pinchazo mecánico con la agujas per se no causa daños en la piel o inducir la activación de los queratinocitos. La expresionde los genes transfectados se detectó en la piel, tanto a nivel de transcripción y traducción siguientes acufection durante 2 días y se mantuvo hasta 7 días. El objetivo principal para el desarrollo de este método acufection fue investigar una isoforma antes delimitada IL-15. Usando este método, un corte y empalme alternativo de IL-15 isoforma con parcialmente suprimido el exón 7 (IL-15ΔE7) se expresó en la piel y, posteriormente, tratado con un receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para inducir la inflamación. Acufection-entregado IL-15ΔE7 en la piel suprime la proliferación de queratinocitos, espesor de la epidermis y el reclutamiento de neutrófilos en la inflamación cutánea inducida por IMQ. Con el aumento de interés en la identificación de los mecanismos de regulación de la inflamación cutánea, el protocolo descrito aquí proporciona una alternativa eficaz y versátil costo para el sistema de pistola de genes o microsiembra para la entrega de ADN in vivo. Puede que potencialmente permitir el descubrimiento de la función de una novelagen en la piel o para la investigación de nuevos tratamientos para las enfermedades cutáneas.

Introduction

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La piel es la primera línea de defensa del huésped. Los queratinocitos (KCS) son el principal tipo de células en la piel de los seres humanos y ratones. En respuesta a estímulos ambientales (por ejemplo la luz solar, oxígeno, productos químicos y la invasión patógena), KCS se activan y producen una amplia gama de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas tales como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α y GM-CSF 1. Juntos desencadenan el reclutamiento de células inmunes en la piel. Inflamación cutánea agravado a menudo se asocia con numerosas enfermedades humanas, incluyendo la dermatitis de contacto ectópico aguda y la inflamación mediada por células T crónico (por ejemplo, dermatitis de contacto alérgica y psoriasis) 2. Modulación de las respuestas proinflamatorias en la piel inhibiendo la activación KC es un enfoque plausibles para tratar la inflamación cutánea. Este protocolo describe un nuevo enfoque para expresar transitoriamente un gen de citoquina en la epidermis con el fin de estudiar res inmunesPonse como consecuencia de un tratamiento de este tipo en la piel.

La epidermis se compone la capa más superficial de la piel. Sirve como una barrera física de mantenimiento de sustancias externas tales como ácidos nucleicos y patógenos entren en las capas más profundas de la piel. Varias técnicas libres de agujas han sido establecidos para la transferencia de ADN epidérmico 3, 4. ADN en solución o asociado con liposomas catiónicos o los vectores de adenovirus se ha aplicado directamente a la epidermis modificados con técnicas tales como la eliminación de la capa córnea o el tratamiento con depilación reactivo. La eliminación del epitelio cornified facilita ADN de cruzar la barrera epidérmica y la interacción con los queratinocitos y células de Langerhans para inducir respuestas inmunes 5. Mientras que una gran área de superficie está disponible para la transferencia de ADN y este enfoque no implica agujas, hay desventajas, incluyendo el requisitopara las grandes cantidades de ADN (10 - 100 mg), el tratamiento dura en la piel mediante separación por arrastre, y los resultados inconsistentes en la inducción de respuesta inmune en los animales inmunizados sin refuerzo suministro de ADN 6. La administración intracelular de micropartículas mediada de ADN desnudo para la piel se ha demostrado ser altamente eficiente y reproducible para la inducción de respuesta inmune 7, 8. Una pistola de genes de mano se ha utilizado para bombardear el sitio diana de la piel con el plásmido partículas de oro recubiertas de ADN 2 micras de diámetro de tamaño por medio de flujo de aire de helio presurizado 9. El ADN plásmido se presumiblemente captado por las células dendríticas (DCs) KCsand en la piel y la proteína se expresa de forma local o siendo transportado a ganglios linfáticos de drenaje por DCs 10. Aunque el sistema de pistola de genes es simple y requiere experiencia técnica limitada, el costo para la preparación y la entrega de los "bul de ADNdejar "(es decir, polvos de oro, gas helio) y para la pistola de genes se ha limitado su aplicación general. Además, el requisito de un sistema de suministro de gas helio limita la facilidad de transporte pistola de genes cuando los experimentos se llevan a cabo en diferentes lugares. microsiembra se ha demostrado que se obtiene una mayor eficiencia de la transferencia de genes de una sola inyección y el bombardeo de partículas 11. microsiembra utiliza una pistola de tatuaje para administrar ADN a la piel sin el uso de perlas de partículas 11. oscilante las microagujas en la piel usando este enfoque es probable que raspar directamente la membrana celular y por lo tanto la transferencia de ADN a múltiples células al mismo tiempo. Sin embargo, el dolor asociado con el gran número de inyecciones con agujas de 0,254 mm de diámetro es una desventaja.

Aquí proporcionamos un enfoque alternativo para la entrega de ADN in vivo. El "acufection" 12. Mientras acufection demuestra ser una dema fácil y menosmétodo Nding para la entrega de ADN in vivo, la cantidad óptima de ADN de diferentes genes y los tiempos para pinchar la piel tiene que ser optimizado cuidadosamente para obtener resultados reproducibles.

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Protocol

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Los ratones hembra de 8 - 12 semanas de edad se utilizaron para este estudio. C57 / BL6 de tipo salvaje (WT) y la IL-15 deficientes (IL15 - / -) ratones fueron adquiridos de Laboratorio Nacional Centro de Animales (NLAC), Taiwán y Taconic Farm, respectivamente. IL-15-deficiente (IL15 - / -) y IL-15-dominante (IL15 e IL15 +/- + / +) mostró una proporción de 1: 3 en la segunda generación de la cruz de heterocigotos IL15 +/-. El genotipo de IL-15 - / - ratones se confirmó por análisis PCR. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Laboratorio Animal Center (ALC), Universidad Nacional de Taiwán (NTU) Facultad de Medicina. Todos los procedimientos con animales, incluyendo los materiales y métodos anestésicos se realizaron de acuerdo con el protocolo de animales aprobado por el Taiwan National College de la Universidad de Medicina y la Facultad de Salud Pública Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) (Declaración jurada de la aprobación del Protocolo de animales 20130225).

<p class = "jove_title"> 1. Preparación de agujas de acupuntura

NOTA: Las agujas de acupuntura son dispositivos médicos compuestos de un mango y un extremo de la aguja (Figura 1A). Los diámetros de la aguja de acupuntura variaron de 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Seleccionamos el mejor punto de la aguja para evitar posibles daños en las células excesiva durante pinchar la piel. Hay 4 longitudes diferentes de la aguja 0.2 mm incluyendo 13 mm (0,5 in), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 in) y 50 mm (2,0 pulgadas) de longitud. Un haz de 10 agujas con una longitud de 13 mm proporcionó el agarre mejor cómodo durante oscilar la aguja en C57BL / 6 de piel de ratón. Los parámetros pueden ser modificados si se aplica el método a la piel de los animales más grandes o lleva a cabo por investigadores con manos más grandes.

  1. Retire las agujas de acupuntura del envase estéril, no pirogénico. Colocar las agujas en un campo estéril.
  2. Use cinta etiquetado adhesivo para unir 10 agujas juntos ihaz na (Figura 1B).
    NOTA: Los 10 agujas están dispuestas geométricamente para formar una forma de cilindro. Por conveniencia, utilizar un trozo de película de parafina para estabilizar la disposición antes de aplicar la cinta adhesiva. Asegúrese de que todos los puntos de la aguja están en el mismo plano. El uso de un paquete en vez de una sola aguja facilita infusión máxima de ADN mediante el aumento del área de contacto entre las agujas y la piel.

2. Preparación de una cantidad grande y libre de endotoxina de ADN plásmido

  1. Transformar células bacterianas químicamente competentes con el ADN plásmido.
  2. Seleccionar y inocular una sola colonia bacteriana en 3 ml de LB antibióticos que contienen medio y se incuba a 37 ° C en un agitador durante la noche.
  3. Escala de la cultura diluyendo el cultivo bacteriano en 1: 100 en 250 ml de medio LB con antibióticos y agitación durante la noche a 37 ° C.
  4. Preparar una gran cantidad de ADN mediante el uso de un alto quality, kit de preparación de plásmido libre de endotoxinas siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: protocolo Acufection requiere alta pureza y una gran cantidad de ADN de plásmido. El uso de una alta calidad, se recomienda libre de endotoxinas y ADN de plásmido se purificó en columna.
  5. Eluir el ADN en agua estéril. ADN tienda en pequeñas alícuotas a -20 ° C hasta el momento de acufection.
    NOTA: Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación del ADN para asegurar la expresión de ADN plasmídico consistente.
  6. Diluir ADN plasmídico a 1 mg / ml en PBS estéril para acufection.

3. Procedimiento para Acufection

NOTA: La cantidad óptima de ADN y el área de la superficie de la piel diana puede variar para los diferentes genes y necesitan ser optimizado aún más. La fuerza de pinchado y el número de veces, para soltar la capa córnea de la piel también puede variar en función del espesor de la piel. Estas condiciones deben determinarse cuidadosamente después de evaluar el nivel de expresión de gene transcri acufectedpts mediante qRT-PCR.

  1. Pesar los ratones y administrar tribromoetanol (400 g por g de peso corporal) por inyección peritoneal.
    NOTA: 2,2,2-tribromoetanol es un agente anestésico inyectable que se utiliza comúnmente en ratones. Las soluciones se prepararon disolviendo una calidad no farmacéutica 2,2,2-tribromoetanol (2,5 g) en agua destilada (200 ml) que contenía 2,5% de 2-metil-2-butanol.
  2. Utilice veterinario pomada oftalmológica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
    NOTA: efecto anestésico puede ser inducida en 1 - 2 min. Compruebe el pellizco reflejo del dedo del pie para asegurar la suficiente profundidad de la anestesia antes de la operación.
  3. Shave la piel flanco dorsal y aplicar crema depilatoria para disolver proteínas de la queratina en el cabello.
    NOTA: El uso de crema depilatoria para eliminar el vello facilitará infusión de ADN en la piel.
  4. El uso del agua empapada bolas de algodón para limpiar la crema depilatoria.
    NOTA: La crema depilatoria es soluble en agua. La eliminación completa de la crema de Will prevenir una superficie grasienta y asegurar un mejor resultado pinchazo.
  5. Use un hisopo de algodón estéril empapado en etanol al 70% para desinfectar la superficie de la piel.
  6. Delimitar la zona de objetivo (1 cm x 1 cm) en la piel depilada con una plantilla previamente medida. NOTA: Al marcar el sitio de destino le ayudará a aplicar el lote de aguja hacia arriba y hacia abajo dentro de un área definida. Esto es importante para asegurar la entrega de la misma cantidad de ADN a un área de superficie específica para minimizar la variación-experimento a experimento.
  7. Coloque una gota 10 l de ADN plásmido (10 mg) sobre la piel marcada.
    NOTA: La cantidad de ADN para acufection varía con los diferentes genes y el tipo de vector de expresión. La cantidad de ADN utilizado debe ser cuidadosamente valoró antes de realizar el experimento de interés. El 10 l es una pequeña gota de líquido y se sienta bien en la piel afeitada y depiladas sin rodar hacia abajo mientras pinchazo. Incluyen un grupo de control de ratones tratados con 10! L de ADN vector vacío para comparar con los ratones unacufected con el gen de estudio.
  8. Mantenga el haz aguja de acupuntura (Figura 1B) y pinchar la superficie marcada con un movimiento hacia arriba y hacia abajo para 100 veces o hasta que la humedad de ADN en PBS en desaparece la piel. NOTA: se puede producir un enrojecimiento de la superficie de la piel. Evitar hacer cortes profundos que sangran. El número de arriba y abajo pinchando movimientos en la superficie de la piel se determina de manera operativa cuando la humedad a partir de ADN en PBS (10 l) desaparece en la piel. Decidimos 100 veces en 30 s, ya que ha dado los resultados más consistentes de los genes acufection-entregado. Si procede, las agujas pueden ser reutilizados para hasta 6 pinchazos en la piel de destino (1 cm x 1 cm cada uno). Enjuagar las agujas en 70% de etanol y PBS entre acufection. Cambiar a nuevas agujas cuando están sordo o para diferentes ADN de plásmido para evitar la contaminación cruzada.
  9. Coloque ratones acufected sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo hasta que despierta.
  10. Devolver los ratones a sus jaulas cuando tienenrecuperado el conocimiento suficiente. NOTA: Mantenga ratones acufected en jaula separada (menos de 5 animales por jaula) de la jaula de los ratones un-acufected.
  11. Ponga la botella de agua en su lugar y volver a la jaula de la vena cava inferior (jaulas ventiladas por separado) bastidor.

4. Cuidado post-operatorio

  1. Durante las primeras 48 h después del procedimiento, supervisar de cerca ratones para cualquier incomodidad incluyendo cambios de comportamiento (inquietud, agitación o trastorno de la alimentación) o apariencia anormal (pelo áspero o postura encorvada).

5. Imiquimod (IMQ) Tratamiento de la Piel acufected-IL-15ΔE7

NOTA: la expresión transcripcional y la producción de proteínas de gen acufected son detectables en el día 3. Los ratones acufected con el plásmido de interés se puede tratar con diferentes tipos de estimulantes 3 días después de la transfección. Se ilustra aquí mediante el tratamiento de la piel acufected-IL-15ΔE7 ratón con crema de IMQ. IMQ es una f imidazoquinolin amina aprobadoo el tratamiento de verrugas genitales externas y perinatales 13. Tratamiento IMQ tópica se muestra para inducir trastornos de la piel con psoriasis-como humanos en ratones con la manifestación de la piel escamosa, proliferación epidérmica y la infiltración 12, 14, 15 de neutrófilos dérmica.

NOTA: El vector de plásmido contenía ratón de longitud completa de IL-15 cDNA, bajo la regulación del factor-1 de alargamiento α (PEF), flanqueado con un péptido señal de IL-2 y una etiqueta FLAG en el extremo C-terminal (pEF-IL- 15, 5859 pares de bases), que fue construido como se describe por Bamford et al. 16. El plásmido se usa como una plantilla de IL-15 para eliminar los primeros 16 aminoácidos en los residuos 33 - 48 en el exón 7 del gen de IL-15 por IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 pares de bases) por SOE (síntesis por extensión de solapamiento) método de PCR 17. Las colonias de bacterias que estaban con éxitotransformada con IL-15ΔE7 fueron verificadas mediante digestión con enzimas de restricción y seguida de la secuenciación de ADN 12, 18. Una gran cantidad de ADN de plásmido libre de endotoxinas se preparó como se describe en el paso 2 protocolo.

  1. Anestesie ratones acufected por inyección intraperitoneal de tribromoetanol (400 g por g de peso corporal) y aplicar veterinario pomada oftalmológica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. Compruebe el pellizco reflejo del dedo del pie para asegurar suficiente profundidad de la anestesia antes del comienzo de los procedimientos operativos. NOTA: Como una piel de 2 cm x 2 cm será tratada para IMQ, 2 dosis de ADN de plásmido pil-15ΔE7 (10 g en 10 l de PBS por dosis) se acufected en 2 sitios diana (1 cm x 1 cm cada uno).
  2. Marcos flanquean la piel (2 cm x 2 cm) que cubre el área acufected.
  3. Utilice aplicador Q-tip para aplicar tópicamente crema de IMQ en la superficie marcada. Nota: el paso 5.1 se realiza sólo para la primera dosis (60 mg / dosis).Las siguientes dosis consecutivas se aplican a los ratones no anestesiados.
  4. Documentar los cambios de piel dorsal tratada con IMQ al día con una videocámara de alta definición. Nota: Una persona sostiene el ratón mientras que otro está grabando. Las imágenes fijas se graban y editan en un momento posterior.
  5. La eutanasia a los ratones mediante la inyección de una sobredosis de tribromoetanol (800 g por g de peso corporal), seguido por dislocación cervical en el día 4 o el día 7 después del tratamiento IMQ. La piel se cortó y se procesa (pasos 4.1 a 4.5).

6. homogeneizado de ratón Piel

  1. Use un par de tijeras quirúrgicas para hacer un corte horizontal desde la base de la cola. Bilateralmente proceder a la base de la extremidad posterior y continuar a cortar verticalmente a lo largo del flanco a la base de la extremidad anterior.
  2. Con cuidado, pelar la piel del tejido subyacente de posterior a la anterior. Use las tijeras para cortar la piel dorsal. Coloque la piel en una placa de Petri estéril.
  3. Utilizar un bisturí para extirpar objetivopiel y congelarlo en nitrógeno líquido inmediatamente. Nota: El mismo tamaño de la piel acufected sin (1 cm x 1 cm) o con tratamiento IMQ (2 cm x 2 cm) se fija para cada ratón para minimizar las variaciones-experimento a experimento.
  4. Coloque el tejido de la piel congelada en el centro de un pre-refrigerada mortero 2-compartimiento con asas y una mano de mortero. Use un martillo de plomo en el mortero para pulverizar el tejido.
  5. colocar rápidamente el tejido pulverizado a un nuevo tubo que contiene 500 l de reactivo de lisis celular para la extracción de ARN o a un tubo que contiene 50 l de PBS y 1x cóctel inhibidor de proteasa para obtener el lisado de proteínas.

7. H & E y tinción inmunohistoquímica de la Sección de la piel

  1. Coloque el tejido de la piel en un casete y sumergirlo en paraformaldehído al 4% durante la noche.
  2. Insertar y sección de tejido, que en nuestro caso se llevó a cabo por el Laboratorio de Patología de la LAC, NTU. Nota: La sección se corta a un espesor de 5 micras. la sección de entre el tejido Placecomplementos en portaobjetos cargados positivamente.
  3. Calentar los portaobjetos a 65 ° C durante 15 min.
  4. Colocar los portaobjetos en una gradilla de tinción. Sumergir el estante en el tanque correspondiente que contiene sustituto xileno durante 5 min dos veces seguido de inmersión secuencial en 100%, 95%, 80%, 75%, 60% y 50% de etanol (5 min cada uno) para la rehidratación. Sumergir los portaobjetos en agua del grifo durante 3 min antes de la tinción.
  5. Realizar hematoxilina y eosina. Nota: H & E tinción se realizó a petición del Laboratorio de Patología de la LAC, NTU.
  6. Para tinción inmunohistoquímica, bloquear la sección con solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 5 min para reducir la tinción de fondo no específica. Nota: La solución de bloqueo se desarrolla comercialmente con las técnicas de inmunotinción. No suero animal está contenido en este producto.
  7. Sumergir el portaobjetos en PBS para enjuagar la solución de bloqueo.
  8. Se diluye la solución de bloqueo en PBS a 01:10 y añadir 2% de suero bovino fetal (FBS) (solución diluyente).
  9. Tinción de una sección en serie en la misma ejecución con la misma solución omitiendo el anticuerpo primario para controlar la unión no específica del anticuerpo secundario.
  • Lavar los portaobjetos tres veces en TBS más 0,1% de Tween-20 (solución TBST) durante 5 min cada uno. Cambie la solución entre los mismos.
  • Pipetear una gota de polímeros marcados para cada sección y se incuba a temperatura ambiente durante 40 min. Nota: El polímero marcado se prepara comercialmente mediante la combinación de polímeros de aminoácidos con peroxidasa y anticuerpo secundario que se reduce a un fragmento Fab'. El reactivo está listo para usar paratinción inmunohistoquímica de secciones de tejido de ratón.
  • Lavar los portaobjetos tres veces en TBST durante 5 min cada uno. Cambie la solución entre los mismos.
  • Pipeta 3,3'-diaminobenzindine tetraclorhidrato solución (DAB) en sección de tejido y se deja reposar a temperatura ambiente hasta un precipitado de color marrón es visible bajo un microscopio de campo brillante. Nota: El tiempo para DAB a precipitar en presencia de peroxidasa es de alrededor de 30 min.
  • Sumergir los portaobjetos en agua para detener la actividad de peroxidasa. diapositivas de inmersión en solución de verde de metilo para la tinción nuclear. Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 min cada uno.
  • Colocar un cubreobjetos sobre la sección teñida que se cubre con medio de montaje permanente (8 l por sección).
  • 8. Fotografía y Análisis de Stained sección de tejido

    1. Visualizar las secciones de tejido teñidas con H & E y de IHC con un microscopio de campo claro. Capturar imágenes utilizando dispositivo de carga acoplada (CCD) adjunta al microscopio. Por qanálisis CUANTITATIVA, software de formación de imágenes se puede utilizar
      1. Análisis de todo los cortes teñidos usando un sondascopio con un objetivo 20X.
      2. Mida el espesor de la epidermis dentro de un segmento de 1 mm de la epidermis y contar el número de células Ki67 inmunorreactivas dentro del segmento.
        NOTA: Análisis cuantitativo se realizó mediante microscopía de automatización y software de análisis de imágenes. El grosor epidérmico se define por la distancia entre la capa basal y la capa más externa de la epidermis.
      3. Contar el número de células Ly6G inmunorreactivas en el área dérmica (230 x 270 m 2 rectángulo) inmediatamente debajo de la piel tópico IMQ-tratada.

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    Representative Results

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    Mientras que algunos enrojecimiento era evidente dentro de la primera hora después de pincharse con las agujas de acupuntura, la piel se aclaró en el día 2 y se observó ninguna reacción adversa de la piel hasta el día 7 después de pinchar (Figura 2A). Pinchazo de aguja indujo muy bajo nivel de ortoqueratosis epidérmica y dérmica mínima infiltración por H & E análisis en comparación con la piel no tratada (Figura 2B). El espesor de la epidermis (Figura 2C) y el número de células Ki67 + (Figura 2D) fueron comparables entre la piel pinchado con aguja y sin tratar, lo que demuestra que la piel pinchada-aguja de acupuntura no causó interrupción del tejido perceptible o la proliferación celular en la epidermis. En comparación con la aguja de la jeringa (1.067 mm de diámetro) 12, pinchazos con agujas de acupuntura niveles reducidos inducidos de las expresiones de CXCL quimiocinaCitoquinas -1 y proinflamatoria IL-6 en el día 2 que continuó disminuyendo en el día 5 (Figura 3A). Para validar la expresión del transgén acufected en la piel del ratón, un plásmido que expresa IL-15 cDNA se acufected en la piel de C57BL / 6 ratones IL-15-deficiente (IL-15 KO). Aunque se observaron bajos niveles de transcripción a partir del plásmido acufected ADN en la piel depilada, la oscilación con agujas de acupuntura mejora el nivel de la transcripción de genes (Figura 3B). IL-15 de producción fue detectado el día 2 y se mantuvo estable hasta el día 7 (Figura 3C). Estos resultados demuestran que acufection infunde eficazmente el plásmido de ADN y permite la expresión de la proteína codificada en la piel sin inducir la activación de queratinocitos excesiva.

    ratones WT fueron acufected con un plásmido que codifica IL-15ΔE7. Los ratones expresa IL-15ΔE7 ARNm y la proteína hasta 3días después de la transfección (Figura 4A). Los ratones fueron tratados tópicamente con crema IMQ en el día 3. Mientras que el tratamiento IMQ inducidas escamas plateadas en ratones WT de control, escamas plateadas inducidas por IMQ se redujeron en IL-15ΔE7 acufected ratones WT (Figura 4B). Curiosamente, la expresión de IL-acufected 15ΔE7 inhibió significativamente Ly6G + infiltración de neutrófilos en la piel IMQ-tratado en comparación con unacufected piel WT (Figura 4C) 12. Por acufection, hemos demostrado la nueva función de IL-15ΔE7 en la piel. IL-15ΔE7 modula IMQ inductor de la infiltración de neutrófilos.

    Figura 1
    Figura 1. Ilustración de agujas de acupuntura. (A) La aguja de acupuntura (36 G x 0,5" ) se compone de unamango y un extremo de la aguja. (B) Diez agujas de acupuntura están unidos en un paquete utilizando cintas adhesivas. La longitud del haz es de aproximadamente 4 cm, medida por la regla (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    La Figura 2. Pincharse con agujas de acupuntura no causa daño de la piel o de los queratinocitos notable activación. (A) los sitios triples marcados en cuadrados grises en la piel flanco afeitado y depiladas del ratón fue pinchado 100 veces cada uno por agujas de acupuntura. Las fotografías fueron tomadas en la primera hora y hasta 7 días después de pinchar para supervisar el daño de la piel. Afeitado y la piel depilada sin pinchazo de aguja se usó como el control. <strong> (B) Análisis de H & E de, secciones de piel embebidos en parafina fijados con formalina de piel de ratón sin tratar o pinchado con aguja. Barra de escala: 100 m. (C) Un milímetro-segmento de secciones H & E manchadas de piel de ratón sin tratar o-pinchado aguja fue seleccionado para medir el espesor de la epidermis (la distancia desde basal a la capa más externa). Cada barra representa la media del espesor epidérmico medida a partir de 3 secciones de piel. barra de error representa el error estándar de la media (SEM). La importancia de la diferencia entre los grupos fue probada por la prueba t de Student para datos independientes. (D) Las secciones seriadas de las mismas muestras se tiñeron con anti-Ki67 para el análisis inmunohistoquímico. Cada barra representa la media de las células Ki67 + localizadas en cada 150 m-epidermis de longitud por segmento de 1 mm. barra de error representa el error estándar de la media (SEM). La importancia de la diferencia entre los grupos fue probado por ANOVA de dos vías SSadeudado por la prueba post hoc de Bonferroni. (ns: no significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3. Acufection Expresa eficazmente la proteína de interés sin causar notable de queratinocitos activación. (A) afeitado y la piel depilada flanco se dejó sin tratar (NTC), abrasión con 1,067 mm de diámetro (19 G) de aguja de jeringuilla (Syr.) O pinchando 100 veces por agujas de acupuntura (ACU.). Los niveles de transcripción de CXCL-1 e IL-6 en el día 2 y el día 5 se midieron por QRT-PCR (n = 3). (B) afeitado y la piel depilada de ratón IL-15 deficientes se aplicó tópicamente con una gota de un ADN plásmido que expresa IL-15 without (depilación) o con pinchazo aguja de acupuntura (depilación + pinchazo). La transcripción de IL-15 en cada grupo en el día 2 se midió por TaqMan qRT-PCR. La transcripción de IL-15 era indetectable en el control de PBS (NTC) de los ratones IL-15-deficientes. (C) IL-15 de producción de la piel del ratón IL-15-deficiente que no fue tratada o IL-15-acufected para varios días (un tejido para cada día) se midieron por la IL-15 ELISA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    La Figura 4. Demostración de IL-15ΔE7 Atenúa la piel plateado Flaky inducida por IMQ y Inhibe neutrófilos infiltración. (A) El nivel de producción de proteínas y de la transcripción de IL-15ΔE7 acufected-(WT / pil-15 [6; E7) o la piel vacío vector-control (WT / pEmpty) se midieron por qRT-PCR y ELISA (n = 2, cada punto de tiempo), respectivamente. (B) vector del vacío o de la piel flanco acufected-IL-15ΔE7 en el día 3 se trató por vía tópica con crema IMQ (60 mg). Las fotografías de WT / pEmpty y WT / pil-15ΔE7 flanco del ratón en el día 6 después del tratamiento IMQ. (C) secciones de piel de WT / pEmpty o ratones WT / pil-15ΔE7 después del tratamiento IMQ en los días 3 y 6 se tiñeron con anticuerpo anti-Ly6G y se enumeran. Cada barra representa la media de las células Ly6G + de 4 ratones IMQ-tratada. barra de error representa el error estándar de la media (SEM). La importancia de la diferencia entre los grupos fue probado por ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni. Los paneles A y C son modificados con el permiso de la revista Journal of Investigative Dermatology, número de licencia 3901890227597. Por favor, haga clicaquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

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    El paso más crítico para asegurar la expresión del ADN plásmido acufected es a oscilar y aflojar la capa córnea de la piel de manera uniforme. Mientras empuja las agujas suavemente sin cortar la piel, la fuerza debe ser lo suficientemente duro para deprimir la superficie. Para facilitar la absorción de ADN en 10 solución! L en un 1 cm x 1 cm área de la superficie, las agujas deben oscilar hacia arriba y hacia abajo por cerca de 100 veces en 30 s. Se puede determinar la fuerza que necesita para pinchar la piel y anotando el número de veces que se necesita para obtener el mejor nivel de expresión del gen acufected.

    Modificación de la cantidad de plásmido de ADN aplicado a alcanzar un nivel satisfactorio de expresión después de acufection puede ser necesaria, ya que puede variar para los diferentes genes. experimentos de titulación deben realizarse para determinar la cantidad óptima de ADN de plásmido a ser aplicado antes del experimento también. Los resultados de los análisis de RT-PCR cuantitativa ayudarán a determinar la ocantidad ptimal de ADN de plásmido y la mejor condición para obtener resultados reproducibles.

    El mecanismo exacto del proceso acufection queda por aclarar. Mientras que la transcripción a partir de ADN de plásmido por vía tópica entregado ocurrió en piel afeitada y depiladas en el nivel bajo, pinchazos por agujas de acupuntura mejoradas eficiencia de la transfección (Figura 3B). Por analogía de protocolo microsiembra en el que múltiples perforaciones de la pistola de tatuaje 11, ADN de plásmido acufection-entregado es probable facilitadas a través de la raspadura de la membrana celular de los queratinocitos y folículos pilosos 19, 20. Las estimulaciones de la epidermis por la eliminación del vello, el reactivo de depilación y la oscilación de la aguja pueden inducir la activación de queratinocitos en cierta medida y mejorar aún más la absorción de ADN por Langerhans y DCs 6. Una limitación de este protocolo es que la cantidad de ADN plásmido recogiópor las células no puede ser controlada con precisión. No sugerimos usar este método para tratar una amplia zona de la piel. Para minimizar las variaciones en los niveles de expresión del gen suministrado entre los experimentos, el volumen de la solución de ADN y el tamaño de la superficie de la piel diana deben ser fijados para el mismo conjunto de experimentos. Para generar resultados reproducibles, es aconsejable que replicar los experimentos se han de realizar por el mismo individuo.

    Con respecto al dispositivo de pistola génica y microsiembra, el uso de un haz de agujas de acupuntura para entregar ADN desnudo es barato. Los procedimientos también son sencillos. Se requiere muy poca experiencia técnica para seguir el protocolo acufection. Acufection provoca un traumatismo mínimo a los animales y sin pérdida de peso se encuentra después de la operación. El nivel de dolor es baja como se juzga por la ausencia de un cambio de comportamiento significativo después de la operación acufection.

    En resumen, el uso de agujas de acupuntura para aflojar elcapa córnea de la piel para la captación de ADN por las células huésped proporciona un método alternativo económico para expresar una proteína en la piel del ratón. Un amplio espectro de genes relacionados con la inmunidad aún no se han caracterizado funcionalmente en la piel 21, y esto pone de relieve la necesidad de un estudio rápido de un nuevo gen en la piel. Empleando este método, se puede determinar fácilmente si el producto del gen de interés tiene cualquier función novela. Este protocolo acufection proporciona una herramienta conveniente y factible para nuevos descubrimientos en la modulación de la respuesta inmune para curar la enfermedad cutánea.

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    Disclosures

    Los autores no tienen intereses económico alguno.

    Acknowledgments

    Este trabajo fue apoyado por la subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos a los Dres. Betty Wu-Hsieh y Chien-Kuo Lee en NTU, Leigh Zerboni la Universidad de Stanford y el Dr. Peter Hoffmann en la Universidad de Hawai por leer el manuscrito, Yun Chien en la NTU para la asistencia técnica, y el Dr. Wen-Chi Wei en Agricultura Biotecnología Centro de Investigación de la Academia Sinica de asesoramiento técnico.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
    NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
    Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
    Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
    2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
    DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
    Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
    Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
    anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
    Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
    DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
    Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
    Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
    Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
    Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
    Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
    Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
    ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
    Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
    Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy

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    References

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    Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por &quot;Acufection&quot; y su aplicación a la investigación de la piel
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    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).More

    Lin, Y. J., Lee, T. L., Ku, C. C. Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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