Abstract
Lokalisierte intraductal Behandlungen für Brustkrebs bieten potentielle Vorteile, einschließlich effiziente Abgabe an den Tumor und reduzierte systemische Toxizität und Nebenwirkungen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Allerdings bleiben einige Herausforderungen bevor diese Behandlungen in größerem Umfang angewandt werden. Die Entwicklung und Validierung von intraductal Therapeutika in einem geeigneten Tiermodell erleichtern die Entwicklung von intraductal therapeutische Strategien für die Patienten. Während die Mausbrustdrüse ist weithin als ein Modellsystem von Brustentwicklung und Tumorgenese verwendet wurde, ist die Anatomie des menschlichen gland verschieden. Ein größeres Tiermodell, wie das Kaninchen, kann als ein besseres Modell für Brustdrüsenstruktur und intraductal therapeutische Entwicklung dienen. in contrast an Mäuse, in denen zehn duktalen Bäume entlang der Körperachse räumlich verteilt, die jeweils in einem separaten Zitzen, mehr das Kaninchen Brustdrüse ähnelt dem menschlichen Drüse, mit mehreren überlappenden duktalen Systeme, die Ausfahrt durch separate Öffnungen in einer Zitze. Hier stellen wir minimal-invasive Methoden zur Abgabe von Reagenzien direkt in das Kaninchenbrustkanal und zur Visualisierung der Lieferung selbst mit hochauflösenden Ultraschallbildgebung.
Introduction
Die intraductal Abgabe therapeutischer Mittel hat in Tiermodellen und in einem frühen Stadium der Human - Studien 3, 4, 5, 6, 11, 12 untersucht worden. Eine aktuelle Studie der Phase I , die Sicherheit und Machbarkeit von intraductal Carboplatin oder intraductal pegyliertes liposomales Doxorubicin bei Frauen zeigten Mastektomie für die Behandlung von invasiven Krebs wartet 2.
Vorangegangenen Protokolle für intraductal Lieferung wurden für Maus- und Ratten - Milchdrüsen 6, 7, 8, 9 entwickelt. Für Forschungszwecke intraductal Tumorzellinjektionen und den lentiviralen Vektor Lieferung von Onkogenen wurden auch in Tiermodellen durchgeführt wurdenref "> 13, 14, 15, 16. ein Ideal in - vivo - Modell des intraductal Lieferprozesses sollte die Entwicklung neuer Klassen von therapeutischen Verbindungen erlauben jedoch und präklinischen Beurteilung erleichtern. Anatomische Unterschiede zwischen Nagern und Menschen die Übersetzung davon sind kompliziert Studien.
Im Gegensatz zu Mäusen, in dem jeder Kanal an einem separaten Zitzen endet, besteht die menschliche Brust von 5 bis 9 unabhängige duktalen Systeme, die jeweils eine separate Öffnung an der Zitze endet. Kaninchen Brustdrüsen beherbergen vier unabhängige duktalen Systeme, die jeweils separat zugänglich durch eine von vier Öffnungen in einem einzigen Zitze. Ein Kaninchen-Modell passt genauer die menschliche Anatomie und ermöglicht die Untersuchung von intraductal Arzneimittelabgabe in einem relevanten Kontext.
Hier verwenden wir zwei Techniken intraductal Lieferung zu beurteilen. Die gleichzeitige Verabreichung von aVitalfarbstoff ermöglicht die Visualisierung durch die Haut und ermöglicht eine einfache und rasche Bestätigung des Verfahrens. Für einige Anwendungen mit höherer Auflösung Mapping der Kanäle bevorzugt werden. Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Ultraschall-Bildgebung der Kanäle durch die intraductal Lieferung eines nicht gezielten Kontrast Reagenz.
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Protocol
Verfahren unter Verwendung von Versuchstieren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Texas in Austin genehmigt.
1. Operationsvorbereitung
- Nehmen Sie das Körpergewicht eines jeden Kaninchens. Wie bei allen präklinischen Studien, Tiergewichte, überwacht regelmäßig die potenzielle Toxizität zu bewerten.
- Vor dem Kaninchen anesthetizing, füllen eine 50 ml konischen Röhrchen mit handelsüblichen Ultraschall-Gel und Spin bei 500 × g für 30 s; es sollte in dem Gel nach Beendigung der Zentrifugation keine sichtbaren Blasen sein.
- Verabreichen Glycopyrrolat subkutan in einer Dosis von 0,1 mg / kg Acepromazin und intramuskulär in einer Dosis von 0,75 mg / kg. Warten Sie 15-20 Minuten für die beruhigende Wirkung zu nehmen, während Vitalfunktionen und Verhalten zu überwachen.
HINWEIS: Glycopyrrolate ist ein anti-cholinergen Mittel, das Bradykardie und reduziert Atmungs- und GI Sekrete verhindert. Acepromazin ist ein Beruhigungsmittel, das als premedicati dientauf für die Anästhesie. - Administrieren 35 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin subkutan als Anästhetikum. Wenn jedoch der Bediener wird erfahrener und können die intraductal Lieferung schneller, verringern die Arzneimitteldosierungen bis 15 mg / kg Ketamin und 3 mg / kg Xylazin subkutan erreichen; dies wird die Anästhesiezeit und die Zeit für das Tier benötigt, um von der Anästhesie erholen verkürzen.
- Prüfen und dokumentieren die Herzfrequenz, SPO 2, Temperatur, Atemfrequenz und Schleimhautfarbe alle 15 min. Bewerben Auge Schmiermittel für beide Augen.
HINWEIS: Nur Personen, die eine entsprechende Ausbildung durchlaufen haben und durch ihre Institution IACUC sollte Anästhesie verabreichen oder überwachen genehmigt. Die Verwendung eines Tieranästhesiemonitor kann beim Erwerb von Vitalfunktionen unterstützen und wird empfohlen. Der Tierarzt Anästhesiemonitor jedoch ersetzt nicht die Notwendigkeit, manuell alle 15 Minuten, das Tier zu überprüfen. Siehe die Anweisungen des Herstellers foder die ordnungsgemäße Verwendung eines Tier Monitor. - Überprüfen Sie den Beginn der Anästhesie durch eine sanfte Zehe Prise; das Kaninchen sollten, bevor Sie fortfahren nicht reagieren.
- Die Schwanz Bauch des Kaninchens in der Gegend um den dritten und vierten Paare von Leisten- Zitzen Sorgfältig rasieren.
- Mit der Mehrheit der Haare entfernt werden, gelten ein Over-the-counter Enthaarungscreme auf die rasierte Fläche. Entfernen Sie die Creme 10 Minuten nach dem Auftragen mit feuchten Papiertüchern mit warmem Wasser benetzt.
HINWEIS: Kaninchenhaut ist sehr zerbrechlich / empfindlich. Die Haarentfernung Creme sollte nicht länger als 10 Minuten verwendet werden. In der Tat ist es sicherer, ein "Testpunkt" auf 5 Minuten, um zu versuchen und nur auf mehr verlassen, wenn Prüffleck einen längeren Zeitraum angibt, ist erforderlich. - Wischen Sie den Bereich mit Alkohol getränkten Gaze-Pads an der Injektionsstelle zu reinigen.
- Legen Sie das Kaninchen auf seinem Rücken in einer V-förmigen Trog mit einem umlaufenden Warmwasserdecke und einem absorbierenden Kissen ausgekleidet.
2. Preparation des Kontrastmittels
- Die Rekonstitution der nicht gezielten Kontrast Reagenz nach den Anweisungen des Herstellers. Pipette nach oben und unten sanft zu mischen.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendet Kontrastmittel ist bei Raumtemperatur stabil für 4 - 6 Stunden nach der Rekonstitution. Schütteln Sie das Fläschchen zwischen jedem Abruf.
HINWEIS: Das Volumen der Lösung injiziert werden benötigt wird von der Anzahl der Kanäle ab. Das Kaninchen hat 4 duktalen Öffnungen pro Zitze und 0,2 ml Lösung ausreicht, um ein duktalen Baum eines erwachsenen New Zealand White Rabbit (Oryctolaguscuniculus) zu füllen. Somit kann ein Gesamtvolumen von 0,8 mL einer Milchdrüse zugeführt werden.
3. Intraduktale Lieferung
- Suchen Sie die entsprechenden Zitzen injiziert werden; Die 3. und 4. Paare von Leisten Zitzen werden empfohlen, da sie leicht sichtbar gemacht werden , wenn das Tier auf seinem Rücken positioniert ist.
- Belastung 0,2 ml steriler 0,9% Kochsalzlösung inein 1 ml Luer-Lock-Tuberkulin-Spritze mit einer 22 G-Nadel. Entsorgen Sie den 22 G-Nadel, sobald die Salzlösung in der Spritze ist und ersetzen Sie es mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel. Wischen Sie den Bereich mit 85% Isopropylalkohol auf einem Gaze-Pad.
- Mit der Abschrägung der Nadel und der Spritze parallel zum Körper des Tieres, legen Sie die Abschrägung der Nadel in die Seite der Zitze und spritzen langsam 0,1-0,2 ml Kochsalzlösung; Dies wird für eine bessere Visualisierung der duktalen Öffnungen ermöglichen.
- Belastung 0,2 ml Injektionslösung in eine 1 ml Luer-Lock-Tuberkulinspritze.
- Halten Sie die Zitze sanft mit dem Daumen und Zeigefinger, und heben Sie es leicht für die intraductal Injektion zu positionieren; eine tragbare Augen Lupe kann in die Visualisierung der duktalen Öffnungen unterstützen.
- Während die angehobene Position der Zitze Aufrechterhaltung kanülieren sorgfältig den Kanal von Interesse, eine 25 G blunt-Spitze Nadel.
- Nach Kanülierung, drehen Sie vorsichtig den Luer-Lock-Spritze an der Nabe der stumpfen-tip Infusionsnadel, bis es einrastet.
- Heben Sie die Zitze und injizieren Sie die Lösung langsam möglichen Schäden durch sich schnell bewegende Flüssigkeit innerhalb des Kanals zu minimieren; zu keinem Zeitpunkt sollte es Widerstand sein, wenn die Lösung zu injizieren.
4. Ultraschall-Bildgebung
- Tragen Sie eine großzügige Menge von zentrifugierten Ultraschall-Gel auf die Haut des Gebietes von Interesse. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen im Gel sind, da diese die Bildqualität beeinträchtigt.
- Stellen Sie die Bildtiefe bis 6 mm. Legen Sie die 21-MHz-Sonde in Kontakt mit dem Gel und scannen den Bereich von Interesse in B-Modus. Beachten Sie das Kontrastmittel in dem abgetasteten Bereich einschließlich der duktalen Öffnung und im gesamten Kanal.
ANMERKUNG: Diese Einstellungen sind für die Verwendung mit einem bestimmten photoakustischen Ultraschallgerät entwickelt. Siehe die Tabelle der Materialien für weitere Details. Es kann notwendig sein, die Sendeleistung und Bildtiefe anderer Bildgebungssysteme anzupassen Brust zu optimierenDrüse Visualisierung. - Entfernen Sie die Ultraschall-Gel von der Haut des Tieres mit einem Gaze-Pad.
5. Nachsorge
- Beachten Sie die Injektionsstelle: es sollte keine Anzeichen von Trauma des Zitzen Region oder des umgebenden Gewebes sein, und die Zitze in den Bereich Schwellung umgebenden zeigt wahrscheinlich eine Brustfettpolster Injektions anstatt eine erfolgreiche intraductal Injektion.
- Legen Sie das Kaninchen in einer sternal Position. Bei Bedarf geben, 0,2 mg / kg Yohimbin intravenös Rand Ohrvene; Dies wird die Wirkung der Xylazin Rückwärts- und erlauben das Tier schneller von der Anästhesie zu erholen.
- Überwachen Sie die Kaninchen alle 15 min während des gesamten Erholungsphase, bis das Tier wach, ansprechbar und unterhält eine sternal Position.
Hinweis: Dieses Verfahren sollte in Gewebeschäden oder Schwellungen führen. Wenn Rötung oder Schwellung beobachtet werden, um eine Dosis von Meloxicam 0,1-0,2 mg / kg PO verwalten, sobald das Tier wachsam und in der Lage istnehmen oral Medikamente. Kontaktieren der Veterinärpersonal des Instituts für weitere Hinweise.
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Representative Results
Hier zeigen wir , dass die intraductal Abgabe von Kontrastreagenzien an die Milchgänge eines Kaninchens ohne Verletzung des Gewebes (Abbildung 2) erreicht werden. Bei Kaninchen, vier separate duktalen Systeme laufen an einer Zitze und somit zugegriffen werden kann und einzeln mit dieser Methode abgebildet. Einzelne duktalen Öffnungen sind leicht sichtbar gemacht; beachten Sie die Pfeilspitze eine zweite duktalen Öffnung neben dem kanülierten Kanal in 2B Markierung.
Hochauflösende Ultraschallbildgebung mit ungezielte Kontrast Reagenz in lineare Imaging-Modus kann eine Echtzeit-Anzeige der intraductal Lieferung. Repräsentative Bilder zeigen Detektion des Reagenz bis zu 45 min nach der Lieferung (Abbildung 3). Diese Technik kann auch nützlich sein für die Überwachung der Kinetik der therapeutischen Abgabe durch die Kanäle.
(Figur 4) erreicht hat und ob irgendwelche Kanäle werden während der Lieferung beschädigt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Kaninchen Gesäuge. Die beiden unteren Paare Punkte stellen die Zitzen der Leistendrüsen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Herstellung und Kanülierung der Leisten- Brustdrüse für Intraduktale Lieferung. (A) Die Zitze des rechten Leistenbrustdrüse wird nach der Abgabe von 0,2 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung hier sofort angezeigt. Nach Injektion werden die duktale Öffnungen deutlicher sichtbar gemacht. (B) A duktalen in derselben Zitze Öffnung wird dann mit einer 25 G mit stumpfen Spitze Infusionsnadel kanüliert. Der Pfeil zeigt eine duktalen Öffnung ohne eine Kanüle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Nicht gezielte Kontrast Reagenz Visualisierte innerhalb des Brust Duct durch Ultraschall Imaging. (A) Der Kontrast Reagenz wird lokalisiert unmittelbar nach der Lieferung und sichtbar gemacht wird (B) 30 Minuten nach der Lieferung und (C) 45 Minuten nach der Lieferung. Die Persistenz des Reagenz innerhalb der Brustkanal ermöglicht die Visualisierung während der gesamten Dauer dieses Protokolls. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Eine Inguinal Brustdrüse injiziert durch die Zitze mit Evans Blue Kochsalzlösung. (A) Das äußere Erscheinungsbild nach der intraductal Injektion von 0,2 ml Evans Blue - Lösung. (B) auf der Haut zu öffnen, erlaubt die Evans - Blau die Visualisierung der gesamten Brust - duktales Baum und bestätigt die intakte duktalen Struktur. (<strong> C) insgesamt Montage Exemplar einer Region Leistenbrustdrüse nach mit Karmin Alaun Fixierung und Färbung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Methode der intraductal Lieferung an die Kaninchenbrustdrüse kann für Ultraschallkontrastreagenzien und vielen anderen wässrigen Lösungen, einschließlich Vitalfarbstoffen und Therapeutika verwendet werden. Frühere Studien haben die intraductal Abgabe von Hormonen , 17, 18, 19 gezeigt. In Tiermodellen, die intraductal Lieferung von Nukleinsäuren 8, Chemotherapeutika 6, 7, und Nanopartikel - Träger 8, 20 durchgeführt wurden. Das hier beschriebene Protokoll kann auch für diese Anwendungen angepasst werden.
Für einige Anwendungen, wie die Bestätigung der intraductal Lieferung von Evans Blue Vitalfarbstoff, durch die Haut sichtbar gemacht, ausreichend sein. Allerdings Visualisierung durch die Haut ist diffus und einzelne Kanäle sind nicht gut demarcated. In Endpunktstudien, hat Evans Blue Vitalfarbstoff eine klare Karte der gesamten duktalen Baum bieten, aber dies erfordert die Isolierung des Brustgewebes. Daher kontrastverstärkte Ultraschall bietet einen alternativen Ansatz für die intraductal Lieferung an einzelne Kanäle in lebenden Tierstudien zu visualisieren. Wir stellen fest, dass Evans Blue Farbstoff den gesamten duktalen Baum Karten, einschließlich der kleinste Durchmesser Endkanälen, während Kontrast Reagenz und Ultraschall-Karten enthalten nur die größeren Kanäle. Ein weiterer Unterschied ist die Möglichkeit, zeitliche Dynamik in Ultraschall zu überwachen, während Evans Blue nur einen einzigen Schnappschuss Messung liefert.
Wie in dem Verfahren zur intraductal Lieferung an den Nagetieren Brustkanal 9, die größte Herausforderung und Begrenzung dieser Technik ist wahrscheinlich das Vertrauen auf Operator Fachwissen zu sein. Jedoch vereinfacht die größere Größe der duktalen Öffnungen in einem Kaninchenmodell des Verfahrens beseitigt die Notwendigkeit durchzuführening die Technik mit Hilfe eines Stereomikroskops, und verkürzt die Zeit für neue Betreiber erforderlich Kenntnisse zu entwickeln. Nach unserer Erfahrung ist die Injektion von 0,1-0,2 ml Kochsalzlösung auf der Seite der Zitzen vor der Lieferung intraductal ist ein entscheidender Schritt, der die klare Visualisierung der duktalen Öffnungen (Schritt 3.2, oben) ermöglicht. Eine genaue Positionierung und Aufhebung der Lieferstelle ist auch wichtig; Dies stellt sicher, dass die Lösung in den Kanal fließt (Schritte 3.5 und 3.6, oben). Wir nehmen zur Kenntnis, dass die gleichzeitige Verabreichung des Kontrast Reagenz notwendigerweise das verfügbare Volumen reduzieren zum Testen anderer Reagenzien oder Therapeutika. Jedoch kann intraductal Lieferung auch ohne Bildgebung oder mit einfachen Inspektion von Evans Blue durchgeführt werden, um die Lieferung zu bestätigen.
Die häufigste noninvasive Läsion der Brust ist duktales Karzinom in situ (DCIS), in denen abnormal duktalen Epithelzellen innerhalb des Brustkanal proliferieren aber nicht durchdringen through die Basalmembran an das benachbarte Gewebe. Mit den Fortschritten in mammographischer Bildgebung haben die Erkennungsraten von DCIS dramatisch zugenommen. In den Vereinigten Staaten sind, etwa 25% der neu diagnostizierten Brustläsionen als DCIS eingestuft, und bis zum Jahr 2020 mehr als 1 Million Frauen allein mit DCIS in den Vereinigten Staaten leben 22, 23, 24, 25. Viele DCIS Läsionen bleiben jedoch ruhend, und die meisten Schätzungen feststellen , dass nur 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 von DCIS Läsionen , jemals in ein invasives Karzinom Fortschritte. Allerdings gibt es noch keine prädiktive Biomarker bei der Identifizierung zu helfen, von denen Tumoren invasiv werden wird.
Da immer mehr Frauen mit dieser präkanzeröse Läsionen diagnostiziert werden, ernsthafte Fragen in Bezug auf Überdiagnose und Übertherapie entstanden. Die Behandlung von präkanzerösen Erkrankung ist in der Regel aggressiv. Die meisten Patienten mit DCIS wird Chirurgie (Lumpektomie oder Mastektomie) unterzogen werden , und viele auch Strahlung 25 erhalten. Einige Patienten mit Hormonrezeptor-positivem DCIS erhalten auch 5 oder mehr Jahren der endokrinen Therapie, die eine Wiederholung zu verringern gezeigt wurde. Nebenwirkungen dieser Behandlung kann Schlaganfall, Blutgerinnsel, Knochenverlust und erhöhte Risiken von Gebärmutter- und Gebärmutterschleimhautkrebs umfassen. Alle diese Optionen haben schwere systemische Nebenwirkungen und Lebensqualität der Patienten auswirken. Es besteht ein signifikanter Bedarf für weniger invasive Therapiestrategien 25.
Die intraductal Lieferung von chemotherapeutischen Mitteln in beiden Mausmodellen und bei Patientinnen mit Brustkrebs wurde früher als wirksam erwiesen, ohne Anzeichen einer systemischen Toxizität oder langfristige histopathologischen Veränderungenref "> 3, 4, 5, 6. Die intraductal Verabreichung von Therapeutika neue Möglichkeiten für Frauen könnte eines Tages mit DCIS diagnostiziert bieten, die zu einer lokal invasive Läsion noch nicht fortgeschritten ist. Das Potential tumorigenesis zum Anhalten während auch duktalen Struktur macht diese zu erhalten eine attraktive therapeutische Strategie 10. Wichtig ist , sorgt für die lokale Verabreichung Ansatz , dass die Behandlung die entsprechenden anormalen Zellen erreicht , während potentiell Kollateralschäden an andere Gewebe minimiert wird . während Modelle rabbit Tumor nicht verfügbar sind, die normale Milchdrüse von Kaninchen ein relevantes Modell liefern kann testen die lokale Verabreichung, Sicherheit, Transport und Kinetik von Therapeutika Aufnahme innerhalb des Brustgang. Diese in vivo - Untersuchungen wird die Prüfung und Validierung von Kandidaten - Diagnostika und Therapeutika in einem relevanten Gewebeumgebung ermöglichen.
8, 9 erlaubt. Jedoch unterscheidet sich die Anatomie des Maus-Brustdrüse von der menschlichen Brust in einer Reihe von wichtigen Hinsicht, einschließlich der Gewebezusammensetzung und der Anzahl der Kanäle, die an jedem Zitzenende. Dabei erweitern wir diese Technik zu einem größeren Tiermodell , in dem die Brustepithelzellen Struktur genauer stellt die Anatomie der menschlichen Brust 12, 14. Dies eröffnet die Möglichkeit für längere Überwachung durch Bildgebung und zur Bestimmung der gleichzeitigen intraductal Lieferung verschiedener Reagenzien auf dem Kaninchen Brust duktalen Epithels. Die Fortschritte in der lokalisierten Abgabe an ein geeignetes Tiermodell mit duktalen Anatomie ähnlich dem menschlichen Drüse, sollte die Anwendung von nicht-i beschleunigennvasive, gezielte therapeutische Strategien beim Menschen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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