Abstract
Tratamientos intraductales localizado para el cáncer de mama ofrecen ventajas potenciales, incluyendo la entrega eficiente con el tumor y la reducción de la toxicidad sistémica y los efectos adversos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Sin embargo, persisten algunos desafíos antes de que estos tratamientos pueden ser aplicados más ampliamente. El desarrollo y la validación de la terapéutica intraductales en un modelo animal apropiado facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas para los pacientes intraductales. Mientras que la glándula mamaria de ratón ha sido ampliamente utilizado como un sistema modelo de desarrollo mamario y la tumorigénesis, la anatomía es distinta de la glándula humano. Un modelo animal más grande, como el conejo, puede servir como un modelo mejor para la estructura de la glándula mamaria y desarrollo terapéutico intraductal. Cªontraste a ratones, en la que diez árboles ductales están distribuidas espacialmente a lo largo del eje del cuerpo, cada uno que termina en una tetina separada, la glándula mamaria de conejo se asemeja más a la glándula humana, con múltiples sistemas ductales se solapan y que salen a través de aberturas separadas en un pezón. A continuación, presentamos los métodos mínimamente invasivos para el suministro de reactivos directamente en el conducto mamario de conejo y para la visualización de la entrega de sí mismo con imágenes de ultrasonido de alta resolución.
Introduction
La entrega intraductal de agentes terapéuticos se ha estudiado en modelos de roedores y en los ensayos en humanos en fase inicial 3, 4, 5, 6, 11, 12. Un reciente estudio de Fase demostró la seguridad y la viabilidad de carboplatino intraductal o intraductal doxorrubicina liposomal pegilada en las mujeres que esperan la mastectomía para el tratamiento de cáncer invasivo 2.
Protocolos anteriores para la entrega intraductal se han desarrollado para ratón y de rata glándulas mamarias 6, 7, 8, 9. Para fines de investigación, inyecciones de células tumorales intraductales y la entrega de vector lentiviral de oncogenes también se han realizado en modelos de roedoresref "> 13, 14, 15, 16. Sin embargo, un ideal modelo in vivo del proceso de entrega intraductal debe permitir el desarrollo de nuevas clases de compuestos terapéuticos y facilitar la evaluación preclínica. Las diferencias anatómicas entre roedores y humanos han complicado la traducción de estos estudios.
A diferencia de los ratones, en el que cada conducto termina en un pezón separado, el de mama humano se compone de 5 a 9 sistemas ductales independientes, cada uno con una abertura separada terminando en el pezón. Conejo glándulas mamarias albergan cuatro sistemas ductales independientes, cada uno por separado accesible a través de uno de los cuatro orificios en una sola pezón. Un modelo de conejo es más compatible con la anatomía humana y permite el estudio de la administración de fármacos intraductal en un contexto más relevante.
En este caso, se utilizan dos técnicas para evaluar la entrega intraductal. La co-administración de unacolorante vital permite la visualización a través de la piel y proporciona una confirmación simple y rápida del método. Para algunas aplicaciones, puede ser preferible mayor mapeo resolución de los conductos. Presentamos aquí un protocolo para la formación de imágenes por ultrasonido de los conductos a través de la entrega intraductal de un reactivo no específica contraste.
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Protocol
Procedimientos que utilizan los sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas en Austin.
1. Preparación preoperatoria
- Anotar el peso corporal de cada conejo. Al igual que con todos los estudios preclínicos, monitorear pesos de los animales regularmente para evaluar la toxicidad potencial.
- Antes de anestesiar el conejo, llenar un tubo cónico de 50 ml con gel de ultrasonido disponibles comercialmente y centrifugado a 500 xg durante 30 s; no debe haber burbujas visibles en el gel sobre la terminación de la centrifugación.
- Administrar por vía subcutánea glicopirrolato en una dosis de 0,1 mg / kg y acepromacina por vía intramuscular a una dosis de 0,75 mg / kg. Espere 15-20 minutos para que el sedante para tener efecto durante el seguimiento de los signos vitales y el comportamiento.
NOTA: El glicopirrolato es un agente anticolinérgico que previene la bradicardia y reduce respiratorias y gastrointestinales secreciones. Acepromazina es un sedante que sirve como un premedicatipor la anestesia. - Administrar 35 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por vía subcutánea como anestésico. Sin embargo, como el operador vuelve más experimentado y puede lograr la entrega intraductal más rápidamente, disminuir las dosis de los fármacos a 15 mg / kg de ketamina y 3 mg / kg de xilazina por vía subcutánea; esto acortará el tiempo de anestesia y el tiempo requerido para que el animal recuperarse de la anestesia.
- Comprobar y documentar la frecuencia cardíaca, la SPO 2, temperatura, frecuencia respiratoria, y el color membrana mucosa cada 15 minutos. Aplicar lubricante ocular en ambos ojos.
NOTA: Sólo el personal que han recibido una formación adecuada y han sido aprobados por el IACUC de su institución debe administrar o supervisar la anestesia. El uso de un monitor de anestesia veterinaria puede ayudar en la adquisición de los signos vitales y se recomienda. El monitor de anestesia veterinaria, sin embargo, no reemplaza la necesidad de comprobar manualmente el animal cada 15 minutos. Ver las instrucciones del fabricante fo el uso adecuado de un monitor de veterinaria. - Verificar el inicio de la anestesia por una pizca dedo del pie suave; el conejo debe ser no responden antes de continuar.
- afeitarse con cuidado el abdomen caudal del conejo en el área alrededor de la tercera y cuarta pares de pezones inguinales.
- Con la mayor parte del pelo eliminado, aplicar una crema de depilación over-the-counter de la zona afeitada. Retire la crema 10 minutos después de la aplicación usando toallas de papel húmedas mojadas con agua tibia.
NOTA: piel de conejo es muy frágil / sensibles. La crema de depilación debe ser utilizado por no más de 10 min. De hecho, es más seguro para probar un "punto de prueba" a los 5 minutos y sólo dejar actuar durante más tiempo si punto de prueba indica un tiempo más largo se necesita tiempo. - Limpie el área con gasas empapadas en alcohol para limpiar el sitio de la inyección.
- Colocar el conejo en su dorso en una cubeta en forma de V forrada con una manta de agua caliente de recirculación y una almohadilla absorbente.
2. Preparation del agente de contraste
- Reconstituir el reactivo no específica contraste de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetear arriba y abajo suavemente para mezclar.
NOTA: El agente de contraste utilizado en este protocolo es estable a temperatura ambiente durante 4 - 6 h después de la reconstitución. Agite suavemente el vial entre cada recuperación.
NOTA: El volumen de solución requerido dependerá del número de conductos a inyectar. El conejo tiene 4 aberturas de los conductos por los pezones, y 0,2 ml de solución es suficiente para llenar un árbol ductal de un adulto New Zealand White Rabbit (Oryctolaguscuniculus). Por lo tanto, un volumen total de 0,8 ml puede ser entregado a una glándula mamaria.
3. Entrega intraductal
- Localizar los pezones apropiados para ser inyectados; Se recomiendan los pares 3 ° y 4 ° de tetinas inguinales, ya que se visualizan fácilmente cuando el animal se coloca en su dorso.
- Cargar 0,2 ml de solución salina estéril al 0,9% enuna jeringa de tuberculina de 1 ml Luer-lock con una aguja 22 G. Deseche la aguja de 22 G una vez que la solución salina es en la jeringa y reemplazarlo con una aguja de calibre 25 estéril. limpiar suavemente el área con un 85% de alcohol isopropílico en una almohadilla de gasa.
- Con el bisel de la aguja y la jeringa paralela al cuerpo del animal, insertar el bisel de la aguja en el lado de la tetina y lentamente inyectar 0,1-,2 ml de solución salina; esto permitirá una mejor visualización de las aberturas de los conductos.
- Cargar 0,2 ml de solución inyectable en una jeringa de tuberculina de 1 ml de cierre Luer.
- Mantenga el pezón suavemente con los dedos pulgar e índice y levantarlo ligeramente para posicionarlo para la inyección intraductal; una lupa ocular portátil puede ayudar en la visualización de las aberturas de los conductos.
- Mientras se mantiene la posición elevada de la tetina, cannulate cuidadosamente el conducto de interés utilizando una aguja de punta roma 25 G.
- Después de la punción, gire suavemente la jeringa Luer-lock en el centro del elemento romo-taguja de infusión ip hasta que quede bloqueado en su lugar.
- Levantar el pezón e inyectar la solución lentamente para minimizar el daño potencial causado por movimiento rápido del fluido dentro del conducto; En ningún momento debe haber resistencia al inyectar la solución.
4. imágenes por ultrasonido
- Aplicar una cantidad generosa de gel de ultrasonido se centrifugaron para la piel de la zona de interés. Asegúrese de que no haya burbujas en el gel, ya que pondrá en peligro la calidad de la imagen.
- Ajuste la profundidad de imagen de 6 mm. Coloque el transductor 21 MHz en contacto con el gel y escanear el área de interés en B-mode. Observe el medio de contraste en la región explorada incluyendo la apertura ductal y en todo el conducto.
NOTA: Estos ajustes se han desarrollado para su uso con una máquina de ultrasonido fotoacústica específica. Consulte la Tabla de Materiales para obtener más detalles. Puede ser necesario ajustar la potencia de transmisión y la profundidad de formación de imágenes de otros sistemas de imagen para optimizar mamariala visualización de la glándula. - Retire el gel de ultrasonido de la piel del animal con una almohadilla de gasa.
5. Cuidado posoperatorio
- Observe el lugar de la inyección: no debe haber signos de traumatismo en la región del pezón o en el tejido circundante, e hinchazón en el área que rodea el pezón probablemente indica una inyección almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección intraductal éxito.
- Colocar el conejo en una posición esternal. Si es necesario, dar 0,2 mg / kg de yohimbina vía intravenosa en la vena marginal de la oreja; esto va a invertir el efecto de la xilazina y permitir que el animal se recupere más rápidamente de la anestesia.
- Monitorear el conejo cada 15 minutos durante todo el período de recuperación hasta que el animal está alerta, sensible, y mantiene una posición esternal.
NOTA: Este procedimiento no debería ocasionar daño tisular o inflamación. Si enrojecimiento o inflamación se observan, administrar una dosis de meloxicam 0,1-0,2 mg / kg PO una vez que el animal está alerta y capaztomar la medicación por vía oral. Póngase en contacto con el personal veterinario de la institución para obtener más instrucciones.
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Representative Results
Aquí, se muestra que la entrega intraductal de reactivos de contraste a los conductos mamarios de un conejo puede lograrse sin trauma al tejido (Figura 2). En conejos, cuatro sistemas ductales separadas convergen en un pezón y de este modo se puede acceder de forma individual y la imagen utilizando este método. aberturas ductales individuales se visualizaron fácilmente; en cuenta el marcado de una segunda abertura ductal adyacente al conducto canulado en la Figura 2B punta de flecha.
De alta resolución de imágenes por ultrasonido con el reactivo de contraste no directo en el modo de formación de imágenes lineal puede proporcionar una lectura en tiempo real de la entrega intraductal. Imágenes representativas muestran la detección del reactivo hasta 45 min después de la entrega (Figura 3). Esta técnica también puede ser útil para el seguimiento de la cinética de la administración terapéutica a través de los conductos.
(Figura 4) y si cualquier conducto se dañan durante la entrega.
Figura 1: Esquema de conejo glándulas mamarias. Los dos pares inferiores de puntos representan los pezones de las glándulas inguinales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación y canulación de la glándula mamaria inguinal para intraductal de entrega. (A) Se muestra el pezón de la glándula mamaria inguinal derecha aquí inmediatamente después de la entrega de 0,2 ml de solución salina estéril al 0,9%. Tras la inyección, las aberturas de los conductos se visualizan más claramente. (B) Una abertura ductal en la misma tetina es entonces una cánula con una aguja de infusión con puntas romas 25 G. La flecha muestra una abertura ductal sin una cánula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La no-dirigida de Reactivo contraste Visualizado dentro del Conducto Mamario por ultrasonido Iforjamagia. (A) El reactivo de contraste se localiza inmediatamente después del parto y se visualiza (B) 30 minutos después de la entrega y (C) 45 minutos después de la entrega. La persistencia del reactivo dentro del conducto mamario permite la visualización durante toda la duración de este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Una inguinal Glándula Mamaria inyectado a través de la tetina con solución salina Evans azul. (A) El aspecto externo después de la inyección intraductal de 0,2 ml de solución de azul de Evans. (B) Al abrir la piel, el azul de Evans permite la visualización de todo el árbol ductal mamario y confirma la estructura ductal intacto. (<strong> C) Todo el montaje ejemplar de una región de la glándula mamaria inguinal después de la fijación y tinción con alumbre carmín. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este método de suministro intraductal a la glándula mamaria de conejo se puede usar para los reactivos de contraste de ultrasonido y muchas otras soluciones acuosas, incluyendo colorantes vitales y la terapéutica. Estudios previos han demostrado la entrega intraductal de hormonas 17, 18, 19. En modelos de roedores, la entrega intraductal de los ácidos nucleicos 8, quimioterapéuticos 6, 7, y portadores de nanopartículas 8, 20 se han realizado. El protocolo aquí descrito podría ser adaptado para estas aplicaciones también.
Para algunas aplicaciones, la confirmación de la entrega intraductal por colorante vital azul de Evans, como se visualiza a través de la piel, puede ser suficiente. Sin embargo, la visualización a través de la piel es difusa, y los conductos individuales no están bien demarcated. En los estudios de punto final, colorante vital azul de Evans proporciona un mapa claro de todo el árbol ductal, pero esto requiere el aislamiento del tejido mamario. Por lo tanto, el ultrasonido de contraste mejorado proporciona un enfoque alternativo para la visualización de la entrega intraductal a los conductos individuales en estudios con animales vivos. Observamos que el colorante azul de Evans mapas de todo el árbol ductal, incluyendo los conductos terminales de diámetro más pequeño, mientras que el reactivo de contraste de ultrasonido y mapas incluyen únicamente los conductos más grandes. Otra distinción es la posibilidad de controlar la dinámica temporal en ultrasonido, mientras que Evans Blue proporciona sólo una única medición instantánea.
Como en el método para la entrega intraductal al conducto mamario roedor 9, el reto más importante y la limitación de esta técnica es probable que sea la dependencia de la experiencia del operador. Sin embargo, el mayor tamaño de las aberturas de los conductos en un modelo de conejo simplifica el procedimiento, elimina la necesidad de realizaring la técnica con la ayuda de un microscopio estereoscópico, y se acorta el tiempo requerido para los nuevos operadores para desarrollar la competencia. En nuestra experiencia, la inyección de 0,1-0,2 ml de solución salina a un lado de la tetina antes de la entrega intraductal es un paso crítico que permite la visualización clara de las aberturas de los conductos (paso 3.2, más arriba). un posicionamiento preciso y levantamiento del sitio de la entrega también es esencial; esto asegura que la solución fluye en el conducto (pasos 3.5 y 3.6, más arriba). Observamos que la coadministración del reactivo contraste necesariamente reducirá el volumen disponible para probar otros reactivos o productos terapéuticos. Sin embargo, la entrega intraductal también se puede realizar sin formación de imágenes o con la simple inspección por Evans Blue para confirmar la entrega.
La lesión no invasiva más común de la mama es el carcinoma ductal in situ (DCIS), en el que las células epiteliales ductales anormales proliferan dentro del conducto mamario, pero no penetran through la membrana basal hacia el tejido adyacente. Con avances en la imagen mamográfica, las tasas de detección de carcinoma ductal in situ se han incrementado dramáticamente. En los Estados Unidos, aproximadamente el 25% de las lesiones de mama recién diagnosticados son clasificados como carcinoma ductal in situ, y en 2020, más de 1 millón de mujeres estará viviendo con carcinoma ductal in situ en los Estados Unidos solamente 22, 23, 24, 25. Sin embargo, las lesiones DCIS muchos permanecen latentes, y la mayoría de las estimaciones encuentra que sólo el 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 de las lesiones DCIS volverá a progresar a cáncer invasivo. Sin embargo, actualmente no existen biomarcadores predictivos para ayudar en la identificación de los cuales los tumores se convertirán en invasoras.
A medida que más mujeres son diagnosticadas con esta lesión precancerosa, serias dudas sobre el exceso de diagnóstico y tratamiento excesivo han surgido. El tratamiento de la enfermedad premaligna es típicamente agresivo. La mayoría de los pacientes con carcinoma ductal in situ serán sometidos a cirugía (lumpectomía o mastectomía), y muchos también recibir radiación 25. Algunos pacientes con carcinoma ductal in situ con receptores hormonales positivos también recibirán 5 o más años de terapia endocrina, que se ha demostrado que reduce la recurrencia. Los efectos secundarios de este tratamiento pueden incluir derrame cerebral, coágulos de sangre, pérdida de masa ósea, y los riesgos elevados de útero y de endometrio. Todas estas opciones tienen efectos secundarios sistémicos graves e impacto en la calidad de vida del paciente. Hay una necesidad significativa de estrategias terapéuticas menos invasivas 25.
La entrega intraductal de agentes quimioterapéuticos en los dos modelos de ratón y en pacientes con cáncer de mama ha sido previamente demostrado ser eficaz, sin evidencia de toxicidad sistémica o a largo plazo cambios histopatológicosref "> 3, 4, 5, 6. La administración intraductal de la terapéutica podría algún día ofrecer nuevas opciones para las mujeres diagnosticadas con carcinoma ductal in situ que aún no ha progresado a una lesión localmente invasivo. El potencial para detener la tumorigénesis al mismo tiempo preservar la estructura ductal hace que este una estrategia terapéutica atractiva 10. es importante destacar que el enfoque de la administración localizada asegura que el tratamiento llega a las células anormales relevantes mientras que potencialmente reducir al mínimo el daño colateral a otros tejidos. mientras que los modelos de tumor de conejo no están disponibles, la glándula mamaria normal de conejos puede proporcionar un modelo relevante para probar la entrega, la seguridad, el transporte y la cinética de absorción de la terapéutica localizadas en el interior del conducto mamario. Estos estudios in vivo permitirán a la prueba y validación de los diagnósticos y terapéuticos candidatos dentro de un entorno de tejido relevante.
8, 9. Sin embargo, la anatomía de la glándula mamaria de ratón difiere de la de mama humano en una serie de aspectos importantes, incluyendo la composición del tejido y el número de conductos que desembocan en cada pezón. Aquí, extendemos esta técnica a un modelo de animal más grande en el que la estructura epitelial mamaria representa más de cerca la anatomía del pecho humano 12, 14. Esto abre la posibilidad para el control prolongado de formación de imágenes y para el ensayo de la entrega intraductal concomitante de diversos reactivos para el epitelio ductal mamario conejo. Los avances en la administración localizada a un modelo animal apropiado, con la anatomía ductal similares a la glándula humana, deben acelerar la aplicación de la no-invasive, dirigido estrategias terapéuticas en seres humanos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
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