Abstract
Lokaliserade intraduktal behandlingar för bröstcancer erbjuda potentiella fördelar, bland annat en effektiv leverans till tumören och minskad systemisk toxicitet och biverkningar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Men flera utmaningar återstår innan dessa behandlingar kan tillämpas i större utsträckning. Utveckling och validering av intraduktal läkemedel i en lämplig djurmodell underlätta utvecklingen av intraduktal terapeutiska strategier för patienter. Medan musen bröstkörteln har allmänt använts som ett modellsystem för bröstutveckling och tumörgenes, är anatomin skiljer sig från den humana körteln. En större djurmodell, såsom kanin, kan tjäna som en bättre modell för bröstkörtelstruktur och intraduktal terapeutisk utveckling. i contrast till möss, där tio duktala träd spatialt fördelade längs kroppens axel, varje slutar i en separat spene, kanin bröstkörteln mer liknar den mänskliga körtel, med flera överlappande duktala system som ut genom separata öppningar i en spene. Här presenterar vi minimalinvasiva metoder för leverans av reagens direkt i kaninen bröstkanalen och för visualisering av själva förlossningen med hög upplösning ultraljud.
Introduction
Den intraduktal leverans av terapeutiska medel har studerats i gnagarmodeller och i ett tidigt skede mänskliga prov 3, 4, 5, 6, 11, 12. En ny fas I-studie visat säkerheten och genomförbarheten av intraduktal karboplatin eller intraduktal pegylerat liposomalt doxorubicin hos kvinnor väntar mastektomi för behandling av invasiv cancer 2.
Tidigare protokoll för intraduktal leverans har utvecklats för mus och råtta bröstkörtlarna 6, 7, 8, 9. För forskningsändamål, intraduktal tumörcellinjektioner och lentivirusvektorn leverans av onkogener har också utförts i djurmodellerref "> 13, 14, 15, 16. Dock bör en ideal in vivo modell av intraduktal leveransprocessen det möjligt att utveckla nya klasser av terapeutiska föreningar och underlättar preklinisk bedömning. Anatomiska skillnader mellan gnagare och människa har komplicerat översättningen av dessa studier.
Till skillnad från möss, där varje kanal slutar vid en separat spene, den humana bröst består av fem till nio oberoende duktala system, var och en med en separat öppning som slutar vid spenen. Kanin mjölkkörtlar hamnen fyra oberoende duktala system, varje nås separat genom ett av fyra öppningar på en enda spene. En kaninmodell matchar närmare den mänskliga anatomin och tillåter studier av intraduktal drug delivery i en mer relevant sammanhang.
Här använder vi två metoder för att bedöma intraduktal leverans. Samtidig administrering av envitala färgämnet tillåter visualisering genom huden och ger en enkel och snabb bekräftelse av metoden. För vissa applikationer kan högre upplösning kartläggning av kanalerna vara föredragna. Vi presenterar här ett protokoll för ultraljudsundersökningar av kanalerna genom intraduktal leverans av en icke-riktad kontrastreagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden med användning av djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Texas i Austin.
1. Preoperativ Framställning
- Spela in kroppsvikten hos varje kanin. Som med alla prekliniska studier, övervaka djurens vikt regelbundet utvärdera potentiella toxicitet.
- Före anesthetizing kaninen, fylla en 50 ml koniska rör med kommersiellt tillgänglig ultraljuds gel och centrifugering vid 500 xg under 30 s; det bör inte finnas några synliga bubblor i gelén efter avslutad centrifugering.
- Administrera glykopyrrolat subkutant vid en dos av 0,1 mg / kg och acepromazin intramuskulärt vid en dos av 0,75 mg / kg. Vänta 15-20 minuter för lugnande att träda i kraft samtidigt som övervakning av vitala tecken och beteende.
OBS: Glykopyrrolat är ett anti-kolinergt medel som förhindrar bradykardi och minskar respiratoriska och gastrointestinala sekret. Acepromazin är ett lugnande medel som fungerar som en premedicatipå för anestesi. - Administrera 35 mg / kg av ketamin och 5 mg / kg av xylazin subkutant som bedövningsmedel. Eftersom operatören blir mer erfaren och kan åstadkomma intraduktal leverans snabbare minska läkemedelsdoser till 15 mg / kg ketamin och 3 mg / kg xylazin subkutant; detta kommer att förkorta anestesitiden och den tid som krävs för djuret att återhämta sig från anestesi.
- Kontrollera och dokumentera hjärtfrekvens, SPO 2, temperatur, andningsfrekvens, och slemhinnan färg varje 15 min. Applicera ögon smörjmedel på båda ögonen.
OBS: Endast personal som har genomgått lämplig utbildning och har godkänts av deras institutions IACUC ska administrera eller övervaka anestesi. Användningen av en veterinär anestesi monitor kan hjälpa till att förvärva vitala och rekommenderas. Veterinär anestesi bildskärm, dock inte ersätta behovet av att kontrollera djuret manuellt varje 15 min. Se tillverkarens instruktioner feller korrekt användning av en veterinär bildskärm. - Kontrollera uppkomsten av anestesi genom en mild tå nypa; kaninen bör vara icke-responsiva innan det fortsätter.
- Noggrant rakning den kaudala buken hos kaninen i området kring den tredje och fjärde par av inguinal spenarna.
- Med majoriteten av håret bort, tillämpa en over-the-counter hårborttagningskräm till det rakade området. Ta bort krämen 10 min efter program med fuktigt hushållspapper vätta med varmt vatten.
OBS: Kanin hud är mycket ömtålig / känslig. Den hårborttagningskräm ska användas för mer än 10 minuter. I själva verket är det säkrare att prova en "test spot" på fem minuter och bara lämna på längre om prov plats indikerar en längre tid behövs. - Torka området med alkohol-indränkt gasbinda kuddar att rengöra injektionsstället.
- Placera kanin på dess dorsum i ett v-format tråg fodrat med ett recirkulerande varmvattenfilt och en absorberande dyna.
2. Preparation av kontrastmedel
- Rekonstituera icke öron kontrast reagens enligt tillverkarens anvisningar. Pipett upp och ner försiktigt för att blanda.
OBS: kontrastmedlet används i detta protokoll är stabil vid rumstemperatur under 4-6 h efter beredning. Skaka flaskan mellan varje hämtning.
OBS: Den volym lösning som krävs kommer att bero på antalet kanaler som skall injiceras. Kaninen har 4 duktala öppningar per spene, och 0,2 ml av lösningen är tillräcklig för att fylla en duktal träd av en vuxen Nya Zeeland vit kanin (Oryctolaguscuniculus). Således kan en total volym av 0,8 ml att levereras till en bröstkörtel.
3. intraduktal Leverans
- Lokalisera lämpliga spenarna som injiceras; den 3: e och 4: e par inguinal spenar rekommenderas, eftersom de lätt visualiseras när djuret är placerad på sin rygg.
- Belastning 0,2 ml steril 0,9% saltlösning ien 1 ml luer-lås tuberkulinspruta med en 22 G-nål. Kassera den 22 G nål när saltlösning är i sprutan och ersätta den med en steril 25-gauge nål. Torka försiktigt av området med 85% isopropylalkohol på en kompress.
- Med avfasning av nålen upp och sprutan parallellt med kroppen av djuret, för in avfasning av nålen in i sidan av spenen och långsamt injicera 0,1 till 0,2 ml saltlösning; detta gör det möjligt för bättre visualisering av duktala öppningar.
- Belastning 0,2 ml injektionslösning i en 1 ml luer-lås tuberkulinspruta.
- Håll spenen försiktigt med tummen och pekfingret och lyfta den något att placera den för intraduktal injektion; en bärbar okulär lupp kan hjälpa till att visualisera de duktala öppningar.
- Under bibehållande av den upplyfta positionen för spenen, noggrant kanylera kanalen av intresse med användning en 25 G trubbig spets nål.
- Efter kanylering, försiktigt vrida Luer-lockspruta den på navet av den trubbiga-tip infusion nålen tills den är låst på plats.
- Lyft spenen och injicera lösningen långsamt för att minimera eventuella skador som orsakas av snabbt flytta vätska i kanalen; vid något tillfälle bör det finnas motstånd när injicera lösningen.
4. Ultraljud Imaging
- Applicera en liberal mängd centrifuge ultraljud gel på huden i området av intresse. Säkerställa att det inte finns några bubblor i gelén, eftersom dessa kommer att äventyra bildkvalitet.
- Ställa in bilddjupet till 6 mm. Placera 21-MHz-omvandlare i kontakt med gelén och skanna området av intresse i B-läget. Observera kontrastmedlet i den skannade regionen, inklusive duktal öppning och hela kanalen.
OBS: Dessa inställningar har utvecklats för användning med en specifik fotoakustisk ultraljud maskin. Se tabell av material för mer information. Det kan vara nödvändigt att justera sändningseffekten och bilddjupet andra bildsystem för att optimera bröstkörtel visualisering. - Avlägsna ultraljudsgel från djurets hud med en kompress.
5. Postoperativ vård
- Observera injektionsstället: det bör inte finnas några tecken på trauma spenen region eller till den omgivande vävnaden, och svullnad i området kring spenen sannolikt indikerar en bröstfettkudden injektion snarare än en framgångsrik intraduktal injektion.
- Placera kanin i en sternala läge. Om det behövs, ge 0,2 mg / kg av yohimbin intravenöst till den marginella öronvenen; detta kommer att vända effekten av xylazin och tillåta djuret att återhämta sig snabbare från narkos.
- Övervaka kaninen var 15 min under återhämtningsperioden till dess att djuret är alert, lyhörd och har en sternala läge.
OBS: Detta förfarande bör inte leda till vävnadsskada eller svullnad. Om rodnad eller svullnad observeras, administrera en dos av meloxikam 0,1-0,2 mg / kg PO när djuret är alert och kanatt ta medicin oralt. Kontakta institutionens veterinärpersonal för ytterligare vägledning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi att den intraduktal tillförsel av kontrastreagens till bröst ledningar av en kanin kan uppnås utan trauma för vävnaden (figur 2). Hos kaniner, fyra separata duktala system konvergera på en spene och därmed kan nås och avbildas individuellt med hjälp av denna metod. Individuella duktala öppningar lätt visualiseras; notera pilspetsen märkningen en andra duktal öppning intill den kanylerade kanalen i figur 2B.
Högupplöst ultraljud med oriktade kontrastreagens i linjär bildläget kan ge en realtid avläsning av intraduktal leverans. Representativa bilder visar detektion av reagenset upp till 45 min efter leverans (Figur 3). Denna teknik kan också vara användbara för att övervaka kinetiken för terapeutisk tillförsel genom kanalerna.
(figur 4) och huruvida eventuella kanaler skadas under leveransen.
Figur 1: Schematisk bild av kanin bröstkörtlar. De två undre paren av punkter representerar spenar de inguinala körtlar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förberedelser och kanylering av den Inguinal bröstkörtlarna för intraduktal Delivery. (A) Den spene hos den högra inguinala bröstkörteln visas här omedelbart efter leverans av 0,2 ml 0,9% steril saltlösning. Vid injektion är duktala öppningar visualiseras tydligare. (B) En duktal öppning i samma spene därefter kanyleras med en 25 G trubbig spets infusionsnål. Pilen visar en duktal öppning utan en kanyl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Icke-riktad Kontrast reagens visualiseras i bröst kanalen med ultraljud Imaging. (A) Kontrasten reagenset är lokaliserad omedelbart efter leverans och visualiseras (B) 30 min efter leverans och (C) 45 min efter leverans. Varaktigheten av reagens inuti bröst kanalen tillåter visualisering under hela detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Ett Inguinal Mammary Gland Injiceras genom napp med Evans Blue Saline Solution. (A) Det yttre utseendet efter intraduktal injektion av 0,2 ml av Evans Blue lösning. (B) När du öppnar huden, Evans Blue tillåter visualisering av hela bröst duktal träd och bekräftar den intakta duktal struktur. (<strong> C) Hela monterade exemplar av en region av inguinal mjölkkörtlarna efter fixering och färgning med karmin alun. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod för intraduktal leverans till kaninbröstkörteln kan användas för ultraljudskontrastmedel reagens och många andra vattenlösningar, inklusive vitala färgämnen och terapeutiska medel. Tidigare studier har visat att intraduktal leverans av hormoner 17, 18, 19. I gnagarmodeller, den intraduktal leverans av nukleinsyror 8, kemoterapeutika 6, 7 och nanopartikelbärare 8, har 20 utförts. Protokollet som beskrivs här skulle kunna anpassas för dessa tillämpningar också.
För vissa tillämpningar, bekräftelse av intraduktal leverans av Evans Blue vitala färgämnet, som visualiseras genom huden, kan vara tillräcklig. Dock är visualisering genom huden diffus, och enskilda kanalerna är inte bra demarcated. I endpoint studier, gör Evans Blue vitala färgämnet ger en tydlig karta över hela duktal trädet, men detta kräver isolering av bröstvävnaden. Därför ger kontrastförstärkt ultraljud ett alternativt tillvägagångssätt för att visualisera intraduktal leverans till enskilda kanaler i levande djurstudier. Vi noterar att Evans Blue färgämne kartor hela duktal träd, inklusive terminalkanalerna minsta diameter, medan kontrastreagens och ultraljud kartor endast omfatta de större kanalerna. En annan skillnad är möjligheten att övervaka tidsmässig dynamik i ultraljud, medan Evans Blue ger endast en enskild stillbild mätning.
Liksom i metoden för intraduktal leverans till gnagare bröstkanalen 9, kommer sannolikt att vara beroende av operatörens kompetens den viktigaste utmaningen och begränsning till denna teknik. Emellertid den större storleken på de duktala öppningarna i en kaninmodell förenklas förfarandet, eliminerar behovet av att utföraing tekniken med hjälp av ett stereomikroskop, och förkortar tiden som krävs för nya aktörer att utveckla färdigheter. I vår erfarenhet, är injektion av 0,1-0,2 ml av saltlösning till den sida av spenen före intraduktal leverans ett kritiskt steg som möjliggör tydlig visualisering av de duktala öppningarna (steg 3,2, ovan). Noggrann positionering och lyftning av leveransplatsen är också viktigt; detta säkerställer att lösningen strömmar in i kanalen (steg 3,5 och 3,6, ovan). Vi noterar att samtidig administrering av kontrastreagens nödvändigtvis kommer att minska den tillgängliga volymen för att testa andra reagens eller läkemedel. Emellertid kan också utföras intraduktal leverans utan avbildning eller med enkel kontroll av Evans Blue för att bekräfta leverans.
Den vanligaste icke-invasiv lesion av bröstet är duktalt karcinom in situ (DCIS), i vilka abnorma duktala epiteliala celler prolifererar inne i bröstkanalen men inte penetrerar rakt igenomh basalmembranet till den intilliggande vävnaden. Med framsteg inom mammografi avbildning, har upptäckt andelen DCIS ökat dramatiskt. I USA, är cirka 25% av nydiagnostiserade bröstförändringar klassificeras som DCIS och 2020, kommer mer än 1 miljon kvinnor att leva med DCIS enbart 22, 23, 24, 25 i USA. Men många DCIS lesioner förblir vilande och de flesta uppskattningar finner att endast 15-40% 21, 22, 23, 24, 25 av DCIS lesioner någonsin kommer att utvecklas till invasiv cancer. Men det finns för närvarande inga prediktiva biomarkörer för att hjälpa till att identifiera vilka tumörer blir invasiva.
När fler kvinnor diagnostiseras med detta förstadium till hudcancer, allvarliga frågor om överdiagnostik och överbehandling har dykt upp. Behandling av premaligna sjukdom är typiskt aggressiva. De flesta patienter med DCIS kommer att genomgå kirurgi (lumpectomy eller mastektomi), och många också få strålning 25. Vissa patienter med hormonreceptorpositiv DCIS kommer också att få 5 eller fler år av endokrin terapi, som har visat sig minska återfall. Biverkningar av denna behandling kan inkludera stroke, blodproppar, benförlust, och förhöjda risker för livmoder och endometriecancer. Alla dessa alternativ har allvarliga systemiska biverkningar och påverkar patientens livskvalitet. Det finns ett stort behov av mindre invasiva terapeutiska strategier 25.
Den intraduktal leverans av kemoterapeutiska medel i båda modellerna mus och i bröstcancerpatienter har tidigare visat sig vara effektiv, med inga tecken på systemisk toxicitet eller långsiktiga histopatologiska förändringarref "> 3, 4, 5, 6. Den intraduktal administrering av läkemedel kan en dag erbjuda nya alternativ för kvinnor som diagnostiseras med DCIS som ännu inte har kommit till en lokalt invasiv skada. Potentialen för att stoppa tumörbildning samtidigt som man bevarar duktal struktur gör detta en attraktiv terapeutisk strategi 10. Viktigt säkerställer lokal administrering strategi att behandlingen når relevanta avvikande celler medan potentiellt minimera skador på andra vävnader. Även kanin tumörmodeller inte är tillgängliga, kan den normala bröstkörteln hos kaniner ge en relevant modell testa lokaliserade leverans, säkerhet, transporter och kinetik av terapeutiska upptaget inuti bröst kanalen. Dessa in vivo-studier kommer att göra det möjligt för testning och validering av kandidat diagnostik och läkemedel inom ett relevant vävnadsmiljö.
8, 9. Emellertid anatomin hos mus bröstkörteln skiljer sig från den humana bröst i ett antal viktiga avseenden, inklusive vävnadssammansättning och antalet kanaler som slutar vid varje spene. Här, vi utvidga denna teknik för att en större djurmodell i vilken den mammary epithelial strukturen representerar närmare anatomin hos den mänskliga bröst 12, 14. Detta öppnar upp möjligheten för utökad övervakning av avbildning och för att analysera den åtföljande intraduktal leverans av olika reagens till kaninbröst duktal epitel. Framsteg i lokal leverans till en lämplig djurmodell, med duktal anatomi liknar den mänskliga körtel, bör påskynda tillämpningen av icke-invasive, riktade terapeutiska strategier hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MicroMarker non-targeted contrast reagent | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Syringes | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0.2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 month shelf life, supply may be limited. |
| Atropine Sulfate 0.5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate. |
| Ketamine HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xylazine 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbine 0.2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Hair Removing Cream | Veet | Sensitive skin solution. Available through local retailers. | |
| Blunt tip infusion needles | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Veterinary Pulse Oximeter | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Warm Water Pump | Gaymar | TP700 | |
| Warm Water Blanket | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Warming Pads |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 2100 |
References
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2 (2), 75-82 (2010).
- Love, S. M., et al. A Feasibility Study of the Intraductal Administration of Chemotherapy. Cancer Prevention Research. 6 (1), 51-58 (2013).
- Stearns, V., et al. Preclinical and Clinical Evaluation of Intraductally Administered Agents in Early Breast Cancer. Sci Transl Med. 3 (106), 106ra108 (2011).
- Zhang, B., et al. The Safety Parameters of the Study on Intraductal Cytotoxic Agent Delivery to the Breast before Mastectomy. Chin J Cancer Res. 26 (5), 579-587 (2014).
- Mahoney, M. E., Gordon, E. J., Rao, J. Y., Jin, Y., Hylton, N., Love, S. M. Intraductal Therapy of Ductal Carcinoma In Situ: a Presurgery Study. Clin Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Murata, S., et al. Ductal Access for Prevention and Therapy of Mammary Tumors. Cancer Res. 66 (2), 638-645 (2006).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally Administered Pegylated Liposomal Doxorubicin Reduces Mammary Stem Cell Function In the Mammary Gland but in the Long Term, Induces Malignant Tumors. Breast Cancer Res Treat. 135 (1), 201-208 (2012).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by Intraductal Injection of siRNA Lipidoid Nanoparticles Prevents Mammary Tumor Progression in Mice. Sci Trans Med. 6 (217), 2172a2 (2014).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal Injection For Localized Drug Delivery To The Mouse Mammary Epithelium. J Vis Exp. (80), e50692 (2013).
- Brock, A., Goh, H. T., Yang, B., Yu, L., Li, H., Loh, Y. H. Cellular Reprogramming: A New Technology Frontier In Pharmaceutical Research. Pharm Res. 29 (1), 35-52 (2012).
- Silverstein, M. J., et al. Ductal Carcinoma In Situ of the Breast. Annu. Rev Med. 51, 17-32 (2000).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the Nipple And Breast Ducts Revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Virnig, B. A., Shamliyan, T., Tuttle, T. M., Kane, R. L., Wilt, W. J. Diagnosis and Management of Ductal Carcinoma In Situ (DCIS). Evidence Report/Technology Assessment. , AHRQ Publication No. 09-E018 185 (2009).
- Mills, D., et al. Examination of Duct Physiology in the Human Mammary Gland. PLoS One. 11 (4), e0150653 (2016).
- King, B. L., Love, S. M. The Intraductal Approach to the Breast: Raison d'Etre. Breast Cancer Res. 8 (2), 206 (2006).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo . J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Lyons, W. R. The Direct Mammotrophic Action of Lactogenic Hormone. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 51 (2), 308-311 (1942).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects Of Intraductal Prolactin On Some Aspects of the Ultrastructure and Biochemistry of Mammary Tissue in the Pseudopregnant Rabbit. J Endocrinol. 49 (3), 459-469 (1971).
- Falconer, I. R., Fiddler, T. J. Effects of Intraductal Administration Of Prolactin, Actinomycin D and Cycloheximide on Lipoprotein Lipase Activity in the Mammary Glands of Pseudopregnant Rabbits. Biochim Biophys Acta. 218 (3), 508-514 (1970).
- Singh, Y. Influence of Molecular Size on the Retention of Polymeric Nanocarrier Diagnostic Agents in Breast Ducts. Pharm Res. 29 (9), 2377-2388 (2012).
- Jain, R., et al. Atypical Ductal Hyperplasia: Interobserver and Intraobserver Variability. Mod Pathol. 24 (7), 917-923 (2011).
- Betsill, W. L. Jr, Rosen, P. P., Lieberman, P. H., Robbins, G. F. Intraductal Carcinoma. Long-term Follow-up After Treatment by Biopsy Alone. JAMA. 239 (18), 1863-1867 (1978).
- Eusebi, V., et al. Long-term Follow-up of In Situ Carcinoma of the Breast. Semin Diagn Pathol. 11 (3), 223-235 (1994).
- Sanders, M., et al. The Natural History Of Low-Grade Ductal Carcinoma In Situ Of The Breast In Women Treated By Biopsy Only Revealed Over 30 Years Of Long-Term Follow-Up. Cancer. 103 (12), 2481-2484 (2005).
- Esserman, L. J., et al. Addressing Overdiagnosis and Overtreatment in Cancer: A Prescription For Change. Lancet Oncol. 15 (6), e234-e242 (2014).
