Intraduktal Levering til kanin mælkekirtlerne

Abstract

Lokaliserede intraduktal behandlinger for brystkræft give potentielle fordele, herunder effektiv levering til tumoren og reduceret systemisk toksicitet og bivirkninger ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} Men stadig flere udfordringer, før disse behandlinger kan anvendes mere bredt. Udvikling og validering af intraduktal lægemidler i en passende dyremodel lette udviklingen af ​​intraduktal terapeutiske strategier for patienterne. Mens musen mælkekirtlen har været meget anvendt som et modelsystem for mammary udvikling og tumorigenese, anatomi er forskellig fra den humane kirtel. En større dyremodel, såsom kanin, kan tjene som en bedre model for mælkekirtlen struktur og intraduktal terapeutisk udvikling. I contrast til mus, i hvilken ti duktale træer er rumligt fordelt langs kroppen akse, hver ender i en separat patte, kanin brystkirtel nærmere ligner den humane kirtel, med flere overlappende duktale systemer denne udgang gennem særskilte åbninger i én patte. Her præsenteres minimalt invasive fremgangsmåder til tilsætning af reagenser direkte i kanin mamma kanal og til visualisering af leveringen selv med høj opløsning ultralydsbilleddannelse.

Introduction

Den intraduktal afgivelse af terapeutiske midler er blevet undersøgt i gnavermodeller og i begyndelsen af fase menneskelige forsøg ^{3, 4, 5, 6, 11, 12.} En nylig fase I studie demonstreret sikkerhed og muligheden for intraduktal carboplatin eller intraduktal pegyleret liposomal doxorubicin hos kvinder venter mastektomi til behandling af invasiv cancer ^2.

Tidligere protokoller for intraduktal levering er blevet udviklet til mus og rotte mælkekirtler ^{6, 7, 8, 9.} Til forskningsformål, intraduktal tumor celle injektioner og lentivirusvektoren levering af onkogener er også blevet udført i gnavermodellerref "> ^{13, 14, 15, 16.} Imidlertid bør en ideel in vivo model af den intraduktal leveranceprocessen muliggøre udvikling af nye klasser af terapeutiske forbindelser og fremme præklinisk vurdering. Anatomiske forskelle mellem gnavere og mennesker har kompliceret oversættelsen af disse undersøgelser.

I modsætning mus, i hvilken hver kanal slutter i en separat patte, den humane bryst- består af 5 til 9 uafhængige duktale systemer, hver med en separat åbning slutter ved patten. Kanin brystkirtler havnen fire uafhængige duktale systemer, hver separat tilgængelige gennem en af ​​fire åbninger i en enkelt patte. En kanin model passer bedre den menneskelige anatomi og tillader studiet af intraduktal lægemiddeladministration i en mere relevant kontekst.

Her bruger vi to teknikker til at vurdere intraduktal levering. Samtidig administration af etvitalfarvestof tillader visualisering gennem huden og giver en enkel og hurtig bekræftelse af fremgangsmåden. For nogle anvendelser kan højere opløsning kortlægning af kanalerne blive foretrukket. Vi præsenterer her en protokol til ultralydsscanning af kanalerne gennem intraduktal overdragelse af et ikke-målrettet kontrast reagens.

Protocol

Procedurer bruger forsøgsdyr er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Texas i Austin.

1. Præoperativ forberedelse

1. Optag legemsvægt hver kanin. Som med alle prækliniske studier, overvåge dyrs vægte regelmæssigt at vurdere potentielle toksicitet.
2. Forud for bedøvelse kaninen, fylde en 50 ml konisk rør med kommercielt tilgængeligt ultralyd gel og centrifugering ved 500 xg i 30 s; Der bør ikke være nogen synlige bobler i gelen ved afslutningen af ​​centrifugering.
3. Administrere glycopyrrolat subkutant i en dosis på 0,1 mg / kg og acepromazin intramuskulært i en dosis på 0,75 mg / kg. Vent 15-20 min for beroligende at træde i kraft samtidig med overvågning af vitale tegn og adfærd.
   BEMÆRK: Glycopyrrolat er et anti-cholinergt middel, der forhindrer bradykardi og reducerer luftvejs- og GI sekreter. Acepromazin er et sedativ, der fungerer som en premedicatipå til anæstesi.
4. Administrere 35 mg / kg af ketamin og 5 mg / kg xylazin subkutant som et bedøvelsesmiddel. Men som operatøren bliver mere erfarne og kan udføre intraduktal levering hurtigere, mindske medikamentdoser til 15 mg / kg ketamin og 3 mg / kg af xylazin subkutant; dette vil forkorte anæstesi tid og den tid der kræves for dyret at komme sig fra bedøvelsen.
5. Kontroller og dokumentere puls, SPO _2, temperatur, respirationsfrekvens, og slim membran farve hver 15 min. Påfør øjet smøremiddel til begge øjne.
   BEMÆRK: Kun personale, der har gennemgået relevant uddannelse og er blevet godkendt af deres institutions IACUC bør administrere eller overvåge anæstesi. Brugen af ​​en veterinær anæstesi monitor kan støtte i at erhverve vitale tegn og anbefales. Den veterinære anæstesi skærm, dog ikke erstatte behovet for manuelt at kontrollere dyret hver 15 min. Se producentens anvisninger feller den korrekte anvendelse af en veterinær monitor.
6. Kontroller indtræden af ​​anæstesi ved en blid tå knivspids; kaninen bør være ikke-responsiv før der fortsættes.
7. barbere omhyggeligt den kaudale underliv kanin i området omkring det tredje og fjerde par af lyskebrok patter.
8. Med de fleste af håret fjernet, anvende en over-the-counter hårfjerning creme til det barberede område. Fjern cremen 10 min efter påføring ved hjælp af fugtige papirservietter fugtet med varmt vand.
   BEMÆRK: Kanin hud er meget skrøbelig / følsomme. Den hårfjerning creme bør anvendes for ikke mere end 10 min. Faktisk er det mere sikkert at forsøge en "test spot" ved 5 min og kun forlade på længere, hvis test spot indikerer en længere tid er nødvendig periode.
9. Tør området med alkohol-gennemblødt gaze puder til at rense injektionsstedet.
10. Placer kanin på sin dorsum i en V-formet trug foret med et recirkulerende varmt vand tæppe og en absorberende pude.

2. Preparation af kontrastmidlet

1. Rekonstituer den ikke-målrettede kontrast reagens ifølge producentens anvisninger. Pipette op og ned forsigtigt for at blande.
   BEMÆRK: kontrastmiddel anvendt i denne protokol er stabilt ved stuetemperatur i 4 - 6 timer efter rekonstituering. Vip forsigtigt hætteglasset mellem hver hentning.
   BEMÆRK: Volumenet af opløsning kræves, vil afhænge af antallet af kanaler, der skal injiceres. Kaninen har 4 duktale åbninger pr patten, og 0,2 ml opløsning er tilstrækkelig til at fylde et duktalt træ af en voksen New Zealand White Rabbit (Oryctolaguscuniculus). Således kan et totalvolumen på 0,8 ml leveres til en brystkirtel.

3. intraduktal Levering

1. Find de relevante patter, der skal injiceres; af ^3. og ^4. par lysken patter anbefales, da de let visualiseres når dyret er placeret på sin dorsum.
2. Belastning 0,2 ml sterilt 0,9% saltvand inden 1 ml Luer-lock tuberkulin sprøjte med en 22 G nål. Bortskaf den 22 G nål, når saltvand er i sprøjten, og erstatte det med en steril 25-gauge kanyle. Tør forsigtigt området med 85% isopropylalkohol på en gaze pad.
3. Med facet af nålen op og sprøjten parallelt med kroppen af ​​dyret, indsætte affasning af nålen ind i siden af ​​patten og langsomt injicere 0,1-0,2 ml saltvand; dette vil give mulighed for en bedre visualisering af duktale åbninger.
4. Belastning 0,2 ml injektionsopløsning i en 1 ml Luer-lock tuberkulin sprøjte.
5. Hold patten forsigtigt med tommelfingeren og pegefingeren, og løft det lidt for at placere den for intraduktal injektion; en wearable okulær lup kan støtte i at visualisere de duktale åbninger.
6. Under opretholdelse løftet position af patten, omhyggeligt kanyle kanalen af ​​interesse under anvendelse af en 25 G stump-spids nål.
7. Efter kanylering, forsigtigt vride Luer-lock sprøjte på navet af stump-tip infusion nål, indtil den er låst på plads.
8. Løft patten og injicere opløsningen langsomt for at minimere potentielle skade ved hurtigt at flytte væske i kanalen; på intet tidspunkt bør der være modstand, når injicere opløsningen.

4. Ultrasound Imaging

1. Påfør en liberal mængde centrifugerede ultralyd gel på huden af ​​området af interesse. Sørg for, at der ikke er nogen bobler i gelen, da disse vil kompromittere billedkvaliteten.
2. Indstil billeddannende dybde til 6 mm. Placer 21 MHz transducer i kontakt med gelen og scanne det interessante område i B-mode. Observere kontrastmediet i det scannede område, herunder duktal åbning og hele kanalen.
   BEMÆRK: Der er udviklet Disse indstillinger til brug med en specifik Photoacoustic ultralyd maskine. Se tabellen Materialer for flere detaljer. Det kan være nødvendigt at justere sendeeffekten og billeddannelse dybde af andre billeddannende systemer til at optimere mammarykirtel visualisering.
3. Fjern ultralyd gel fra dyrets hud med et stykke gaze.

5. Postoperativ pleje

1. Observere injektionsstedet: der bør være nogen tegn på traumer på patten region eller til det omgivende væv, og hævelse i området omkring patten sandsynligvis indikerer en brystfedtpude injektion snarere end en vellykket intraduktal injektion.
2. Placer kanin i en brystbenslymfeknuderne position. Hvis det er nødvendigt, giver 0,2 mg / kg af yohimbin intravenøst ​​til den marginale ørevene; dette vil vende effekten af ​​xylazin og så dyret kan komme sig hurtigere fra bedøvelsen.
3. Overvåg kanin hver 15 min i hele tilbagebetalingsperioden indtil dyret er opmærksom, lydhør, og opretholder en brystbenet position.
   BEMÆRK: Denne procedure bør ikke medføre vævsskader eller hævelse. Hvis rødme eller hævelse overholdes, administrere en dosis af meloxicam 0,1-0,2 mg / kg PO, når dyret er vågen og i standtil at tage medicin oralt. Kontakt institutionens veterinære personale for yderligere vejledning.

Representative Results

Her viser vi, at den intraduktal levering af kontrastmidler reagenser til mammae kanaler med en kanin kan opnås uden trauma til vævet (figur 2). Hos kaniner fire separate duktale systemer konvergere på én patte, og dermed kan få adgang til og filmede individuelt ved hjælp af denne metode. Individuelle duktale åbninger er let visualiseres; Bemærk pilespidsen markerer en anden duktal åbning støder op til kanylerede kanalen i figur 2B.

Høj opløsning ultralydsscanning med målrettede kontrast reagens i lineær imaging tilstand kan give en real-time udlæsning af intraduktal levering. Repræsentative billeder viser påvisning af reagenset op til 45 minutter efter levering (figur 3). Denne teknik kan også være nyttig til overvågning kinetikken for terapeutisk levering gennem kanalerne.

(figur 4), og om eventuelle kanaler er beskadiget under leveringen.

Figur 1: Skematisk af Rabbit mælkekirtler. De to nederste par af prikker repræsenterer patterne på de inguinale kirtler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Fremstilling og Kanylering af lyskelymfeknuder mælkekirtler for intraduktal Delivery. (A) patte på den højre lyske brystkirtel Her vises umiddelbart efter levering af 0,2 ml 0,9% sterilt saltvand. Ved injektion, er de duktale åbninger visualiseret mere tydeligt. (B) En duktalt åbning i samme patte derefter kanyleret med en 25 G stump-spids infusionsnålen. Pilen viser et duktalt åbning uden en kanyle. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Ikke-målrettet Kontrast Reagent Visualisering i Mammary Duct af ultralyd Imaging. (A) Kontrasten reagens er lokaliseret umiddelbart efter levering og visualiseres (B) 30 min efter levering og (C) 45 min efter levering. Den fortsatte reagenset inden i mamma kanal tillader visualisering under hele denne protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: En lyskelymfeknuder mælkekirtler injiceres gennem Sut med Evans blå saltvandsopløsning. (A) Den ydre fremtoning efter intraduktal injektion af 0,2 ml af Evans blå opløsning. (B) Efter åbning huden, Evans Blå tillader visualisering af hele mamma duktal træ og bekræfter den intakte duktal struktur. (<strong> C) Hele-mount eksemplar af en region i lyskebrok mælkekirtler efter fiksering og farvning med carmin alun. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne metode til intraduktal levering til kanin mælkekirtlerne kan anvendes til ultralydskontrastmidler reagenser og mange andre vandige opløsninger, herunder vitale farvestoffer og terapeutiske midler. Tidligere undersøgelser har vist, intraduktal levering af hormoner ^{17, 18, 19.} I gnavermodeller, den intraduktal administration af nukleinsyrer ^8, kemoterapeutika ^{6, 7} og nanopartikler bærere ^8, er ²⁰ blevet udført. Den her beskrevne protokol kan tilpasses til disse ansøgninger.

Til nogle anvendelser bekræftelse af intraduktal levering af Evans Blå vitalfarvestof, som visualiseret gennem huden, kan være tilstrækkeligt. Imidlertid visualisering gennem huden er diffus, og individuelle kanaler er ikke godt demarcated. I endpoint undersøgelser, Evans blåt vitalfarvestof giver en klar kort over hele duktal træ, men dette kræver isoleringen af ​​brystvævet. Derfor kontrast-forstærket ultralyd tilvejebringer en alternativ metode til visualisering af intraduktal levering til individuelle kanaler med levende dyreforsøg. Vi bemærker, at Evans Blå farvestof kortlægger hele ductal træ, herunder de mindste diameter terminal kanaler, mens kontrast reagens og ultralyd kortlægger kun omfatte de større kanaler. En anden forskel er muligheden for at overvåge tidsmæssige dynamik i ultralyd, mens Evans Blå giver kun et enkelt øjebliksbillede måling.

Som i fremgangsmåden til intraduktal levering til gnaver mammary kanalen ^9, den væsentligste udfordring og begrænsning til denne teknik er sandsynligvis den afhængighed af operatørens ekspertise. Men den større størrelse af de duktale åbninger i en kaninmodel forenkler proceduren, eliminerer behovet for at udføreing teknikken ved hjælp af et stereomikroskop, og forkorter den tid, for nye operatører at udvikle færdighed. Det er vores erfaring, injektion af 0,1-0,2 ml saltvand til siden af ​​patten forud for intraduktal levering er et kritisk trin, der muliggør klar visualisering af duktale åbninger (trin 3.2, ovenfor). Præcis positionering og ophævelse af levering site er også vigtigt; dette sikrer, at opløsningen strømmer ind i kanalen (trin 3.5 og 3.6, ovenfor). Vi bemærker, at samtidig administration af kontrastmidlet reagenset nødvendigvis vil reducere den tilgængelige mængde til at teste andre reagenser eller terapi. Imidlertid kan intraduktal levering også udføres uden afbildning eller med simpel inspektion af Evans Blå for at bekræfte leveringen.

Den mest almindelige noninvasive læsion af brystet er duktalt carcinom in situ (DCIS), hvori unormale duktale epitelceller prolifererer inde i bryst-kanalen, men ikke trænge through basalmembranen til det tilstødende væv. Med fremskridt inden for mammografi billedbehandling, har afsløring satser DCIS steget dramatisk. I USA, er ca. 25% af nydiagnosticerede bryst læsioner klassificeret som DCIS, og i 2020 vil mere end 1 million kvinder lever med DCIS i USA alene ^{22, 23, 24, 25.} Men mange DCIS læsioner forbliver hvilende, og de fleste skøn finde, at kun 15-40% ^{21, 22, 23, 24, 25} i DCIS læsioner nogensinde vil udvikle sig til invasiv cancer. Men der er i øjeblikket ingen prædiktive biomarkører til at hjælpe med identifikationen af ​​hvilke tumorer bliver invasiv.

Efterhånden som flere kvinder er diagnosticeret med denne pre-kræft læsion, alvorlige spørgsmål vedrørende over-diagnose og overbehandling er dukket op. Behandlingen af ​​præmaligne sygdom er typisk aggressiv. De fleste patienter med DCIS vil blive opereret (lumpektomi eller mastektomi), og mange får også stråling ^25. Nogle patienter med hormon-receptor-positiv DCIS vil også modtage 5 eller flere års endokrin terapi, som har vist sig at reducere tilbagefald. Bivirkninger af denne behandling kan omfatte slagtilfælde, blodpropper, knogletab, og forhøjede risiko for uterin og livmoderkræft. Alle disse muligheder har alvorlige systemiske bivirkninger og påvirke patientens livskvalitet. Der er et stort behov for mindre invasive terapeutiske strategier ^25.

Den intraduktal afgivelse af kemoterapeutiske midler i både musemodeller og hos brystkræftpatienter har tidligere vist sig at være effektive, uden tegn på systemisk toksicitet eller langsigtede histopatologiske ændringerref "> ^{3, 4, 5, 6.} Den intraduktal administration af terapeutiske kunne en dag tilbyde nye muligheder for kvinder diagnosticeret med DCIS, som endnu ikke nået til et lokalt invasiv læsion. Potentialet for at standse tumorigenese samtidig bevare duktalt struktur gør det en attraktiv terapeutisk strategi ^10. vigtigt er det, den lokaliserede levering fremgangsmåde sikrer, at behandlingen når de relevante unormale celler, mens potentielt minimere sikkerhedsstillelse skader på andre væv. mens kanin tumormodeller ikke er tilgængelige, kan den normale mælkekirtler af kaniner give en relevant model til teste de lokaliserede levering, sikkerhed, transport og kinetik terapi optagelse inden i brystkirtler kanalen. Disse in vivo studier vil gøre det muligt afprøvning og validering af kandidat diagnostik og terapi inden for et relevant væv miljø.

^{8, 9.} Imidlertid anatomi muse brystkirtel afviger fra den humane bryst- i en række vigtige måder, herunder vævet sammensætningen og antallet af kanaler, der ender ved hver patte. Her, vi udvide denne teknik til en større dyremodel, hvor brystepitel- struktur tættere repræsenterer anatomien af den menneskelige bryst ^{12, 14.} Dette åbner mulighed for udvidede overvågning af billeddannelse og til analyse samtidig intraduktal levering af forskellige reagenser til kanin mammary ductal epitel. Fremskridt i lokal afgivelse til en passende dyremodel, med duktalt anatomi som det menneskelige kirtel, bør fremskynde anvendelsen af ​​ikke-invasive, målrettede terapeutiske strategier i mennesker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MicroMarker non-targeted contrast reagent	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 mL Syringes	BD	309628
Glycopyrrolate 0.2 mg/mL	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6 month shelf life, supply may be limited.
Atropine Sulfate 0.5 mg/mL	Animal Health International	15320764	If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate.
Ketamine HCL 100 mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazine 10 mg/mL	Animal Health International	17640541
Xylazine 20 mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbine 0.2 mg/mL	Animal Health International	14588965
Hair Removing Cream	Veet		Sensitive skin solution. Available through local retailers.
Blunt tip infusion needles	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Veterinary Pulse Oximeter	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Warm Water Pump	Gaymar	TP700
Warm Water Blanket	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Warming Pads
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 2100