Introduction
L'importance croissante de l' imagerie par résonance magnétique (IRM) dans le diagnostic clinique, qui est limitée par la sensibilité inhérente de la technique, a entraîné la croissance rapide de la recherche dans le développement de nouveaux agents de contraste à base de gadolinium (GBCAs) 1. GBCAs sont des molécules qui sont administrés pour améliorer la qualité de l' image, et ils ont généralement la structure chimique d'un ion trivalent de gadolinium (Gd 3+) coordonné à un ligand polydenté. Cette complexation est d' une importance critique que non chélaté Gd 3+ est toxique; elle a été impliquée dans le développement d' une fibrose néphrogénique systémique chez certains patients souffrant d'une maladie rénale ou une insuffisance 2. Par conséquent, la détection de l'ion libre aqueuse contribue à assurer la sécurité des GBCAs. La présence de non chélaté Gd 3+ dans des solutions GBCA est souvent le résultat d'une réaction incomplète entre le ligand et l'ion, la dissociation du complexe, ou déplacement par d' autres cations métalliques biologiques 3.
Parmi les différentes techniques actuellement utilisées pour déterminer la présence de Gd 3+, ceux qui comptent sur la chromatographie et / ou spectrométrie de rang le plus élevé en termes de polyvalence et l' applicabilité 4. Parmi les points forts sont une grande sensibilité et la précision, la capacité d'analyser différentes matrices d'échantillons (y compris le sérum humain 5, l' urine et les cheveux 6, les eaux usées 7, et des formulations d'agent de contraste 8), et la quantification simultanée de plusieurs 3+ complexes Gd (une liste des études avant 2013 est décrite dans un examen complet par Telgmann et al.) 4. Le seul inconvénient est que plusieurs de ces méthodes nécessitent instrumentations (telles que la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif) 4 que certains laboratoires ne peuvent pas avoir accès. Dans le contexte de nouvelle découverte GBCA à la recherche et les niveaux de preuve de concept, arProcédé basé spectroscopique-elatively plus commode, rapide et économique (par exemple, l'absorption UV-visible ou de fluorescence) peut servir comme une alternative intéressante. Avec ces applications à l' esprit, un capteur à base d'aptamères-fluorescent pour aqueuse Gd 3+ a été développé 9.
L'aptamère (Gd-aptamère) est une longue molécule d'ADN simple brin 44-base avec une séquence spécifique de bases qui a été isolé à travers le processus d'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) 9. Afin d' adapter l'aptamère dans un capteur fluorescent, un fluorophore est attaché à l'extrémité 5 'du brin, qui est ensuite hybridée avec un brin de trempe (QS) par l' intermédiaire de 13 bases complémentaires (figure 1). QS est marquée avec une molécule de désactivateur noir à l'extrémité terminale 3 '. En l'absence de Gd 3+, le capteur (Gd-capteur), composé d'un rapport 1: Gd-aptamère et QS taupe 2 respectivement, auront un minimum d' émission de fluorescence due to le transfert d'énergie à partir du fluorophore à l'agent de neutralisation. L'addition d' une solution aqueuse Gd 3+ va déplacer le QS à partir du Gd-aptamère, ce qui entraîne une augmentation de l' émission de fluorescence.
Figure 1. Le capteur (Gd-capteur) qui se compose de l'aptamère 44-base longue (Gd-aptamère) marqué avec de la fluorescéine (un fluorophore) et le 13-base à long trempe brin (QS) marqués avec dabcyl (un quencher foncé) . En l'absence de Gd3 + non chélaté, la fluorescence de la sonde est minime. Avec addition de Gd 3+, le déplacement du QS se produit et une augmentation de l' émission de fluorescence est observée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Il est à l'heure actuelle, une méthode basée sur spectroscopique communément utilisé pour détectertion aqueuse 3+ Gd. Cet essai utilise la molécule xylénol orange, qui subit un changement de la longueur d' onde d'absorption maximale de 433 à 573 nm lors de la chélation de l'ion 10. Le rapport de ces deux maxima d' absorbance peut être utilisée pour quantifier la quantité de non chélaté Gd 3+. Le capteur de l'aptamère est une alternative (peut aussi être complémentaire) pour le dosage xylénol orange, alors que les deux méthodes ont différentes conditions de réaction (telles que le pH et la composition des solutions tampons utilisées), les sélectivités cibles, les plages linéaires de quantification et les modalités de détection 9.
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Protocol
NOTE: L'eau moléculaire de qualité biologie est utilisé dans toutes les préparations de tampon et de solution. Tous les tubes jetables (microtubes et PCR) et embouts de pipettes sont DNase et RNase. S'il vous plaît consulter la fiche de données de sécurité (FDS) pour tous les produits chimiques avant de les utiliser. L'utilisation des équipements de protection individuelle (EPI) est fortement recommandé.
1. Préparation des aptamères Stock Solutions
- Achetez 2 brins de polydésoxynucléotide commercialement. Commandez les deux brins avec purification par chromatographie liquide haute performance (CLHP).
Volet 1 (Gd-aptamère):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Volet 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Dissoudre chaque brin dans l'eau pour faire 100 uM individuels solutions mères du Gd-aptamère et QS.
- Conserver ces solutions à -20 ° C. Les solutions sont stables à ce jour, pendant 3 ans.
- Pour minimiser freezcycles e-dégel, stocker les solutions mères à 10 aliquotes ul.
2. Préparation du 2 x Gd capteur Solution
- Préparer le tampon d'essai (HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajuster le pH à ~ 7,4 avec NaOH et HCl, et filtrer à travers des filtres en haut de la bouteille stériles jetables avec 0,2 um membrane PES. Stocker dans des flacons stériles. Si filtrée et stockée correctement (à température ambiante), le tampon est stable jusqu'à présent, pendant 2 ans.
- Diluer 1 pl de la solution Gd-aptamère stock (de l'étape 1.2) et 2 ul de la solution mère QS (de l'étape 1.2) dans 497 pi du tampon de dosage. Bien mélanger à l'aide d'un vortex. Leurs concentrations dans la solution Gd-capteur 2x sont 200 nM et 400 nM, respectivement.
NOTE: Le volume de la solution de Gd-capteur 2x préparé dans cette étape est de 500 ul, ce qui est suffisant pour tester 6 - 7 pour différentes concentrations de Gd 3+ pour la courbe d'étalonnage et des solutions d'agent de contraste(étape 3). Chaque échantillon donnera des puits en double dans une plaque à 384 puits.- Ajuster le volume de la solution de Gd-2x capteur en fonction du nombre de solutions de Gd qui doit être testé.
- Transférer la solution Gd-capteur 2x en 9 tubes PCR, avec 50 ul dans chaque tube. Placer les tubes dans un cycleur thermique.
- Réglez le programme dans le cycleur thermique pour chauffer la solution dans les tubes à 95 ° C, maintenir pendant 5 min, puis refroidir lentement les solutions à 25 ° C pendant environ 15 min (au taux de ~ 0,05 à 0,1 ° C / s). Le cycle de chauffage et de refroidissement est d'assurer une hybridation optimale entre le Gd-aptamère et le QS. résultats d'hybridation partielles trempe incomplète et un arrière-plan supérieur de fluorescence du capteur. Si un cycleur thermique ne sont pas disponibles, mener à bien ce processus en utilisant un bain d'eau chaude à la place.
- Une fois refroidi à 25 ° C, utiliser immédiatement la solution, ou de garder dans le cycleur thermique (jusqu'à environ 2 h) avant d'être prêt à êtreutilisé. Quand un bain d'eau est utilisée pour le chauffage, laisser les tubes dans le bain que l'eau se refroidit lentement à la température ambiante.
3. Construire la courbe d'étalonnage de la fluorescence et de détection de la présence de non chélaté Gd 3+ dans une solution de Gd Agent de contraste
- Dissoudre GdCl 3 solide dans le tampon d'essai (le même tampon que dans l' étape 2.1).
- Grâce à une dilution en série, préparer 100 pi chacun de 6 solutions différentes Gd 3+ dans des tubes de microcentrifugation à deux des concentrations finales désirées pour la courbe d'étalonnage (2x solutions).
- Par exemple, pour construire un étalonnage pour 0 (tampon seul, sans GdCl 3), 50, 100, 200, 400 et 800 nM de Gd 3+, de préparer des solutions contenant 0, 100, 200, 400, 800 et 1 600 nm de l'ion. Assurez - vous d'inclure toujours le «blanc» avec 0 nM Gd 3+ en tant que témoin négatif.
- Dissoudre l'agent de contraste à être testéed dans le tampon d'essai. Préparer 2 ou 3 concentrations différentes des solutions d'agent de contraste par dilution en série.
REMARQUE: Test 3 concentrations différentes de la solution d'agent de contraste est recommandée. Ceci permet d'assurer que ces concentrations se situent dans la plage linéaire. Si les échantillons testés ne pas afficher une relation linéaire, réduisent les concentrations de l'agent de contraste utilisé. - Prenez les tubes PCR contenant la solution 2x Gd-capteur de l'étape 2.5 sur le cycleur thermique.
- Ajouter 50 ul de chaque solution 3+ Gd de l' étape 3.2 dans 6 des tubes PCR 9 contenant la solution 2x Gd-capteur. Mélanger par pipetage de haut en bas. Chaque tube PCR contient maintenant la concentration souhaitée de Gd 3+ à tester, 100 nM Gd-aptamère, et 200 nM QS.
- Les tubes de PCR restant contenant la solution de Gd-capteur 2x, ajouter 50 ul des solutions d'agent de contraste à l'étape 3.3. Bien mélanger en pipetant plusieurs fois.
- Incuber les solutions dans les tubes de PCR pour environ 5 min à température ambiante. Ils peuvent être laissés au repos jusqu'à 30 min.
- Transférer 45 ul de chaque tube dans une plaque à 384 puits. Chaque tube PCR donnera des puits en double.
- Notez la fluorescence de chaque puits sur un lecteur de plaques. Le fluorophore (FAM) utilisé dans la conception Gd-capteur a excitation et d'émission maxima de 495 et 520 nm, respectivement, comme indiqué sur le site Web du fournisseur. Choisissez excitation et d'émission des longueurs d'onde ou des filtres appropriés selon que le lecteur de plaques est monochromator- ou à base de filtre.
- Tracer le graphique de la fluorescence en unités de fluorescence arbitraires (AFU) contre la concentration de Gd 3+.
- Tracer le graphique que le changement de fluorescence de pliage contre la concentration de Gd 3+. Calculer la variation de fluorescence de pli en divisant le AFU de chaque concentration par l'AFU de la solution « en blanc» (avec 0 nM de Gd 3+). Le changement de fluorescence de pliage permettra le normalization des résultats, si l'affichage de certains AFU de périodique (différents jours, etc.) variations.
- Comparer l'émission de fluorescence de la solution contenant l'agent de contraste et le «blanc», ce qui est une solution contenant 0 nM GdCl 3 (tampon uniquement).
REMARQUE: une plus grande fluorescence de la solution GBCA implique la présence de non chélaté Gd3 +, ce qui peut nécessiter une purification supplémentaire de l'agent de contraste. Le montant de la présente de non chélaté Gd peut être estimée en utilisant la courbe d'étalonnage construite à l' étape 3.10 ou 3.11.
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Representative Results
Une variation typique de la fluorescence de la solution de Gd-capteur , en présence de Gd3 + non chélaté est représenté sur la figure 2. L'émission peut être tracée comme la variation de fluorescence de pliage (figure 2A) ou de la fluorescence brute de lecture (figure 2B) en unités arbitraires (AFU). Les deux parcelles donnent des courbes d'étalonnage très similaires avec une gamme linéaire pour des concentrations de Gd 3+ en dessous de 1 uM et la saturation du signal à> 3 uM. La limite de détection est d'environ 100 nm avec un rapport signal sur bruit de 3.
Dans les solutions contenant le GBCA d'intérêt, la présence de non chélaté Gd 3+ sera traduit en une augmentation de la fluorescence du capteur par rapport à la solution « en blanc». Les changements de fluorescence dans des solutions de 2 lots différents de complexe Gd-DOTA, l'un de pureté supérieur à l'autre, sont shown A titre d' exemples représentatifs des résultats (figure 3). Gd-DOTA (acide gadotérique) est un complexe de gadolinium de Gd 3+ entouré d'un DOTA de ligand organique qui se trouve dans un agent de contraste commercial. Le lot de pureté plus élevée ne présente pas une augmentation significative de l'émission jusqu'à 20 mM de Gd-DOTA. Lorsque non chélaté Gd 3+ est présent, un changement qui est perceptible même à des concentrations Gd-DOTA inférieures à 5 mM est observée. Dans cet exemple , lorsque les points de données sont tracées en tant que changement de fluorescence de pliage du capteur, la quantification de la quantité de Gd 3+ non chélaté peut être estimée en utilisant la courbe d'étalonnage sur la figure 2A.
Figure 2. Représentant fluorescence Gd-capteur parcelles de la courbe d'étalonnage. Tous les points de données ont été effectuées au moins en double et la moyenne des valeurs de terrainted avec un écart type que les barres d'erreur. (A) Une courbe d'étalonnage obtenue en utilisant 100 nM Gd-aptamère et 200 nM QS. Le graphique est tracé avec le changement de fluorescence fois que l'axe y. (B) La même courbe d'étalonnage comme en (A) par fluorescence brute en unités arbitraires (AFU) comme l'axe y. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Représentant le changement de fluorescence Gd-capteur pour tester la présence de non chélaté Gd 3+ dans des échantillons de molécule Gd-DOTA. Deux lots différents de solutions complexes Gd-DOTA sont présentés dans ce complot, l' une des plus grande pureté (marqueur de cercle) et l'autre contenant Gd non chélaté 3+ (triangl bleue marqueur). Chaque point de données est une moyenne de deux lectures avec écart-type comme les barres d'erreur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
À l' aide du capteur à base de Gd-aptamère, une augmentation de l' émission de fluorescence qui est proportionnelle à la concentration de Gd3 + non chélaté est observée. Pour minimiser la quantité d'échantillon utilisée, l'essai peut être exécuté dans une microplaque à 384 puits avec un volume d'échantillon total de 45 ul par puits. Dans cette conception, le choix de la fluorescéine (FAM) et dabcyl (Dab) a été principalement basée sur le coût des réactifs; pour modifier la longueur d' onde d'émission, une autre paire de fluorophore et quencher peut être utilisé 11.
Il est important de noter que pour obtenir le meilleur résultat avec le capteur, l'une des étapes critiques est le chauffage à 95 ° C et refroidissement lent (étape 2.4) dans le tampon d'essai pour obtenir une hybridation optimale entre le Gd-aptamère et le QS brins. Comme précédemment mentionné dans le protocole, si un cycleur thermique ne sont pas disponibles, l'incubation à 95 ° C peut être réalisée dans un bain d'eau. Un autre paramètre important à contrôler est le til compositions de solutions tampons; l'utilisation du tampon d'essai figurant à l'étape 2.1 pour dissoudre l'agent de contraste est recommandée, ou de l'eau déminéralisée peut également être utilisé. Cependant, les solutions qui contiennent des interférents potentiels doivent être évités. Un exemple d'un tel tampon est un tampon phosphate contenant des anions qui peuvent coordonner de non chélaté Gd 3+ pour former du phosphate de gadolinium insoluble 12. Le précipité ne réagit pas avec le capteur, ce qui entraîne un résultat faussement négatif.
A quelques pas dans les expériences peuvent être modifiées sans affecter le résultat. Tout d' abord, pour simplifier l'analyse et le calcul, préparer à la fois la solution de Gd-capteur et la solution aqueuse GdCl 3 pour la courbe d'étalonnage à une concentration 2x. Si on le désire, d'autres facteurs de dilution peuvent être utilisés (par exemple, des solutions 10x), pour autant que les concentrations finales d'analyse du Gd-aptamère et QS sont maintenues à 100 nM et 200 nM, respectivement. Deuxièmement, le tampon de dosage does pas être exactement pH 7,4. Toute valeur comprise entre 7 à 7,4 produira l'augmentation de la fluorescence souhaitée, tant que le même tampon est utilisé tout au long de l'expérience. En troisième lieu, une fois que la lecture d'émission de fluorescence est obtenue, les points de données peuvent être tracées soit en tant que fluorescence brute en unité arbitraire (AFU) ou comme le changement de fluorescence de pliage. Pour calculer la variation de fluorescence de pliage, la lecture de fluorescence brute de chaque concentration est normalisée à (divisé par) la lecture du contrôle négatif (0 nM Gd 3+). Comme le montre les figures 2A et B, les tendances d'émission de fluorescence dans les deux parcelles sont presque identiques. Le changement de pli peut être un moyen plus pratique pour analyser les données si le lecteur de plaque affiche quelques variations dans les lectures brutes enregistrées à des moments différents. Enfin, si le laboratoire est équipé d'un fluoromètre, mais pas un lecteur de plaque, chaque point de données peut être mesurée en utilisant une cuvette, au lieu d'une microplaque. En fonction de la taille of les cuvettes disponibles, peuvent être nécessaire d'ajuster les volumes des solutions préparées dans le dosage.
Le procédé rapporté ici fournit une alternative à chromatographic- et / ou des techniques basées sur la spectrométrie permettant de détecter aqueux Gd 3+. Par rapport à celui-ci, le dosage de Gd-capteur est plus limitée en termes de sensibilité, de précision et de capacité pour la détection simultanée de plusieurs espèces. D'autre part, le capteur à base spectroscopique nécessite une instrumentation qui peut éventuellement être plus facilement disponible, peut être effectuée dans un laps de temps plus court et la préparation de l'échantillon est minimale. L'agent de contraste peut être simplement dissous dans de la solution tampon, en mélange avec la solution de Gd-capteur, et l'émission de fluorescence mesurée directement. En outre, le capteur est capable de détecter une concentration beaucoup plus faible de Gd3 + non chélaté que l'indicateur xylénol orange (environ 2 ordres de grandeur de différence entre les deux méthodes) et saune plus grande sélectivité pour le Gd 3+ sur plusieurs autres ions métalliques biologiquement importants et de transition 9.
Il y a deux inconvénients de ce test qui peut limiter son utilisation dans certaines conditions expérimentales. Une limitation est que le capteur ne soit pas spécifique pour Gd 3+; il affiche une réponse à d' autres ions lanthanides (tels que Eu3 + et Tb3 +) 9. Cependant, ce ne sont pas des ions couramment dans les agents de contraste ou des systèmes biologiques et par conséquent leur interférence sont minimes. Le deuxième point à noter est que , à des concentrations plus élevées ( au- dessus ~ 10 uM) de Gd 3+, une diminution progressive du Gd-capteur émission de fluorescence est observée. L'effet de la trempe par des ions de lanthanides est un phénomène bien documenté 13 qui a également été utilisé comme une technique pour détecter et quantifier les 14. Bien que cela limite l'utilité du capteur pour la mesure de fortes concentrations de Gd 3+
Dans ce travail, l'utilisation d'une technique basée sur la fluorescence pratique pour détecter toxiques non chélaté Gd 3+ en solution aqueuse a été décrite. Ce dosage est conçu pour l'évaluation à un stade précoce de la pureté du produit de contraste à base de gadolinium, en particulier lors de la synthèse et de la formulation pour des expériences in vitro. Avec la croissance actuelle de l'imagerie par résonance magnétique dans le diagnostic, un nombre croissant de nouveaux agents de contraste sont continuellement conçu et testé. Le Gd-capteur à base d'aptamères-facilitera ce développement en fournissant un moyen pour détecter rapidement la présence de concentrations sous-micromolaires de qui n'a pas réagi ou dissocié Gd 3+ en solution aqueuse à pH ambiant. En outre, étant donné que le capteur présente une réactivité croisée avec d'autres ions de lanthanide trivalent, son application peut êtreétendue à ces domaines de recherche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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