Introduction
Возрастающее значение магнитно - резонансной томографии (МРТ) в клинической диагностике, которая ограничена присущей чувствительности метода, привело к быстрому росту исследований в области разработки новых гадолиния основе контрастных агентов (GBCAs) 1. GBCAs представляют собой молекулы, которые вводят для улучшения качества изображения, и они , как правило , имеют химическую структуру трехвалентного иона гадолиния (Gd 3+) координирован с полидентатным лигандом. Это комплексообразование имеет решающее значение как нехелатированной Gd 3+ является токсичным; он участвует в развитии нефрогенной системного фиброза у некоторых больных с почечной недостаточностью или недостаточностью 2. Следовательно, обнаружение водного свободного иона играет важную роль в обеспечении безопасности GBCAs. Присутствие нехелатированной Gd 3+ в растворах GBCA часто является результатом неполной реакции между лигандом и ионом, диссоциации комплекса или displacemenт других биологических катионов металлов 3.
Среди нескольких методов , используемых в настоящее время для определения присутствия Gd 3+, те , которые полагаются на хроматографии и / или спектрометрического ранга высшей точки зрения универсальности и применимости 4. Среди их сильные стороны являются высокая чувствительность и точность, возможность анализа различных матриц проб ( в том числе сыворотки человека 5, мочи и волос 6, 7 сточной воды, а также композиций , агентов контрастных 8), а также одновременного количественного определения нескольких 3+ комплексов Gd (листинг исследований до 2013 года описана в комплексном обзоре Telgmann и др.) 4. Единственным недостатком является то, что некоторые из этих методов требует контрольно- измерительные приборы (например, с индуктивно связанной плазмой масс - спектрометрии) 4 , что некоторые лаборатории не могут иметь доступ. В контексте нового открытия GBCA на исследования и доказательство правильности концепции уровней, арelatively более удобный, быстрый и экономически эффективный метод спектроскопического основе (например, УФ-Vis поглощения или флуоресценции), может служить ценным альтернативой. С помощью этих приложений в виду, флуоресцентный аптамеры на основе датчика для водного раствора Gd 3+ был разработан 9.
Аптамеров (Gd-аптамеров) представляет собой 44-щелочное долго одноцепочечной молекулой ДНК с определенной последовательностью оснований, выделенный в процессе систематического выделение лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) 9. Для адаптации аптамер в флуоресцентным датчиком, флуорофор присоединен к концу 5 'нити, которая затем гибридизуют с жаждоутоляющей нити (QS) через 13 дополнительных оснований (рисунок 1). QS помечен темной молекулой гасителя на 3'-конца. При отсутствии Gd 3+, датчик (Gd-сенсор), состоящий из соотношении 1: 2 моль Г.Д.-аптамеров и QS соответственно будут иметь минимальное излучение флуоресценции из - за тпередача энергии от о флуорофора к гасителя. Добавление водного раствора Gd 3+ сместит QS из Gd-аптамеров, что приводит к увеличению флуоресцентной эмиссии.
Рисунок 1. Датчик (Gd-сенсор) , который состоит из 44-основания длинной аптамеров (Gd-аптамеров) метили флуоресцеина (флуорофор) и 13-база длиной цепи закалки (QS) помеченным dabcyl (темный гасителя) , При отсутствии нехелатированной Gd 3+, флуоресценция датчика минимальна. С добавлением Gd 3+, смещение QS происходит и наблюдается увеличение эмиссии флуоресценции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Существует в настоящее время широко используется один спектроскопического основе метод обнаруженияИНГ водного Gd 3+. В этом анализе используют молекулу ксиленоловым апельсин, обнаруживающая сдвиг максимума длины волны поглощения от 433 до 573 нм при хелятации к иону 10. Отношение этих двух максимумов поглощения могут быть использованы для определения количества нехелатированной Gd 3+. Датчик аптамеров является альтернативой (также может быть комплементарной) к ксиленол оранжевого анализа, поскольку эти два метода имеют разные условия реакции (например, рН и состав буферных растворов, используемых), задачи селективностью, линейные диапазоны количественной оценки, а также методов обнаружения 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Молекулярная биология класс вода используется во всех буферных растворов и препаратов. Все одноразовые трубки (микроцентрифужных и ПЦР) и пипетки советы DNase- и РНКазы. Пожалуйста, обратитесь к листам безопасности (MSDS) для всех химических веществ перед использованием. Использование соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ) настоятельно рекомендуется.
1. Приготовление аптамера маточные растворы
- Покупка 2 пряди polydeoxynucleotide на коммерческой основе. Заказать обе нити с очисткой с помощью высокой жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Strand 1 (GD-аптамер):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Strand 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Растворить каждую прядь в воде, чтобы сделать 100 мкМ индивидуальных исходных растворов GD-аптамеров и СМО.
- Храните эти решения при -20 ° С. Растворы стабильны до сих пор, в течение 3-х лет.
- Чтобы свести к минимуму FREEZЦиклы электронной оттаивание, хранить растворы в 10 мкл аликвоты.
2. Подготовка 2x Gd-датчика решения
- Подготовка буфера для анализа (20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl 2, 150 мМ NaCl, 5 мМ КСl). Доводят рН до ~ 7,4 с помощью NaOH и HCl, и фильтруют через стерильные одноразовые бутылки верхних фильтров с ПЭС 0,2 мкм мембраны. Хранить в стерильные бутылки. Если фильтруется и хранится надлежащим образом (при комнатной температуре), буфер стабилен до сих пор, в течение 2-х лет.
- Развести 1 мкл Б-г-аптамеров маточного раствора со стадии (1.2) и 2 мкл исходного раствора QS (со стадии 1.2) в 497 мкл буфера для анализа. Хорошо перемешать с помощью вихря. Их концентрации в растворе Б-г-датчика 2x 200 нм и 400 нм, соответственно.
Примечание: Объем раствора Gd-датчика 2x полученное на этом этапе составляет 500 мкл, что достаточно для тестирования 6 - 7 различные концентрации Gd 3+ для калибровочной кривой и решений контрастирующего агента(шаг 3). Каждый образец даст повторяющиеся скважины в 384-луночного планшета.- Отрегулируйте объем раствора Gd-датчика 2x в соответствии с количеством Gd 3+ решений , которые должны быть проверены.
- Переносят раствор Gd-датчика 2x на 9 ПЦР-пробирки с 50 мкл в каждую пробирку. Место труб в амплификатор.
- Установите программу в термоциклеру для нагрева раствора в трубах до 95 ° С, в течение первых 5 мин, а затем медленно охлаждают растворов до 25 ° С в течение ~ 15 мин (со скоростью ~ 0,05 - 0,1 ° С / с). Нагрева и охлаждения цикла для обеспечения оптимальной гибридизации между Gd-аптамеров и СМО. Частичные результаты гибридизации в неполной закалке и более высокой фоновой флуоресценции датчика. Если амплификатор не доступен, осуществить этот процесс, используя ванну с горячей водой вместо этого.
- После охлаждения до 25 ° С, немедленно использовать раствор, или держать в термоциклеру (приблизительно до 2 ч) до полной готовности, чтобы бытьиспользуемый. Когда ванна вода используется для отопления, оставьте трубки в ванне, поскольку вода медленно остывает до комнатной температуры.
3. Построение калибровочной кривой флуоресценции и обнаружения присутствия нехелатированной Gd 3+ в растворе Gd контрастного агента
- Растворите GDCL 3 Твердое вещество в буфере для анализа ( один и тот же буфер , как на шаге 2.1).
- Через серийного разведения, готовят 100 мкл каждого из 6 различных Gd 3+ растворов в микроцентрифужных пробирках при двукратном конечных желательных концентраций для калибровочной кривой (2x решений).
- Например, чтобы построить калибровку для 0 (буфер только не GdCl 3), 50, 100, 200, 400 и 800 нМ Gd 3+, готовят растворы , содержащие 0, 100, 200, 400, 800 и 1600 нМ иона. Убедитесь в том , чтобы всегда включать 'пустой' с 0 нМ Gd 3+ в качестве отрицательного контроля.
- Растворить контрастное вещество, чтобы быть тестэд в буфере для анализа. Подготовьте 2 или 3 различных концентраций растворов контрастного агента через серийного разведения.
Примечание: Тестирование 3 различных концентраций раствора контрастного вещества рекомендуется. Это должно гарантировать, что эти концентрации в пределах линейного диапазона. Если испытанные образцы не показывают линейную зависимость, уменьшить концентрации контрастного агента. - Возьмите пробирки для ПЦР, содержащих раствор 2x Gd-датчика со стадии 2.5 из термоциклеру.
- Добавьте 50 мкл каждого раствора Gd 3+ со стадии 3.2 в 6 из 9 ПЦР - пробирки , содержащие раствор 2x Gd-датчика. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Каждая трубка ПЦР теперь содержит требуемую концентрацию Gd 3+ быть испытанным, 100 нм GD-аптамер и 200 нм QS.
- Для остальных пробирки для ПЦР, содержащих раствор Б-г-датчика 2x, добавить 50 мкл растворов контрастирующего агента с шага 3.3. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Инкубируйте Solutions в пробирки для ПЦР в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре. Они могут быть оставлены стоять в течение до 30 мин.
- Перенесите 45 мкл в каждую пробирку в 384-луночный планшет. Каждая трубка ПЦР дает дублированные лунки.
- Регистрируют флуоресценции каждой лунки на тарелке читателя. Флуорофор (FAM), используемый в конструкции Б-датчика имеет возбуждения и испускания максимумов 495 и 520 нм соответственно, как указано на сайте поставщика. Выберите соответствующие возбуждения и эмиссии длин волн или фильтров в зависимости от того, планшет-ридер является monochromator- или фильтр на основе.
- Постройте график флуоресценции в произвольных единицах флуоресценции (AFU) против концентрации Gd 3+.
- Постройте график , как изменение флуоресценции раза по сравнению с концентрацией Gd 3+. Рассчитать изменение флуоресценции раза путем деления AFU каждой концентрации в ВСУ от "чистого" решения (с 0 нМ Gd 3+). Изменение флуоресценции раза позволит пormalization результатов, должны ли дисплей AFU некоторые периодические ( в разные дни и т.д.) вариации.
- Сравните флуоресценции раствора , содержащего контрастный агент и "пустым", который является раствор , содержащий 0 нМ GDCL 3 (только буфер).
Примечание: Чем выше флуоресценции раствора GBCA подразумевает наличие нехелатированной Gd 3+, которые могут потребовать дальнейшей очистки контрастного агента. Количество нехелатированной Gd 3+ настоящее время может быть оценена с помощью калибровочной кривой , построенную на этапе 3.10 или 3.11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичное изменение флуоресценции раствора Gd-датчика в присутствии нехелатированной Gd 3+ показана на рисунке 2. Излучение может быть нанесены в виде изменения флуоресценции кратному (фиг.2А) , или сырой флуоресценции чтения (Фигура 2В) в произвольных единицах (АФУ). Оба участка дают очень близкие калибровочные кривые с линейным диапазоном для концентрации Gd 3+ ниже 1 мкМ и насыщения сигнала при> 3 мкм. Предел обнаружения составляет ~ 100 нм с отношением сигнал-шум 3.
В растворах , содержащих GBCA интерес, наличие нехелатированной Gd 3+ будет переведен на увеличение флуоресценции датчика по сравнению с «пустой» решения. Изменения флуоресценции в растворах 2-х разных партий Gd-DOTA комплекс, один из более высокой чистоты, чем с другой, являются шоуп в качестве примеров репрезентативных результатов (рисунок 3). Gd-DOTA (gadoteric кислота) представляет собой гадолиний комплекс Gd 3+ окружен органическим лигандом DOTA , который находится в коммерческом контрастного агента. Партия более высокой чистоты не показывает значительное увеличение выбросов до 20 мМ Gd-DOTA. Когда нехелатированной Gd 3+ присутствует, наблюдается изменение , которое заметно даже при концентрациях , Gd-DOTA ниже 5 мМ. В этом примере , где точки данных построен график зависимости изменения флуоресценции кратном датчика, количественное определение количества нехелатированной Gd 3+ может быть оценена с помощью калибровочной кривой на рисунке 2А.
Рисунок 2. Типичные Gd-датчик флуоресценции калибровочной кривой участков. Все данные точки были выполнены, по крайней мере в двух повторах и средние значения участкаTed со стандартным отклонением, как и погрешностями. (A) калибровочной кривой , полученной с использованием 100 нМ GD-аптамер и 200 нм QS. График строится с изменением флуоресценции раза по оси у. (В) Та же калибровочной кривой , как в (а) , с сырой флуоресценции в произвольных единицах (AFU) в качестве оси у. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель изменения Gd-датчик флуоресценции при тестировании на наличие нехелатированной Gd 3+ в образцах молекулы Gd-DOTA. Две различные партии Gd-DOTA комплексных решений показаны на этом графике, одна из более высокой чистоты (круг маркер) и другой , содержащей нехелатированной Gd 3+ (синий trianglе маркер). Каждая точка данных представляет собой среднее значение двух измерений со стандартным отклонением, как и погрешностями. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование аптамеров на основе Gd-сенсор, увеличение эмиссии флуоресценции, которая пропорциональна концентрации нехелатированной Gd 3+ наблюдается. Для того, чтобы свести к минимуму количество используемого образца, анализ может выполняться в микропланшет 384-луночного с общим объемом образца 45 мкл на лунку. В этой конструкции, выбор флуоресцеина (FAM) и dabcyl (Dab) была в основном основана на стоимости реагентов; для изменения длины волны излучения, другую спаривание флуорофором и гасителем может быть использовано 11.
Важно отметить, что для получения наилучшего результата с датчиком, одним из важных этапов является нагревание до 95 ° С и медленным охлаждением (шаг 2,4) в буфере для анализа с целью достижения оптимальной гибридизации между Gd-аптамеров и QS пряди. Как упоминалось ранее в протоколе, если амплификатор не доступен, инкубация при 95 ° С может быть проведена в водяной бане. Другим ключевым параметром для управления является тон Композиции из буферных растворов; использование буфера для анализа, указанного в шаге 2.1, чтобы растворить контрастное вещество рекомендуется, или деионизированная вода также может быть использован. Тем не менее, растворы, которые содержат потенциальные мешающих его следует избегать. Примером такого буфера является тот , который содержит фосфат - анионы, которые могут координатные к нехелатированной Gd 3+ с образованием нерастворимого фосфата гадолиния 12. Осадок не вступает в реакцию с датчиком, в результате ложного отрицательного результата.
Несколько шагов в экспериментах, могут быть изменены без влияния на результат. Во- первых, для упрощения анализа и расчета, готовят как раствор Б - г-датчика и водной GDCL 3 для калибровочной кривой при концентрациях 2x. При желании, другие коэффициенты разбавления могут быть использованы (например, 10x растворы), при условии, что конечные концентрации Количественный анализ Gd-аптамеров и СМО поддерживают при 100 нМ и 200 нМ, соответственно. Во-вторых, буфер для анализа гOES не должны быть точно рН 7,4. Любое значение в пределах от 7 - 7.4 произведут необходимое повышение флуоресценции, до тех пор, как тот же буфер используется в течение всего эксперимента. В-третьих, как только получают показание флуоресцентное излучение, точки данных могут быть нанесены либо как сырой флуоресценции в произвольной единицы (ФФА), либо как изменение флуоресценции кратном. Для того, чтобы вычислить изменение флуоресценции раза, сырой чтение флуоресценции каждой концентрации нормированы (делится на) чтение отрицательного контроля (0 нМ Gd 3+). Как показано на фигурах 2А и В, тенденции выбросов флуоресценции в обоих графиках практически идентичны. Изменение раз может быть более удобным способом для анализа данных, если ридер отображает некоторые изменения в исходных показаний, записанных в разное время. И, наконец, если лаборатория оснащена флуорометре, но не ридере, каждая точка данных может быть измерена с помощью кювету, вместо микропланшет. В зависимости от размера Oе имеющихся кюветах, объемы растворов, приготовленных в анализе может потребоваться корректировка.
Метод сообщаемые здесь является альтернативой chromatographic- и / или спектрометрические на основе методики обнаружения водного Gd 3+. По сравнению с последним, анализ Gd-датчик более ограничен с точки зрения чувствительности, точности и способности для одновременного определения нескольких видов. С другой стороны, датчик спектроскопического основе требует инструментов, которые могут быть, возможно, более легко доступны, может быть выполнена в течение более короткого периода времени, а подготовка образца минимальна. Контрастное вещество может быть просто растворили в буферном растворе, смешивают с раствором Б-датчика, и флуоресцентное излучение непосредственно измерены. Кроме того, датчик способен обнаруживать гораздо более низкую концентрацию нехелатированной Gd 3+ , чем индикатор ксиленол оранжевый (около 2 порядка величины разницы между этими двумя методами) и имеетболее высокая селективность для Gd 3+ в течение нескольких других биологически важных и переходных ионов металлов 9.
Есть два недостатка этого анализа, которые могут ограничить его использование при некоторых экспериментальных условиях. Одно ограничение заключается в том , что датчик не является специфическим для Gd 3+; он отображает ответ на другие ионы лантанидов (например, Eu 3+ и Tb 3+) 9. Тем не менее, они не являются ионы обычно встречаются в контрастных агентов или биологических систем и, следовательно, их вмешательство минимальны. Второй момент , следует отметить, что при более высоких концентрациях (выше ~ 10 мкМ) Gd 3+, постепенное уменьшение эмиссии флуоресценции Gd-датчика наблюдается. Эффект закалке ионами лантанидов является хорошо документированы явление 13 , который также используется в качестве методики для обнаружения и количественной оценки их 14. В то время как это ограничивает полезность датчика для измерения высоких концентраций Gd 3+
В этой работе, использование удобного флюоресценции на основе методики обнаружения токсичного нехелатированной Gd 3+ в водном растворе было описано. Этот анализ предназначен для оценки на ранней стадии гадолиния на основе чистоты контрастного агента, в частности , в процессе синтеза и разработки для проведения экспериментов в лабораторных условиях . С ростом тока магнитно-резонансной томографии в диагностике, все большее число новых контрастных агентов постоянно разрабатываются и тестируются. Аптамеры на основе Б - г-датчик будет способствовать этому развитию, обеспечивая средство для быстрого обнаружения присутствия суб-микромолярную концентраций непрореагировавшего или диссоциированы Gd 3+ в водном растворе при комнатной рН. Кроме того, так как датчик показывает перекрестную реактивность с другими ионами трехвалентных лантанидов, ее применение может бытьраспространялась на эти области исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
- Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).
- Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).
- Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).
- Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
- Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).
- Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).
- Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).
- Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).
- Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).
- Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).
