Introduction
在临床诊断中，这是由该技术的固有敏感性限制磁共振成像（MRI）的重要性日益增加，已导致在研究的快速增长到新的基于钆的造影剂（GBCAs）1的开发。 GBCAs是被给药，以提高图像质量的分子，并且它们通常具有配位的多齿配体的三价钆离子（钆3+）的化学结构。这络合作为未螯合的Gd 3+是有毒至关重要;它已经牵涉于肾源性系统纤维化的一些患者的肾疾病或衰竭2的开发。因此，检测该水性自由离子是确保GBCAs的安全工具。未螯合的Gd 3+的GBCA溶液存在往往是在配体和离子的复合物的解离，或者displacemen之间不完全反应的结果其他生物金属阳离子3吨 。
在目前用于确定的Gd 3+，那些在通用性和适用性4方面依靠色谱法和/或光谱法秩最高的存在下的几种技术。在他们的优势是较高的灵敏度和准确度，分析各种样品基质（包括人血清5，尿液和头发6，废水7和造影剂配方8），和多个钆3+络合物的同时定量（一个列表的能力的研究之前，2013是在全面审查Telgmann 等人 ）4所述。唯一的缺点是，一些这些方法需要仪器仪表（如电感耦合等离子体质谱）4，一些实验室可能无法访问。在小说GBCA发现在研究和论证的概念层面，AR上下文elatively更方便，快速和成本有效的基于分光法（如紫外吸收或荧光）可以作为一种有价值的替代。考虑到这些应用中，水的Gd 3+的荧光基于适体的传感器被开发9。
适体（钆适体）是与通过指数富集（SELEX）9的配体的系统进化的过程中分离出的碱基序列特异性的44碱基长的单链DNA分子。适应适体为荧光传感器，荧光团被连接到线料，然后将其与经由13互补碱基（ 图1）淬火链（QS）杂交的5'末端。了QS标记有在3'末端的暗淬灭剂分子。在不存在的Gd 3+，所述传感器（钆传感器）的，由1：分别钆适体和QS的2摩尔比，将具有最小的荧光发射是由于吨从荧光基团淬灭Ø能量转移。在加入含水的Gd 3+的将从钆适体置换的QS，从而增加荧光发射。
图 1. 传感器（GD-传感器），由标有荧光素（荧光基团），并标有DABCYL 13个碱基长的淬链（QS）的44个碱基长的适体（GD-适体）（暗淬灭剂）的。在不存在未螯合的Gd 3+的，传感器的荧光是最小的。与另外的Gd 3+的，发生的QS位移和增加的荧光发射是观察。 请点击此处查看该图的放大版本。
有目前，人们常用的基于分光法检测ING水的Gd 3+。该测定使用了分子二甲酚橙，其经历在其最大吸收波长从433至573纳米时螯合离子10的换档。这两个最大吸收的比率可以用来量化未螯合的Gd 3+的量。适体传感器是一种替代（也可以是互补的），以在二甲酚橙法，因为这两种方法具有不同的反应条件（如pH值和所使用的缓冲溶液的组合物），目标的选择性，定量的线性范围，和检测方式9。
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Protocol
注：分子生物学级水在所有的缓冲和解决方案的准备工作时使用。所有一次性管（离心及PCR）和枪头是DNase-和无RNA酶的。请咨询使用前的所有化学品的材料安全数据表（MSDS）。强烈推荐合适的个人防护装备（PPE）的使用。
1.适体母液的制备
- 购买2股多脱氧核苷酸的市场。通过高效液相色谱法（HPLC）命令与纯化两条链。
串1（GD-适体）：
5' - / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
链2（QS）：
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3' - 溶解每条链在水中使钆适体和的QS100μM的个别储备溶液。
- 存放于-20°C这些解决方案。该溶液是稳定的迄今，为3年。
- 为了尽量减少FREEZ电子解冻周期，存储解决方案，股价在10微升等分。
2. 2倍的Gd-传感器溶液的制备
- 制备测定缓冲液（20mM HEPES，2mM的MgCl 2的，150毫摩尔NaCl，5mM的KCl）中。调整用NaOH和HCl pH值至7.4〜，并通过一次性无菌瓶顶过滤器具有0.2微米PES膜过滤器。存放在无菌瓶中。如果过滤，并妥善保存（在常温下），缓冲稳定到目前为止，2年。
- 稀释钆适体原液（从步骤1.2）在测定缓冲液497微升和QS原液（从步骤1.2）的2微升1微升。拌匀，用旋涡。其在2×钆传感器溶液浓度是200和400nm，分别。
注意：在此步骤中制备的2倍的Gd-传感器溶液的体积为500微升，这是足以测试6 - 7不同浓度的Gd 3+的校准曲线和造影剂溶液（步骤3）。每个样品将在384孔板给复孔。- 根据需要被测试的Gd 3+解的数目调整2倍的Gd-传感器溶液的体积。
- 转移2×钆传感器溶液到9的PCR管，用50微升到每个管中。放置管在热循环仪。
- 在热循环仪设置程序以加热在管至95℃的溶液中，保持5分钟，然后经〜15分钟缓慢地冷却该溶液至25℃（以速率〜0.05 - 0.1℃/ S）。加热和冷却循环是确保钆适体和QS之间最佳杂交。部分杂交结果不完全淬火和传感器的一个更高的背景荧光。如果热循环仪是不可用，进行利用热水浴代替这个过程。
- 一旦冷却到25℃，立即使用该溶液，或保持在热循环仪（最高达约2小时），直到准备好是用过的。当水浴用于加热，离开该管在浴中当水慢慢冷却到室温。
3.构建荧光校准曲线和钆造影剂的溶液检测未螯合GD的存在3+
- 溶解GdCl 3在测定缓冲液固体（相同的缓冲液如在步骤2.1）。
- 通过连续稀释，在最终所需浓度的校准曲线（2×溶液）的双制备各6个不同的Gd 3+在微量离心管溶液100微升。
- 例如，为了构建一个校准为0，50，100，200，400（仅无GdCl 3缓冲液），和钆3+为800nm，制备含有0，100，200，400，800，和1600纳米的解决方案的离子。确保始终包括“空白”0纳米的Gd 3+作为阴性对照。
- 溶解造影剂是测试编在测定缓冲液中。准备2个或3个不同的浓度通过连续稀释的造影剂的解决方案。
注：测试3种不同浓度造影剂溶液的建议。这是为了确保这些浓度的线性范围内。如果测试没有显示线性关系的样品中，减少造影剂的浓度使用。 - 服用含有从步骤2.5 2倍的Gd-传感器解决方案出来的热循环仪的PCR管。
- 添加来自步骤3.2的每个的Gd 3+溶液的50微升到含有2倍的Gd-传感器溶液9 PCR管6。吹打向上和向下混合。每个PCR管现在包含钆3+的所需浓度进行测试，100nM的钆适体，和200nM的QS。
- 到含有2倍的Gd-传感器溶液剩余的PCR管，从步骤3.3添加造影剂溶液的50微升。通过上下吹打几次拌匀。
- 孵育在Solutions在PCR管在室温下约5分钟。它们可以被放置长达30分钟。
- 传送每个管的45微升到384孔板中。每个PCR管会给重复孔中。
- 记录的每个孔中的荧光在平板阅读器。在GD-传感器设计中使用的荧光团（FAM），分别有495和520 nm的激发和发射最大值，对供应商的网站上所列出。选择取决于在板阅读器是否monochromator-或基于过滤器的合适的激发和发射波长或过滤器。
- 绘制荧光任意荧光单位（AFU）对钆3+的浓度曲线图。
- 画出图作为对抗的Gd 3+的荧光浓度倍数变化。由“空白”解决方案的AFU（0纳米的Gd 3+）将每个浓度的AFU计算荧光倍数变化。荧光倍数变化将使n个结果ormalization，应AFU显示一些周期性的（不同天等 ）的变化。
- 比较含有造影剂的溶液和“空白”，它是含0纳米GdCl 3（仅缓冲）该溶液的荧光发射。
注：GBCA溶液的更高的荧光意味着未螯合的Gd 3+的存在，这可能需要造影剂的进一步纯化。未螯合的Gd 3+的存在量可以利用在步骤3.10或3.11构建的校准曲线来估算。
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Representative Results
在未螯合的Gd 3+的存在下的Gd-传感器溶液的典型荧光变化示于图2。发射可被绘制为荧光倍数变化（ 图2A）或在原始荧光读数（ 图2B）以任意单位（AFU）。两条曲线在> 3μM收率低于1μM和饱和信号的线性范围为钆浓度3+非常相似的校准曲线。检测限为〜100纳米带3的信噪比。
在含有感兴趣的GBCA溶液，未螯合的Gd 3+的存在将被翻译成的传感器的荧光增加时相比，“空白”的解决方案。在钆DOTA复杂，比其他更高纯度之一的2个不同批次的解决方案的荧光的变化，是显示n作为的代表性结果的例子（ 图3）。钆DOTA（gadoteric酸）是钆的钆络合物3+由在市售的造影剂中的有机配位体的DOTA包围。较高纯度的批料不显示在排放到钆DOTA的20mm的显著增加。当未螯合的Gd 3+存在，这一变化是明显的，即使在低于5毫米的Gd-DOTA浓度观察。在本实施例，其中数据点被绘制作为传感器的荧光的倍数变化，未螯合的Gd 3+的量的定量可以使用图2A中的校准曲线来估算。
图2. 代表钆荧光传感器的校准曲线图。至少在重复进行所有的数据点，平均值情节泰德与标准偏差为误差线。使用100纳米的Gd-适体和200纳米QS（A）得到的校正曲线。图形绘制荧光倍数变化为y轴。 （B）相同的校正曲线中（A）和以任意单位（AFU）为y轴原始荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
在钆DOTA分子的样品 测试未螯合的Gd 3+ 的存在下时 图3 代表钆传感器荧光变化 。钆DOTA复杂的解决方案的两个不同批次示于该图，更高的纯度（圆标记），另一种含有未螯合的Gd 3+中的一个（蓝色trianglË标记）。每个数据点是两次读数与标准偏差作为误差线的平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
使用基于适体的Gd-传感器，荧光发射的增加正比于观察未螯合的Gd 3+的浓度。为了最大限度地减少样品的使用量，该测定可以在384孔微量板以每孔45微升总样品体积运行。在此设计中，荧光素（FAM）和DABCYL（DAB）的选择主要基于试剂的成本;修改发射波长的荧光团不同的配对和猝灭剂，可以使用11。
要注意的是，以获得与该传感器最好的结果是很重要的，过程的关键步骤是在该测定缓冲液加热至95℃，并缓慢冷却（步骤2.4）来实现的Gd-适体和QS之间最佳杂交链。如先前在协议中提到，如果一个热循环仪是不可用，在95℃下温育可以在水浴中进行。控制另一个关键参数为t他组成的缓冲溶液;建议使用在步骤2.1以溶解造影剂所列出的测定缓冲液中，或者也可以使用去离子水。然而，应避免含有潜在干扰物的解决方案。这样的缓冲液的一个例子是一个包含磷酸根阴离子，其可以协调对未螯合的Gd 3+形成不溶性的钆磷酸盐12。该沉淀物将不与传感器反应，导致假阴性结果。
在实验中的一些步骤可以在不影响的结果进行修改。首先，为了简化分析和计算，需准备的Gd-传感器溶液和GdCl 3为以2倍浓度的校准曲线含水两者。如果需要的话，其它的稀释因子可以被使用（例如，10倍溶液），条件是钆适体的最终测定浓度和QS分别保持在100纳米和200纳米。第二，该测定缓冲液DOES不必是准确的pH 7.4。 7之间的任何值 - 7.4将产生所需的荧光增加，只要相同的缓冲液在整个实验中使用。第三，一旦获得荧光发射读数，数据点可被绘制或者作为在任意单位（AFU）原始荧光或荧光的倍数变化。计算荧光倍数变化，各浓度的原始荧光读数标准化为（除以）阴性对照（0纳米的Gd 3+）的读取。如在图2A和B中所示，在两个重复的荧光发射的趋势是几乎相同的。倍数变化可以是对数据进行分析的更方便的方法，如果板器显示在记录在不同的时间原始读数的一些变化。最后，如果实验室装备有荧光计，但不是一个读板器中，每个数据点可以使用比色皿测定，代替微板。根据大小OF中的可用的试管，在测定制得的溶液的体积，可能需要进行调整。
本文所报道的方法提供了一种替代chromatographic-和/或用于检测水的Gd 3+基于光谱的技术。相比于后者，钆传感器测定是在对多个物种的同时检测灵敏度，准确度和能力方面的更多的限制。另一方面，基于分光传感器需要的仪表可能可能是更容易获得，可以在更短的时间内进行，样品的准备是最小的。造影剂可以简单地溶解在缓冲溶液中，用钆传感器溶液混合，并直接测量荧光发射。此外，传感器能够检测未螯合的Gd的低得多的浓度3+比二甲酚橙指示剂（约2个数量的两种方法之间数量级的差别），并具有一对于钆3+几个其他重要的生物和过渡金属离子9较高的选择性。
有该测定可能限制某些实验条件下它的使用的两个缺点。一个限制是，该传感器不是特定为钆3+;其显示给其他镧系元素离子（如铕和铽 ）9的响应。然而，这些都不是在造影剂通常发现或离子的生物系统，因此，它们的干扰是最小的。第二点要注意的是，在较高浓度（大于〜10μM）的Gd 3+，在钆传感器荧光发射逐渐降低的观察。淬火通过镧系元素离子的效果是，也被用作用于检测和定量这些14的技术的详细记录现象13。而这限制了传感器的效用，用于测量高浓度的Gd 3+
在这项工作中，使用了在水溶液中检测的毒性未螯合的Gd 3+的便利基于荧光的技术已被描述。该测定是为基于钆的造影剂纯度的早期阶段的评价，特别是在合成和配制用于体外实验。在诊断的磁共振成像的当前的增长，越来越多的新的造影剂的不断被设计和测试。基于核酸适体的Gd-传感器将通过提供一种用于在环境pH值快速检测的未反应或解离的Gd 3+水溶液亚微摩尔浓度的存在的手段促进这一发展。此外，由于传感器显示交叉反应性与其他的三价镧系元素离子，其应用可以是扩展到这些研究领域。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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