Summary
Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.
Abstract
Die Entdeckung von zelltypspezifischen Markern kann Einblicke in die zelluläre Funktion und die Ursprünge der zellulären Heterogenität geben. Mit einem jüngsten Push für das verbesserte Verständnis der neuronalen Vielfalt ist es wichtig, Gene zu identifizieren, deren Ausdruck verschiedene Subpopulationen von Zellen definiert. Die Netzhaut dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der zentralen Nervensystem-Vielfalt, da sie aus mehreren Hauptzelltypen besteht. Die Untersuchung jeder Hauptklasse von Zellen hat genetische Marker ergeben, die die Identifizierung dieser Populationen erleichtern. Allerdings gibt es mehrere Subtypen von Zellen innerhalb jeder dieser großen retinalen Zellklassen, und wenige dieser Subtypen haben genetische Marker bekannt, obwohl viele durch Morphologie oder Funktion charakterisiert wurden. Eine Kenntnis von genetischen Markern für einzelne retinale Subtypen würde die Untersuchung und Kartierung von Hirnzielen ermöglichen, die sich auf spezifische visuelle Funktionen beziehen und auch einen Einblick in die Gennetze vermitteln könnenPflegen zelluläre Vielfalt. Die gegenwärtigen Wege, die verwendet wurden, um die genetischen Marker von Subtypen zu identifizieren, besitzen Nachteile, wie die Klassifizierung von Zelltypen nach der Sequenzierung. Dies stellt eine Herausforderung für die Datenanalyse dar und erfordert rigorose Validierungsmethoden, um sicherzustellen, dass Cluster Zellen der gleichen Funktion enthalten. Wir schlagen eine Technik zur Identifizierung der Morphologie und Funktionalität einer Zelle vor der Isolierung und Sequenzierung vor, die eine leichtere Identifizierung von subtypspezifischen Markern ermöglicht. Diese Technik kann auf nicht-neuronale Zelltypen sowie auf seltene Populationen von Zellen mit geringfügigen Variationen erweitert werden. Dieses Protokoll liefert hervorragende Daten, da viele Bibliotheken Lese-Tiefen von mehr als 20 Millionen Lesungen für einzelne Zellen zur Verfügung gestellt haben. Diese Methodik überwindet viele der Hürden, die von Single-Cell RNA-Seq präsentiert werden, und kann für Forscher geeignet sein, die darauf abzielen, Zelltypen auf einfache und hocheffiziente Weise zu profilieren.
Introduction
Die neuronale Diversität wird im gesamten Zentralnervensystem beobachtet, insbesondere in der Wirbeltierhaut, ein hochspezialisiertes Gewebe, bestehend aus 1 glialen und 6 neuronalen Zelltypen, die aus einer Population der Netzhautvorläuferzellen 1 , 2 , 3 entstehen. Viele Subtypen von Zellen können funktionell, morphologisch und genetisch klassifiziert werden. Ziel dieses Protokolls ist es, die genetische Variabilität von Zelltypen an ihre identifizierbaren funktionellen und / oder morphologischen Eigenschaften zu binden. Eine Reihe von Genen wurden für die Klassifizierung von Zellen identifiziert, aber viele Subtypen gehen weiterhin uncharakterisiert, da sie einen kleinen Bruchteil der Gesamtbevölkerung darstellen. Die Identifizierung von Genen innerhalb dieser spezifischen Subtypen wird ein besseres Verständnis der neuronalen Vielfalt innerhalb der Netzhaut ermöglichen und kann auch die Diversifizierung der neuralen Zellen anderswo beleuchten. FuDarüber hinaus erlauben Single-Cell-Studien die Aufdeckung neuer Zelltypen, die aufgrund ihrer geringen Repräsentation unter der Gesamtbevölkerung 4 , 5 , 6 , 7 übersehen werden können .
Einer der Vorteile der Single-Cell-Transkriptomik ist, dass einzigartige Marker oder Kombinationen von Markern, die einen bestimmten zellulären Subtyp definieren, entdeckt werden können. Diese können dann verwendet werden, um genetischen Zugang zu diesem Zelltyp für verschiedene Manipulationen zu gewinnen. Zum Beispiel verwenden wir dieses Protokoll zur Charakterisierung der zelltypspezifischen Gene einer Untergruppe von retinalen Ganglienzellen, die das Photopigment Melanopsin exprimieren. Die Verwendung eines fluoreszierenden Markers in Melanopsin-exprimierenden retinalen Ganglienzellen ermöglicht die Untersuchung dieser Zellen, da sie aufgrund ihrer Expression eines bekannten Gens zusammengehäuft sind. Interessanterweise gibt es fünf bekannte Subtypen dieser Zelle PopuLation in der Maus Retina 8 . Um also RNA aus Zellen jedes Typs zu isolieren, haben wir im Rahmen des transgenen Modells etablierte morphologische Klassifikationen verwendet, um jeden Subtyp vor der Zellisolation zu identifizieren. Diese Technik ermöglicht sowohl die Charakterisierung von Zellen als auch für ihre Isolierung direkt aus der Netzhaut, ohne die Notwendigkeit einer Gewebedissoziation, die eine Stressreaktion innerhalb von Zellen und eine Kontamination aufgrund von abgetrennten Dendriten verursachen kann 9 .
In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl neuer Techniken aufgetaucht, da sich die RNA-Seq-Methode weiterentwickelt. Diese Werkzeuge ermöglichen eine maximierte Zellaufnahme und eine höhere Kosteneffizienz bei Annäherung an die Frage 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Doch währendDiese Techniken waren hervorragende Stepping-Steine, gibt es eine Reihe von Hürden noch begegnet, dass dieses Protokoll in der Lage ist, Adresse. Zuerst isolieren viele der gegenwärtigen Verfahren Zellen aus dissoziiertem Gewebe und versuchen, entweder Hauptkomponentenanalyse oder hierarchische Clustering Post-hoc zu verwenden, um die Zellklassifizierung zu bestimmen. Das Verlassen auf diese Werkzeuge, um Subtypen zu klassifizieren, kann keine zuverlässigen Ergebnisse liefern und kann dazu führen, dass man neue Wege findet, um diese Daten für die Korrelation eines genetischen Markers zu einem funktionellen Zelltyp zu validieren. Das Erfordernis der Dissoziation in anderen Protokollen kann manchmal zu Gewebeschäden führen und kann dazu führen, dass neuronale Prozesse abgetrennt werden, was zu einem möglichen Verlust an mRNA führt. Weiterhin können in den dissoziierten Zellpräparaten die Stressreaktionen beginnen, die Transkriptome dieser Zellen zu beeinflussen 14 . Dieses Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Bestimmung der funktionellen Zelltyp vor der Isolierung, und es hält besser die hDie Fähigkeit, das Netzhautgewebe intakt zu halten.
Eine Technik wurde im Jahr 2014 eingeführt und bestand aus der in vivo Analyse des Transkriptoms der lebenden Zellen 15 . Während diese Technik die Untersuchung des Transkriptoms mit minimaler mechanischer Störung des Gewebes ermöglicht, fehlt es an der Fähigkeit, spezifische Zelltypen innerhalb des Gewebes zu klassifizieren, bevor sie ihre Transkriptome untersuchen, ohne eine sehr spezifische Reportermaus zu verwenden. Unser Protokoll erfordert keinen spezifischen Reporter, da wir die Zellfüllung und die Elektrophysiologie nutzen, um Zellen vor ihrer Isolation zu charakterisieren. Eine weitere Einschränkung dieses früheren Protokolls besteht darin, dass es eine spezifische Wellenlänge benötigt, um das photoaktivierbare Element anzuregen, während unser Protokoll die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters und eines fluoreszierenden Farbstoffs ermöglicht, die leicht verfügbar sind oder von jedem Labor einzeln ausgewählt werden können. Dennoch haben andere Laboratorien die beiden Methoden der Elektrizität geheiratetOphysiologie und Transkriptomik für das Studium der Zellvielfalt. Die Verwendung von Patch-Clamp-Aufnahmen zur Charakterisierung der Funktion einer Zelle vor ihrer Isolation wurde auf dissoziierten Neuronen durchgeführt 16 und in einigen Fällen ist sie der Verwendung der Mikroarray-Analyse 17 für diese Studien vorausgegangen. Die gleichen Komplikationen treten bei jenen Ansätzen auf, da sie eine Gewebedissoziation oder die Verwendung von Mikroarray-Technologie erfordern, die auf der Hybridisierung von Proben auf verfügbare Sonden beruht. Einer der jüngsten Fortschritte war die Entwicklung von Patch-Seq, einer Technik, die den Einsatz von Patch-Clamp-Aufnahmen und RNA-Seq-Technologie kombiniert, um Zellen aus Ganzhirn-Scheiben zu verstehen. Während diese Technik ihre Ähnlichkeiten mit dem hier vorgestellten Protokoll hat, ist es wieder wichtig zu beachten, dass unser Ansatz es dem Gewebe ermöglicht, für die Gesundheit der Zellen intakt zu bleiben. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimizat vorIon dieser Allianz, die qualitativ hochwertige Single-Cell-Bibliotheken für den Einsatz von RNA-Seq generiert, um eine hohe Lesetiefe und Mapping-Abdeckung zu erhalten.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Northwestern University genehmigt.
1. Vorbereitung von Lösungen für die Elektrophysiologie (4 h)
- Mischen Sie 0,1% DEPC-behandeltes H 2 O durch Zugabe von 1 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) zu 999 ml Umkehrosmose-gereinigtem H 2 O. Mischen Sie gründlich und lassen Sie das Gemisch 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Dann das DEPC-gemischte H 2 O für 15 min auf einem Flüssigkeitszyklus autoklavieren. Lassen Sie das DEPC-behandelte H 2 O bei RT kühlen.
- Machen Sie die extrazelluläre Lösung durch Mischen einer Flasche Ames 'Medium und 1,9 g (23 mM) Natriumbicarbonat in 1 l H 2 O. Blasen Sie die extrazelluläre Lösung mit
95% O 2 /5% CO 2 und halten sie bei einem pH-Wert von 7,3-7,4 auf. - Generieren Sie die intrazelluläre Lösung durch Kombinieren von 125 mM K-Gluconat, 2 mM MgCl 2 , 10 mM EGTA, 10 mM HEPES und 0,1% DEPC-behandeltes H2 O. In 1 ml Aliquots bei -20 ° C aufbewahren. Füge 10 μM Fluoreszenz-Tracer zu Beginn eines jeden Experiments hinzu.
- Machen Sie die Enzymlösung durch Zugabe von 10.000 Einheiten Collagenase und 83 mg Hyaluronidase zu 4,15 ml extrazellulärer Lösung. Die Enzymlösung sollte in 50 μl Aliquots bei -20 ° C gelagert werden.
2. Vorbereitung des Netzhautgewebes (2 h)
HINWEIS: Alle Vorgehensweisen in diesem Abschnitt sollten unter düsterer Beleuchtung durchgeführt werden
- Dunkel-anpassende Tiere für mindestens 1 Stunde vor der Sektion. Führen Sie alle Eingriffe unter düsterer Beleuchtung aus.
- Euthanasieren Sie die Tiere durch CO 2 -Aphydiierung und entkern die Augäpfel in eine Petrischale mit vorher sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung.
- Stacheln Sie die Hornhaut mit einer Nadel und schneiden Sie sie ab, indem Sie mit ophthalmischer Schere an der Grenze der Hornhaut und der Sklera schneiden.
- Entfernen Sie das Objektiv mit# 5 Pinzette. Sanft in der Sklera mit der Pinzette reißen und den Sehnerv abtrennen, wo sich die Netzhaut und die Sklera treffen. Sorgfältig beenden, die Sklera aus der Netzhaut zu entfernen.
- Entfernen Sie die transparente Glaskörper mit # 5 Pinzette; Einmal entfernt, erscheint der Glaskörper als eine gallertartige Substanz, die an der Pinzette festhält. Scheibe die Retinas in der Hälfte (so dass es 4 Stück / Tier) und speichern sie in sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung bei RT bis zum Einsatz.
- Wenn es bereit ist, das Gewebe in der Aufzeichnungskammer zu montieren, legen Sie ein Stück Retina in eine Enzymlösung ein, die in 500 & mgr; l einer mit Sauerstoff angereicherten extrazellulären Lösung verdünnt ist. In einer Petrischale für 2 min bei RT auf einem Shaker inkubieren.
- Waschen Sie das Stück der Netzhaut in der mit Sauerstoff angereicherten extrazellulären Lösung und legen Sie das Gewebe in eine Glasboden-Aufzeichnungskammer; Verwenden Sie eine Plastik-Transferpipette, wobei die Spitze abgeschnitten ist, damit die Netzhaut übertragen werden kann, ohne dass das Gewebe beschädigt wird.
- Verwenden fürUm das Gewebe sorgfältig zu glätten, wobei die Photorezeptorschicht nach unten zeigt. Entfernen Sie überschüssiges Fluid mit einer Pipette. Verankern Sie das Gewebe mit einem Platinring mit Nylongewebe.
ANMERKUNG: Diese Methode könnte auch verwendet werden, um das Gewebe für die Isolierung von RNA aus markierten Amacrin- und Bipolarzellen herzustellen. - Füllen Sie die Kammer mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung und montieren Sie sie auf eine Mikroskopstufe. Perfuse Gewebe mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung bei 2-4 ml / min.
3. Visualisierung und Targeting von GFP + Retinal-Ganglion-Zellen (10 min)
HINWEIS: Alle Vorgehensweisen in diesem Abschnitt sollten unter düsterer Beleuchtung durchgeführt werden
- Bevor Sie beginnen, ziehen Sie Glas-Mikropipetten (OD: 1,2 mm, ID: 0,69 mm) für elektrophysiologische Aufnahmen mit einem Mikropipetten-Abzieher. Verwenden Sie für die Elektroden das folgende Protokoll: Bitte beachten Sie, dass die Parameter entsprechend angepasst werden müssen, um den gewünschten Widerstand zu erreichenVariieren über Abzieher und mit unterschiedlichem Glas): Hitze: Rampe +10; Pull: 0; Vel: 23; Verzögerung: 1; Druck: 500; Programmschleife: 5 mal. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen einen Durchmesser von 1 μm haben, mit Widerständen von 2-4 MΩ für die Ausrichtung auf große Zellen und 5-7 MΩ für die Ausrichtung auf kleinere Zellen.
- Beobachten Sie die Ganglienzellschicht mit Hilfe der Infrarot-Differential Interference Contrast (IR-DIC) -Optik (Abbildung 1A ). Identifizieren Sie GFP + Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) unter Verwendung von Epifluoreszenz (~ 480 nm) (Abbildung 1B ).
- Finden Sie die Pipette mit intrazellulärer Lösung in DIC gefüllt. Tragen Sie leichten positiven Druck und null irgendwelche Spannung Offsets auf dem Verstärker.
- Drücken Sie die Glas-Mikropipette gegen eine GFP + -Zelle und wenden Sie einen Unterdruck an, um eine GΩ-Dichtung zwischen der Pipette und der Zellmembran zu bilden. Tragen Sie Prüfspannungsbefehlsschritte ( zB 5 mV) auf, um den Dichtwiderstand zu überwachen. Nach dem Bilden einer stabilen Dichtung, brechen die Membran durch die Anwendung von kurzen Impulsen von nEifriger Druck, um den ganzen Zelle zu gewinnen.
- Warten Sie 1-2 min für die Dendriten der Zelle mit fluoreszierenden Tracer zu füllen.
ANMERKUNG: Die Zelle kann morphologisch typisiert werden, indem man die Morphologie in Epifluoreszenz untersucht (Abbildung 1C ). Im Falle von Melanopsin-exprimierenden RGCs wird die dendritische Schichtung in der inneren plexiformen Schicht durch Untersuchung der mit fluoreszierendem Tracer gefüllten Dendriten unter epifluoreszierender Beleuchtung sichtbar gemacht und bestimmt, ob sie weit von dem Soma in der AUS-Subamina (M1 ipRGCs) nahe dem Ganglion stratifizieren Zellschicht in der ON-Subamina (M2 & amp; M4 ipRGCs) oder beide (M3 ipRGCs). Diese Beobachtung, kombiniert mit Soma-Größe (M4s haben deutlich große Somas im Vergleich zu allen anderen ipRGC-Subtypen), erlauben die Identifizierung des Zelltyps 20 , 21 , 22 . Somit ermöglicht diese Technik die Identifizierung des Zelltyps in vitro vor RNA isoLation Diese Methode könnte für andere Zelltyp-Identifikations-Protokolle, die entweder dendritische Morphologie oder zelluläre Physiologie, modifiziert werden.
4. Zellisolation (2 min)
- Bevor Sie beginnen, stellen Sie die Tabletop-Mikrozentrifuge auf 2.000 x g ein. Bereiten Sie eine Probe-Vertreibung Gerät durch Anschluss Schlauch (OD: 3/32 in, ID: 1/32 in) mit einer 1 cc Spritze.
- Platzieren Sie 0,2 ml PCR-Röhrchen mit 10 μl Lysepuffer und 1% β-Mercaptoethanol auf Eis. Bereiten Sie eine 1-cm-Spritze vor, die DEPC-behandeltes H 2 O enthält, um die Pipettenspitzen zu spülen. Bereiten Sie einen Behälter mit Trockeneis vor, um den Lysepuffer nach der Probenahme einzufrieren.
- Den zytoplasmatischen Gehalt der Zellpipette sorgfältig extrahieren, indem ein Unterdruck unter Verwendung einer 10 ml-Spritze angewendet wird; Alle zytoplasmatischen Inhalte, einschließlich Organellen, sollten nach Möglichkeit extrahiert werden.
- Überwachen Sie die Extraktion in DIC durch die Visualisierung der Zellkörper abnehmen in Größe. Nach dem extrahieren Den zytoplasmatischen Inhalt, die Pipette vorsichtig vom Gewebe abheben und die Pipette schnell aus der Lösung entfernen.
- Entfernen Sie die Pipette schnell aus dem Kopfstufenhalter und spülen Sie die Pipettenspitze kurz mit DEPC-behandeltem H 2 O mit einer 1 mL Spritze ab. Verbinden Sie die Pipette mit einer 1-ml-Spritze über eng anliegende Schläuche, um die Probe zu vertreiben.
- Die Zellen sofort in 10 μl Lysepuffer 1, enthaltend 1% β-Mercaptoethanol, in 0,2 ml PCR-Röhrchen ausstoßen.
HINWEIS: Das gesamte Aspirat mit den Zellen sollte sanft ausgestoßen werden, um keine Blasen einzuführen.- Die Röhre kurz in einer Tabletop-Minizentrifuge bei 2.000 xg für 10 s zentrifugieren. Sofort die Proben für 5 min auf Trockeneis einfrieren lassen. Nach dem Einfrieren lagern sie bei -80 ° C für bis zu zwei Wochen für beste Ergebnisse; Die Proben können länger dauern, aber es wird empfohlen, dass sie so schnell wie möglich verarbeitet werden.
- Bevor Sie beginnen, richten Sie eine magnetische Trennvorrichtung ein, indem Sie den oberen Teil eines umgekehrten P20- oder P200-Spitzenhalters an den 96-well-Magnetständer 23 anschlagen.
- Frische 70% Ethanol (EtOH) vorbereiten - ca. 1 mL pro Probe genügt. Entfernen Sie die RNA-Magnetperlen aus 4 ° C Lagerung und tauen Sie sie bei RT für mindestens 30 min auf.
HINWEIS: Es sollten nicht mehr als 8 Proben gleichzeitig verarbeitet werden, da viele Schritte in diesem Protokoll auf Effizienz und schnelle Handhabung angewiesen sind. - Sobald die magnetischen Perlen bei RT sind, für 30 s vortexen, um sicherzustellen, dass die Lösung gut vermischt ist.
HINWEIS: Die Perlen verwenden einen RNA-spezifischen Puffer, um selektiv RNA zu binden, und sie erlauben die Entfernung von anderen zellulären Abfällen, wenn sie mit einem Magnetplattenständer verwendet werden. - Tau-Zellen bei RT für 1 min auftragen und dann 5 & mgr; l RNase-freies H 2 O zu jeder Probe hinzufügen; Pipette auf und ab. Füge 22 μl RNA-Kügelchen zu jedem Röhrchen hinzu und pipettierenE gründlich zu mischen. Die Proben bei RT für 5 min inkubieren, um die RNA zu interagieren und mit den magnetischen Kügelchen zu binden.
- Legen Sie die Rohre auf eine magnetische Trennvorrichtung und lassen Sie für 8 min sitzen; Bevor sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass der Überstand klar ist. Beobachten Sie die Perlen von einem Pellet und achten Sie darauf, es nicht während des Pipettierens zu lösen.
- Den Überstand aus den Proben entfernen und 150 μl 70% EtOH zugeben. Entfernen Sie die EtOH und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.
- Lassen Sie die Proben 6 Minuten lang an der Luft trocknen. Überprüfen Sie intermittierend, ob mehr EtOH an der Unterseite des Tubus gesammelt hat. Entfernen Sie es entsprechend.
- Während die Proben trocknen, wird 10X Reaktionspuffer durch Kombinieren von 19 & mgr; l Lysepuffer 2 und 1 & mgr; l RNase Inhibitor (40 U / & mgr; l) hergestellt. Spinnen Sie es kurz und halten Sie es auf Eis.
- Sobald die Proben trocken sind und die Perlenpellets nicht mehr glänzend erscheinen, entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetabscheider und fügen Sie 9,5 μl RNase-freies H 2 O hinzuUm die Proben zu rehydrieren. Legen Sie die Proben auf Eis und fügen Sie 1 μl 10x Reaktionspuffer zu jeder Probe hinzu.
6. Reverse Transkription (10 min)
ANMERKUNG: Vor Beginn des Testens die notwendigen Reagenzien für die reverse Transkription (RT, mit Ausnahme des Enzyms) auf Eis auftauen. Dazu gehören: Primer II, Puffer 1, Oligonukleotid und RNase-Inhibitor.
- Zu jedem Röhrchen werden 2 μl Primer II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT (30) N -1 N, für die N -1 A, C oder G sein kann und N A, C, G oder T, 12 μM sein können. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler, der bei 72 ° C für 3 min vorgewärmt wurde.
- Bei der Inkubation den RT-Master-Mix vorbereiten. Für jede Reaktion werden 4 & mgr; l Puffer 1 (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl und 30 mM MgCl 2 ), 1 & mgr; l Oligonukleotid (48 & mgr; M) und 0,5 & mgr; l RNase-Inhibitor (40 U / ΜL).
- Unmittelbar nach der Inkubation legen Sie die Röhrchen aufEis für 2 min.
- Zugabe von 2 μl pro Reaktion der reversen Transkriptase (100 U / μL) zum Mastermix und Pipette sorgfältig. 7,5 μl Mastermischung zu jedem Röhrchen geben und durch vorsichtiges Pipettieren mischen. Drehen Sie kurz die Röhrchen, um den Inhalt an der Unterseite zu sammeln und legen Sie sie in einen vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm: 42 ° C für 90 min, 70 ° C für 10 min und einem Halt bei 4 ° C.
- Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ° CO / N, bevor Sie fortfahren, obwohl es empfohlen wird, dass die Proben durch den Verstärkungsschritt getragen werden, bevor sie für längere Zeit gelagert werden; Andere Quellen deuten darauf hin, dass O / N-Speicher bei 4 ° C auch in diesem Schritt 24 akzeptabel wäre.
7. cDNA Amplifikation (2,5 h)
HINWEIS: Vor dem Beginn Tau-PCR-Puffer und PCR-Primer auf Eis und drehen die Röhrchen unten in einer Tischplatte Mini-Zentrifuge, bevor die PCR-Master-Mix.
- Für jede Reaktion, pEine PCR-Mastermischung mit 25 μl PCR-Puffer, 1 μl PCR-Primer (12 μM), 1 μl DNA-Polymerase und 3 μl nukleasefreies H 2 O abgeben. Die DNA-Polymerase zuletzt kurz vor der Zugabe zugeben Von Master-Mix zu den Proben.
- Füge 30 μl Master-Mix zu jedem Röhrchen hinzu und drehe bei 2.000 xg für 10 s, um den Inhalt an der Unterseite der Röhrchen zu sammeln.
- Die Röhrchen in einen vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm stellen: 95 ° C für 1 min; 34 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 65 ° C für 30 s und 68 ° C für 3 min; 72 ° C für 10 min; Und einen Halt bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Anzahl der Zyklen für diese PCR wurde auf 34 erhöht, abweichend von den Anweisungen des Herstellers. Nach dem Wiederholungsversuch wurde festgestellt, dass diese Zyklusnummer konsequent zuverlässige Ergebnisse liefert. - Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ° C bis zu einem Jahr, bevor Sie fortfahren.
8. Reinigung des amplifizierten cDNA (30 min)
- Vor Beginn der Reinigung die DNA-Kügelchen und den Elutionspuffer mindestens 30 min lang auf RT bringen. Frische 80% EtOH zubereiten; 1 ml pro Probe sollte ausreichen. Füge 1 μl 10X Lysepuffer zu jeder Probe hinzu.
- Vortex der DNA-Perlen für 30 s und füge 50 μl DNA-Kügelchen zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren, und dann kurz spinnen sie sie bei 2.000 xg für 10 s. Inkubieren Sie die Röhrchen bei RT für 8 min.
- Legen Sie die Röhrchen für 5 min auf die magnetische Trennvorrichtung. Den Überstand vorsichtig zweimal nach oben und unten pipettieren und die Proben für 2 min sitzen lassen. Während die Proben auf dem magnetischen Gerät sind, entfernen Sie den Überstand und entsorgen.
- Füge 150 μl frisch hergestellter 80% EtOH zu jeder Probe hinzu und lasse sie 30 Sekunden lang bei RT sitzen. Entfernen Sie die EtOH und wiederholen Sie die EtOH einmal waschen.
- Die Proben kurz drehen und 1 min auf den Magnetabscheider legen. Entfernen Sie alle verbleibenden EtOH und lassen Sie die Proben 5 Minuten lang an der Luft trocknen.
- Sobald das Perlenpellet nicht mehr glänzend erscheint, aber bevor Risse auftreten, entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und fügen Sie 17 μl Elutionspuffer hinzu. Vorsichtig pipettieren, um die Perlen vollständig zu resuspendieren.
- Inkubieren Sie die resuspendierten Proben bei RT für 2 min.
- Drehen Sie kurz die Proben, um alle Flüssigkeit an der Unterseite zu sammeln und legen Sie sie auf den magnetischen Separator für 2 min. Übertragen Sie 15 μl klarer Überstand auf ein 1,5 mL RNase-freies Röhrchen und lagern Sie es bei -20 ° C.
- Untersuchen Sie die Qualität und die Größe der cDNA-Bibliothek mit einem hochempfindlichen Bioanalyton-Chip mit 1 μl cDNA. Die ideale Größe einer cDNA-Bibliothek beträgt 0,3-2 Kb mit einer Konzentration von mindestens 10 ng / μL (Abbildung 2 ).
HINWEIS: Sie können sich entscheiden, PCR als eine Möglichkeit zu verwenden, um Proben zu scannen, um den Ausdruck bekannter Marker zu gewährleisten, bevor Sie mit dem Beispiel prEparation
9. Bestimmen Sie Konzentrationen und Tagment-cDNA (20 min)
- Bevor Sie beginnen, bringen Sie das Assay Reagenz, Verdünnungspuffer und Standards auf RT für 30 min. Bereiten Sie eine Mastermischung mit 1 & mgr; l Assayreagenz und 199 & mgr; l Verdünnungspuffer pro Reaktion vor. Aliquot 199 & mgr; l dieser Mischung in 500 & mgr; l Teströhrchen 1 μl Probe zugeben und gut durchmischen.
- Aliquotieren Sie 190 μl Mastermischung auf Röhrchen 1 & 2. Fügen Sie 10 μl Standard 1 zu Röhrchen 1 und 10 μl Standard 2 zu Röhre 2 hinzu. Vortex alle Probenröhrchen und Standardrohre für 5 s; Bei RT für 3 min inkubieren.
- Bestimmen Sie die Konzentration der Proben mit einem hochempfindlichen Fluorometer. Stellen Sie sicher, dass die richtige Probenmenge eingegeben wurde, indem Sie die Option "Stammlösung berechnen" auswählen und "1 μL" markieren. Jede Probe in einem separaten 1,5 ml-Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,2 ng / μl in RNase-freiem H 2 O verdünnen.
HINWEIS:Während die Anweisungen des Herstellers darauf hindeuten, dass man mit 1 ng / μl Gesamtmenge an DNA beginnen sollte, haben wir einen kleineren Ausgangsbetrag verwendet und haben auch das Protokoll angepasst, um diese Änderung zu berücksichtigen. - In neuen 0,2-ml-PCR-Röhrchen pipettieren Sie 2,5 μl Puffer 2. Fügen Sie 1,25 μl cDNA zu dem entsprechenden Röhrchen für insgesamt 250 pg hinzu. Schließlich werden 1,25 & mgr; l Tagmentationsmischung zu jedem Röhrchen gegeben und die Pipette sorgfältig vermischt; Die Transposase innerhalb des Tagmentationsgemisches wird die DNA in kurze Stränge zerteilen und die Adaptoren an jedem Ende jedes Strangs anlagern, um sie später durch das Sequenzinstrument zu verwenden.
HINWEIS: Die für die Tagmentierung und die Indexkopplung verwendeten Volumina sind ein Bruchteil der in den Anweisungen des Herstellers vorgeschlagenen Menge. Dies ermöglicht nicht nur die Konservierung von Reagenzien, sondern auch konsequent produzierte markierte Proben nach unserer Erfahrung. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen auf einer Arbeitsplatte Mikrozentrifuge für 1 min.
- Legen Sie die RohreIn einem vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm: 55 ° C für 10 min und einem Halt bei 10 ° C.
HINWEIS: Die Länge dieser Inkubation beträgt 10 min, im Gegensatz zu den vorgeschlagenen 5 min von den Anweisungen des Herstellers. - Unmittelbar nachdem dieses Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Röhrchen und fügen Sie jeweils 1,25 μl Tagmentationsneutralisierungspuffer hinzu. Pipette gut zum Mischen und Inkubieren bei RT für 5 min. Führen Sie diesen Schritt sofort aus, da die Transposase aktiv bleibt, bis der Puffer das Enzym neutralisiert und die Reaktion stoppt.
10. Index Kopplung und Reinigung (1 h)
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, bringen Sie die DNA Perlen und Resuspension Puffer auf RT für mindestens 30 min. Entscheiden Sie, welche Indizes für jede der Proben verwendet werden sollen.
HINWEIS: Diese Indizes werden an die jeweiligen 5'- und 3'-Enden der fragmentierten DNA zur Identifizierung von Proben nach der Sequenzierung angehängt. Stellen Sie sicher, dass keine zweiPaarungen sind die gleichen für Proben, die zusammen sequenziert werden können. Zum Beispiel, wenn Probe 1 Indizes weiß 1 und orange 1 verwendet, sollte Probe zwei weiß 1 und orange 2 oder weiß 2 und orange 2 verwenden, aber niemals die gleiche Kombination von Indizes. Dieses Kit enthält 4 verschiedene weiße und 6 verschiedene orangefarbene Indizes. Alle verschiedenen möglichen Kombinationen erlauben bis zu 24 Proben in einer Sequenzspur gepoolt werden. Obwohl wir in der Regel nur 10 Samples in einer Spur beherbergen, könnte man auch den Kit mit 24 Indizes verwenden, der das Bündeln von 96 Proben in einer einzigen Spur der Sequenzierung, falls gewünscht, ermöglichen würde.
- Zu jeder Röhre fügen Sie 1,25 μl des linken Indexes und 1,25 μl des rechten Index für diese spezifische Probe hinzu. Fügen Sie 3,75 μl PCR-Master-Mix und Pipette gut zu mischen.
- Zentrifuge in einer Arbeitsplatte Mikrozentrifuge für 1 min.
- Die Röhrchen in einen vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm stellen: 72 ° C für 3 min; 95 ° C für 30 s; 12 Zyklen von 9576, C für 10 s, 50 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 5 min; Und einen Halt bei 4 ° C.
HINWEIS: Der erste 95 ° C-Schritt wurde von 98 ° C geändert, was nach den Anweisungen des Herstellers vorgeschlagen wurde. Auch wurden die Zyklusdetails so eingestellt, dass die Temperaturen und Zeitlängen für die optimale Etikettierung unserer Proben erlaubten. Die endgültige Inkubation von 72 ° C wurde ebenfalls zu unserem Protokoll hinzugefügt und war nicht in den Anweisungen des Herstellers enthalten. - Drehen Sie kurz die Röhren, um den Inhalt an der Unterseite zu sammeln. Vortex der DNA-Kügelchen für 30 s und füge dann 30 & mgr; l zu jedem Röhrchen hinzu und vermische sorgfältig durch Pipettieren.
- Inkubieren Sie die Proben bei RT für 5 min.
- Legen Sie die Proben 2 min auf einen Magnetabscheider. Den Überstand zweimal nach oben und unten pipettieren und die Proben für 1 min inkubieren.
- Entfernen und entsorgen Sie den klaren Überstand. Zugabe von 150 μl 80% EtOH zu jeder Probe und entfernen. Wiederholen Sie die EtOH einmal waschen.
- Erlauben thE Proben an der Luft trocknen für 10 min. Überprüfen Sie intermittierend, ob EtOH an der Unterseite der Rohre gesammelt und nach Bedarf entfernt wird.
- Sobald ein Riss in dem DNA-Perlenpellet auftritt, entfernen Sie die Probe aus dem magnetischen Separator und fügen Sie 27,5 & mgr; l Resuspensionspuffer hinzu, um das Pellet zu rehydratisieren. Sicherstellen, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist, und dann bei RT für 2 min inkubieren.
HINWEIS: Das für den Resuspensionspuffer verwendete Volumen wurde modifiziert, um die geringere Menge an Ausgangsmaterial in unserem Protokoll zu berücksichtigen und unterscheidet sich von dem vorgeschlagenen Volumen in den Anweisungen des Herstellers. - Legen Sie die Röhrchen für 2 min auf den Magnetabscheider. 25 μl klarer Überstand in ein RNase-freies Röhrchen überführen und bei -20 ° C aufbewahren.
HINWEIS: Fahren Sie nicht mit den Anweisungen des Herstellers fort, um die Normalisierung der Bibliothek zu beenden. Die Proben werden nach diesem Schritt erfolgreich vorbereitet und sind für die Sequenzierung so vorbereitet. - Analysiere die tAgmentation der Proben unter Verwendung eines Bioanalyse-Chips und 1 & mgr; l jeder Probe
HINWEIS: Die Analyse der Abstriche wird wie früher durchgeführt. Jedoch sollte cDNA nun in einem Größenbereich von 0,2-1 Kb nachgewiesen werden (Abbildung 3 ). Abstriche unterhalb dieses Punktes stellen wahrscheinlich die Verschlechterung der Proben dar, während größere Abstriche eine unvollständige Markierung vorschlagen.
11. Pooling von Proben (10 min)
- Erhalten Sie Konzentrationen von Tagmentationsproben mit dem hochempfindlichen Fluorometer von früher und bestimmen Sie die Konzentration in nM.
HINWEIS: Diese Berechnung kann mit der Verwendung eines Internet-Konvertierungs-Tools berechnet werden und beruht auf der durchschnittlichen Fragmentlänge von der Bioanalyzer-Spur. Um die durchschnittliche Fragmentlänge zu bestimmen, beobachten Sie die Spur für jede Probe einzeln und bestimmen die Größe des durchschnittlichen DNA-Fragments. Dies kann auch bei der Untersuchung der Bioanalyzer-Spur berechnet werden, indem man den Bereich des Abstriches hervorhebt und untersuchtDie vom Programm berechnete Molarität. - Kombinieren Sie Proben, so dass der Pool die gleiche Konzentration jeder Probe enthält. Die Proben nicht verdünnen; Der Pool sollte nur so verdünnt sein wie die niedrigstkonzentrierte Probe und hätte idealerweise eine Gesamtkonzentration von mindestens 15 nM.
- Die gepoolten Proben bei -20 ° C vor der Sequenzierung aufbewahren; Es wird vorgeschlagen, dass die Proben einer Sequenzierung innerhalb von 1 Woche nach dem Pooling unterzogen werden. Führen Sie gepaartes Ende, 100 bp Sequenzierung mit einer HiSeq Plattform.
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Representative Results
Zelltypen werden nach der Farbstoffinjektion leicht klassifiziert
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel eines GFP + RGC vor und nach der Fluoreszenz-Tracer-Füllung. Diese Zelle wurde anhand ihrer Expression von GFP in der transgenen Linie identifiziert (Abbildung 1A ). Eine dichte Abdichtung wurde mit einer feinen Spitze, gezogenen Glaselektrode auf dem Soma dieser Zelle gebildet. Um den Subtyp zu charakterisieren, wurde der Fluoreszenzfarbstoff in das Soma injiziert und erlaubt, alle zugehörigen Prozesse zu füllen (Abbildung 1B ). Die Klassifizierung als M4 ipRGC wurde durch die Beobachtung ermöglicht, dass diese Zelle ein sehr großes Soma hat und dass ihre Prozesse innerhalb der ON-Sublamina der inneren plexiformen Schicht enden (Abbildung 1C ). Als Beispiel für Unterschiede in der Stratifikation, die in einer isolierten Netzhautpräparation erkannt werden können, füllten wir M1 (OFF-stratifyinG), M3 (bistratifiziert) und M4 (ON-stratifizierende) ipRGCs mit einem fluoreszierenden Tracer, fixiert und eine konfokale Abbildung der ON- und OFF-Sublaminae durchgeführt (Abbildung 1D ). Diese Visualisierung der Dendriten über konfokale Bildgebung ist sehr ähnlich, wie die Dendriten in vitro Gewebe aussehen, wenn Zellen mit einem fluoreszierenden Tracer gefüllt sind (Schmidt und Kofuji 2009, 2010, & 2011).
CDNA-Bibliotheken aus einzelnen Zellen
Die Verwendung eines Oligo d (T) -Primers ermöglicht die selektive Reverse Transkription und Amplifikation von mRNA. Nach der Erzeugung und Verstärkung der cDNA-Bibliotheken aus jeder Zelle wurden Bioanalyzer-Chips verwendet, um die Qualität und Größe der Bibliotheken zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass die idealen cDNA-Abstriche 0,5-2 Kb in einer guten Probe sind ( 2A ). Einige Proben zeigen ein paar Bands oder Abstriche unterhalb der 300 bp Mark, sugGestikulieren, dass diese Bibliotheken von schlechter Qualität sind (siehe Tabelle 1 für die Fehlersuche). Ein Beispiel für eine qualitativ hochwertige Bioanalyzer-Spur zeigt wenige oder keine DNA-Banden unter 300bp und einen robusten Abstrich zwischen 500bp und 2Kb (Abbildung 2B). Leere Kontrollspuren sollten niedrigere und obere Markierungen bei 35 & 10380 bp anzeigen, sowie eine stetige Grundlinie, die nicht schwankt. Verschiedene Bibliotheken können Qualitätsdaten erzeugen, wie aus beiden Fig. 2B und 2C ersichtlich ist, die hervorragende Lesetiefen und hohe Abbildungsraten erzeugen. Nur solche Proben mit starken cDNA-Bibliotheken der erwarteten Größe sollten bis zur Markierung durchgeführt werden (siehe Tabelle 1 zur Fehlersuche).
Low-input-Tagmentation bereitet qualitativ hochwertige Proben für die Sequenzierung vor
Dieses Protokoll ist für die Etikettierung mit einer geringen Menge an Startmaterial optimiert L. Nur 250 pg arbeitet am besten für eine erfolgreiche tagmentation, da niedrigere Mengen nicht richtig verstärken und höhere Beträge nicht vollständig zersplittern werden. Nach Beendigung der Etikettierung und PCR-Amplifikation / Probenreinigung wurden die Proben wieder auf einem Bioanalyse-Chip analysiert. Die idealen cDNA-Abstriche an dieser Stelle sollten 0,2-1 Kb betragen (Abbildung 3A ). Die Spur sollte glatt und gleichmäßig zwischen diesen beiden Größen verteilt sein (Abbildung 3B ); Diese Spur entspricht der Probe in Spur 1. Abbildung 3C zeigt eine unvollständige Etikettierung, die leicht aufgelöst werden kann (siehe Tabelle 1 zur Fehlersuche). Wir haben eine Datenanalyse an den Proben durchgeführt und festgestellt, dass dieses Protokoll Proben mit ausgezeichneten Lesetiefen produzierte, die oft 12 Millionen Liest pro Probe übertrafen. Durchschnittswerte von 69,1% Mapping; Und mehr als 5.000 exprimierte Gene.
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Abbildung 1: Identifizierung von RGC-Typen auf Basis der GFP-Expression in Melanopsin-exprimierenden ipRGCs und auf morphologischen Eigenschaften. ( A ) Die Ganglien-Zell-Schicht der Retina, die mit IR-DIC im Voll-Retina-Präparat sichtbar gemacht wurde. ( B ) Die gleiche Präparation wurde in Epifluoreszenz (~ 480 nm) sichtbar gemacht, um GFP-exprimierende Ganglienzellen zu identifizieren. ( C ) Eine GFP-exprimierende Zelle, die auf die Patch-Clamp-Aufzeichnung gerichtet ist und mit einem fluoreszierenden Tracer gefüllt ist. Die Zelle kann als M4 ipRGC identifiziert werden, basierend auf ihrer sehr großen Soma-Größe und ON-Stratifizierung Dendriten 25 , 26 . ( D ) Konfokales Bild von ipRGC-Dendriten, die in der ON- und / oder OFF-Sublamina der IPL (M1), in der ON-Sublamina des IPL (M4) und in sowohl der ON- als auch der OFF-Sublaminae der IPL (M3) abgebildet sind. IR-DIC: Infrarot-Differential-Interferenzkontrast.jove.com / files / ftp_upload / 55229 / 55229fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Analyse der cDNA-Bibliothek Qualität mit einer Bioanalyzer-Spur. ( A) Bioanalyzer Ausgang Beispiel für mehrere Proben, die reverse transkribiert, amplifiziert und gereinigt wurden. Die Spuren 1-3 zeigen die idealen DNA-Abstriche, wobei die Mehrheit der DNA größer als 300 bp ist. Bibliotheken mit Abstrichen in diesem Bereich haben konsequent ausgezeichnete Sequenzdaten geliefert, die durchschnittlich 5,683 Gene zeigen, die pro Zelle exprimiert werden. Spur 4 stellt eine Probe dar, die erfolglos verarbeitet wurde und somit keine cDNA erzeugte. Die erfolgreiche Kontrollspur hat eine konstante Grundlinie und zwei saubere Spitzen bei 35 und 10.380 bp. ( B ) Beispiel für eine erfolgreiche Bioanalyzer-Spur mit einer hohen Intensität von cDNA um 2 Kb. Das s Mear entspricht der Probe in Spur 1. ( C ) Beispiel für eine erfolgreiche Bioanalyzer-Spur mit der cDNA, die um 500 bp zentriert ist. Diese Spur entspricht der Probe in Spur 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Tagierte Stichproben zeigen robuste Abstriche zwischen 0,2 und 2 Kb. ( A ) Ein repräsentatives Beispiel Bioanalyzer Ausgang nach Tagmentation, Amplifikation und PCR-Clean-up. ( B ) Spur einer erfolgreich markierten Probe, die der Spur 1 in (A) entspricht. ( C ) Beispiel für die Spur für eine Probe mit unvollständiger Etikettierung, klar durch die Spitzenintensität um 1 Kb."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Problem | Mögliche Ursache | Lösung | |
| Schritt 3.3) GΩ-Dichtung nicht bilden | Oberfläche der Zelle ist nicht sauber genug | Mit positivem Druck weiter säubern | |
| Schritt 3.3) Zelle scheint zu entleeren / sterben | Neue Pipette vorbereiten und eine neue Zelle ansprechen | ||
| Schritt 3.4) Der Endort der Dendriten kann nicht ermittelt werden | Alexafluor hat nicht genug Zeit, um in der Zelle zu verbreiten oder die Konzentration von Alexafluor ist nicht hoch genug | Überprüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Verstärkung und die Belichtungszeit auf der Kamera hoch genug sind. Warten Sie noch 5 Minuten, bevor Sie dendriten visualisieren. Wenn Dendriten noch nicht sichtbar sind, bereite ich eine Lösung mit höherem Alexafluor vorKonzentration. | |
| Schritt 4.1) Kann nicht alle Zytoplasmen aspirieren | |||
| Schritt 5.5) Der Überstand ist nach 8 Minuten nicht klar | Die gesamte Lösung zweimal sorgfältig pipettieren, dabei noch auf Magnetabscheider auftragen und noch 5 min sitzen lassen | ||
| Schritt 5.5) Pellet dispergiert beim Pipettieren | Probe ist zu weit vom Magneten | Halten Sie während des Pipettierens die Röhren auf der magnetischen Trennvorrichtung. Expel-Lösung und erlauben Perlen zu re-Pellet für 5 min | |
| Schritt 5.7) Nach 5 min erscheinen die Proben immer noch glänzend | Die maximale Menge an EtOH wurde nicht entfernt | Setzen Sie fort, Proben während des Trocknens zu überwachen. Alle 2 min, verwenden Sie eine P10-Pipette und entfernen Sie alle EtOH am Boden des Tubus | |
| Schritt 8.9) Pellet hatte Risse vor der Rehydration | Erlaube Probe zu rehydRate für insgesamt 4 min, anstatt 2 (Schritt 8.10) | ||
| Schritt 8.11) Kleine Menge Wulst wurde mit Überstand erzogen | Die gesamte Probe wieder in das Röhrchen ausstoßen und 1 min auf den Magnetabscheider stellen; Pipettieren Sie sich sanft und achten Sie darauf, Pellets zu vermeiden | ||
| Schritt 8.12) DNA-Abstriche sind inkonsistent und Fluoreszenz-Skala verändert sich kontinuierlich | Zu hohe DNA-Konzentration für einen HS-Chip | Prüfen Sie die Konzentration der Probe und verdünnen Sie zwischen 1 - 10 ng / μl. Ranun Bioanalyzer | |
| Schritt 8.12) Niedermolekularer Abstrich | RNA-Abbau | Achten Sie darauf, die Freeze Zelle sofort nach der Sammlung zu blinken. Verwerfe diese cDNA-Bibliothek | |
| Schritt 8.12) Fluktuierende Marker-Grundlinie in der Kontrollspur | Verunreinigung oder Altreagenz | DNA-Marker verwerfen und neue Röhre für Bioanalyzer laufen lassen | |
| Schritt 8.12) Kein DNA-Abstrich | Ausfall der Zelle | Neue Nadeln mit einer etwas größeren Spitze ziehen | |
| RNA Bead Failure | Vergewissern Sie sich, dass die Perlen vor der Verwendung vollständig resuspendiert wurden, und lassen Sie die Proben vor dem Aufsetzen auf den magnetischen Separator inkubieren | ||
| Schritt 8.12) Schwacher DNA-Abstrich | Nicht genug Verstärkung | Mehr PCR-Zyklen einsetzen | |
| Schritt 8.12) DNA-Verschmierung außerhalb von 500bp-2Kb Bereich | DNA-Abstriche unter 0,5 und über 2 Kb sind wahrscheinlich Kontamination. Probe verwerfen | ||
| Schritt 8.12) Regelmäßig beabstandete Spikes auf DNA-Spuren | Kontamination der Probe | Tragen Sie immer frische Handschuhe und machen Sie neue Ethanol für Spülungen; Filterspitzen sollten zu jeder Zeit verwendet werden | |
| Schritt 9.3) Kann die Konzentration der Probe auf dem Fluorometer nicht erkennen | Proben unterhalb der Erkennungsstufe haben zu wenig DNA für die Tagmentation und können nicht verwendet werden | ||
| Schritt 10.10) Die Proben sind nach 10 min nicht trocken | Weiter, um überschüssiges EtOH zu entfernen | Lassen Sie die Proben länger dauern, überprüfen Sie sie alle Minuten | |
| Schritt 10.13) Smear schief auf 2Kb | Unvollständige Fragmentierung | Die Probe auf eine Konzentration von 0,15 ng / μl anstelle von 0,2 ng / μl erneut verdünnen; Rerun tagmentation | |
| Schritt 10.13) Smear schräg gegen 200bp | Zu wenig DNA-Input | Die Probe weniger verdünnen, eine Konzentration von 0,4 ng / μl ausprobieren; Rerun tagmentation | |
| Tagmentierungsreaktion zu lang | Reduzieren Sie die Reaktionszeit der Tagmentation auf 8 min | ||
| Schritt 10.13) Schwache Abstriche | Unsachgemäße Amplifikation von DNA | 2 "> Probe bis zur Konzentration von 0,4 ng / μL verdünnen und wiederherstellen||
| Schritt 11.2) Die maximal erreichbare Poolkonzentration liegt unter 5 nM | Identifizieren Sie, welche Probe (n) signifikant niedrige Konzentrationen aufweist, und wiederholen Sie die Markierung mit neuer Verdünnung | ||
Tabelle 1: Lösungen und Vorschläge für mögliche Hindernisse im Protokoll. Diese Tabelle enthält potenzielle Schwierigkeiten, die während dieses Protokolls auftreten können, und die Schritte, auf die man sie treffen kann. Diese Tabelle listet mögliche Ursachen für viele dieser Probleme, sowie Lösungen, die helfen können, um Probleme zu lösen.
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Discussion
Unser Protokoll demonstriert durch eine schnelle und einfach zu bedienende Anleitung eine Methode zur Vorbereitung einzelner Zellen identifizierter morphologischer Klassen für qualitativ hochwertige Sequenzierung mit wenig Verletzung der Probe. In dem vorliegenden Manuskript werden intrinsisch lichtempfindliche retinale Ganglienzellen morphologisch charakterisiert, isoliert und für RNA-Seq vorbereitet. Während der Netzhauthandhabung können zelluläre Spannungen auftreten Aus diesem Grund ersetzen wir jedes Stück Gewebe nach nicht mehr als 4 h Gebrauch. Wir können den Zustand der Zellen beurteilen, indem wir die Elektrophysiologie-Anlage verwenden, um von diesen Zellen aufzuzeichnen und ihre Antworten zu überwachen, was uns ermöglicht, dass die Zellen von guter Gesundheit sind. Unser Protokoll erlaubte die Erzeugung von erfolgreichen cDNA-Bibliotheken aus 15 von 23 Proben verarbeitet, was eine Erfolgsquote von 65% ergibt. Darüber hinaus war die Qualität unserer Sequenzierungsdaten hervorragend, da die durchschnittliche Anzahl der von unseren Zellen ausgedrückten Gene von 2.316-10.353 mit einem Durchschnitt von 5.683 reichteGene, die sich mit einem Nicht-Null-FPKM-Wert registrieren. Diese Zahlen ähneln exprimierten Genzählungen, die von anderen Studien der Neuronen 5 gefunden wurden, was zeigt, dass unsere Daten auch von guter Qualität sind.
Während wir mit diesem Protokoll für diese spezifischen Neuronen Erfolg hatten, sollte darauf hingewiesen werden, dass kleinere Änderungen an dieser Technik für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen angewendet werden können. Mit Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) innerhalb eines separaten Mausmodells haben wir kleine Populationen von Zellen (1.000 -25.000), die mit einem GFP-Marker aus dem zentralen Nervensystem markiert sind, isoliert. Die RNA aus diesen Populationen wurde isoliert und 1 & mgr; l (bei oder etwas unter 12 ng / & mgr; l) dieser RNA wurde verwendet, um die reverse Transkription in Schritt 6.1 zu beginnen. Die einzige Anpassung, die nach diesem Schritt auf das Protokoll vorgenommen werden soll, erfolgt in Schritt 7.4, an welchem Punkt man sich entscheiden kann, weniger PCR-Zyklen einzusetzen. Wir haben 19 Zyklen in Fällen verwendet, in denen die Anfangsprobe g enthieltReater als 10.000 Zellen und haben festgestellt, dass dies produziert qualitativ hochwertige cDNA-Bibliotheken. Beispielsweise wurden Zellproben aus einer FACSorted-Population hergestellt und die Anzahl der exprimierten Gene reichte von 12.340-14.052 mit durchschnittlich 13.265 Genen mit einem Nicht-Null-FPKM-Wert. Diese Technik kann auf verschiedene Mausmodelle angewendet werden, für die ein fluoreszierender Reporter vorhanden ist. Aufgrund dieser Änderung könnten Forscher potenziell jede Zellpopulation untersuchen, für die eine fluoreszierende Reportermaus verfügbar ist, die sich über das Gebiet der neuronalen Vielfalt hinaus erstreckt.
Eine zweite Anpassung kann an Profilzellen basierend auf Funktionalität statt nur Morphologie vorgenommen werden. Dieses Projekt beruht auf einem transgenen Modell, aber diese Technik kann auf Neuronen ohne bekannte molekulare Identifikatoren angewendet werden. Zum Beispiel gibt es über 30 funktionelle Subtypen von retinalen Ganglienzellen, die derzeit identifiziert werden 27 , von denen nur sehr wenige eindeutige Marker aufweisen. Wie diese TechnikBereits auf eine elektrophysiologische Anlage für die Zellfüllung angewiesen ist, könnte man Patch-Clamping einsetzen, um das funktionale Antwortprofil jeder Zelle anhand ihres Spiking-Musters zu identifizieren. Unter Verwendung von Licht-evozierten Spike-Aufnahmen konnte die Klassifizierung von retinalen Neuronen vor der Zellisolation bestimmt werden. Diese Technik arbeitet auf retinalen Ganglienzellen, aber es kann erweitert werden, um andere Netzhautneuronen zu untersuchen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, wenn dieses Protokoll verwendet wird, um retinale bipolare oder Amacrinzellen in der inneren Kernschicht zu schreiben, beispielsweise muss man darauf achten, einen konstanten positiven Druck an der Spitze der Elektrode bereitzustellen, um zu vermeiden, dass die Zellen als die Elektrode durch die Ganglienzellschicht und die innere plexiforme Schicht hindurch. Bei retinalen Neuronen innerhalb der inneren Kernschicht würde die Präparation von Netzhautabschnitten vor zellulären Aufnahmen am besten geeignet sein, um Kontaminationen konsequent zu vermeiden. Jede Zelle würde isoliert und vorbereitet, wie hier beschrieben nach der claSsification Schritt Darüber hinaus schlagen wir die Verwendung dieses Protokolls für die Untersuchung von Neuronen vor, aber diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden, der durch die Verwendung eines transgenen Modells morphologisch charakterisiert oder isoliert werden kann.
Diese Technik kann auch modifiziert werden, um mit zuvor hergestellten cDNA-Bibliotheken zu arbeiten, wie wir in der Vergangenheit für die Mikroarray-Hybridisierung 28 erzeugt haben . Bei einer separat vorbereiteten Bibliothek beginnt man mit cDNA-Mengen im Bereich von 50-150 ng und startet das Protokoll in Schritt 8.4; Höhere und niedrigere Konzentrationen wurden nicht versucht, obwohl sie auch arbeiten können. Die Reinigung der cDNA unter Verwendung von DNA-Kügelchen würde zuerst auftreten, gefolgt von einer Markierung und einer PCR-Amplifikation. Wir haben diese Anpassung mit cDNA aus Bibliothekszubereitungen, wie z. B. für die Mikroarray-Hybridisierung 29 , getestet und haben erfolgreich markierte Bibliotheken für RNA-Seq.
FlosseKann dieses Protokoll bei der Beurteilung des Erfolgs einer bestimmten Induktion von Zellpopulationen aus induzierten Pluripotenten Stammzellen (iPSCs) verwendet werden. Die treibende Kraft hinter der Differenzierung dieser neu programmierten pluripotenten Zellen beruht auf einem Verständnis der Transkriptionsfaktoren, die Zelltypen dazu führen, sich getrennt voneinander zu entwickeln. Das Fahren von iPSCs zu bestimmten Zellschicksalen ist eine neue Methode zum Studium der neuronalen Vielfalt, da es verwendet werden kann, um selektiv Zelltypen zu erzeugen. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Qualität der Vielfalt zwischen differenzierten Zellen aus diesem Modell zu bewerten. Wie bereits erwähnt, gibt es mehr als 30 funktionelle Subtypen von retinalen Ganglienzellen, und es wurden viele Anstrengungen unternommen, um funktionale RGCs von iPSCs zu erzeugen. Die Identifizierung von Markern für Subtypen von RGCs - in unserem Fall ipRGCs - würde es dem Forscher ermöglichen, den Erfolg ihres Protokolls bei der Herstellung verschiedener Subtypen von RGCs zu bewerten. Die Auswertung der ZelltypenUnter diesen Neuronen würde von diesem Protokoll profitieren und kann auch als Werkzeug für die fortgesetzte Untersuchung von subtypspezifischen Markern dienen, da dieses Modellsystem leicht verfügbar ist.
Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir eine einfache Technik zur Isolierung und Vorbereitung einzelner Zellen für die transkriptomische Analyse. Darüber hinaus schlagen wir vor, wie man das Protokoll bearbeiten kann, damit diese Technik für eine Vielzahl von Experimenten mit einer Reihe von Zielen verwendet werden kann. Das hier beschriebene Protokoll wurde aus einem von Trombetta et al. 24 als Anpassung der empfohlenen Kit-Anleitungen für RNA-Seq. Die großen Unterschiede liegen in der Zellisolation und verschiedenen volumetrischen Veränderungen, die wir gewählt haben, um den Bedürfnissen dieses Projekts am besten zu entsprechen. Es ist wichtig zu betonen, dass der wichtigste Schritt in diesem Protokoll die Isolierung von Zellen aus dem Netzhautgewebe ist. Dies ist der Punkt im Protokoll DurinG die meisten Fehler auftreten können, und es sollte mit der sorgfältigsten Aufmerksamkeit durchgeführt werden. Jede Menge an Kontamination kann zu unbrauchbaren Proben führen, während der Verlust des Zytoplasmas eine schwere Verarmung von mRNA-Molekülen verursachen kann. Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden und durch die gleiche Person aus Experiment zu experimentieren, um sicherzustellen, dass die Proben präzise behandelt wurden.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine Technik für die Klassifizierung, Isolierung und Vorbereitung von Zellen für qualitativ hochwertige RNA-Seq. Dies ist eine effiziente, relativ kostengünstige Möglichkeit, die Qualität der Daten aus einzelnen Zellen zu optimieren. Diese Technik ist vielseitig und kann für die Anwendung auf verschiedene Studien minimal modifiziert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Jennifer Bair und Einat Snir sowie das Institut für Humangenetik der Universität Iowa für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung und Bearbeitung von Proben anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35 mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 mL MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10x Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5x Ultra Low First-strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase (RT) | ||
| 2x SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
References
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