Summary
इस प्रोटोकॉल में ड्रोसोफिला में एक स्केलेबल व्यक्तिगत सौंदर्य परख तकनीक का वर्णन किया गया है जो सौंदर्य के व्यवहार को मापने के लिए मजबूत, मात्रात्मक डेटा पैदा करता है। इस पद्धति का समय निर्धारित अवधि में गैर-व्युत्पन्न बनाम तैयार पशुओं के शरीर पर डाई संचय में अंतर की तुलना करने पर आधारित है।
Abstract
ड्रोसोफिला संवारने का व्यवहार एक जटिल बहु-कदम वाला चालन कार्यक्रम है जिसके लिए दोनों अग्रगमन और हिंदगैल के समन्वय की आवश्यकता होती है। यहां हम ड्रॉसोफिला के सौंदर्य के छोटे या बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए लागत-कुशल और स्केलेबल युक्त एक सौंदर्यीकरण प्रोटोकॉल और उपन्यास कक्ष डिजाइन प्रस्तुत करते हैं। मक्खियों को अपने शरीर के ऊपर उज्ज्वल पीले डाई के साथ धूसर कर दिया जाता है और चैम्बर के भीतर अपने शरीर से डाई हटाने के लिए समय दिया जाता है। डाई को सुलझाने के लिए मक्खियों को इथेनॉल के एक सेट वॉल्यूम में जमा किया जाता है। अपर्याप्त बनाम बेवकूफ जानवरों के लिए डाई-एथेनॉल नमूनों का सापेक्षिक वर्णक्रमीय अवशोषण मापा जाता है और रिकॉर्ड किया जाता है। प्रोटोकॉल अलग-अलग मक्खियों के लिए डाई संचय के मात्रात्मक आंकड़े पैदा करता है, जो आसानी से औसत और नमूनों में तुलना की जा सकती है। यह प्रायोगिक डिजाइनों को उत्परिवर्ती पशु अध्ययनों या सर्किट जोड़तोड़ के लिए सौंदर्य क्षमता का आसानी से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। यह कुशल प्रक्रिया बहुमुखी और स्केलेबल दोनों है। हम डब्ल्यू दिखाड्रोसोफिला प्रकार I डोपामाइन रिसेप्टर ( डीओपीआर ) के लिए प्रोटोकॉल का ओर्क-फ्लो और डब्ल्यूटीई जानवरों और उत्परिवर्ती जानवरों के बीच तुलनात्मक डेटा।
Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ( डी। मेलेनोगस्टर ) में सौंदर्य एक मजबूत जन्मजात व्यवहार है जिसमें कई स्वतंत्र मोटर कार्यक्रमों के समन्वयन शामिल है 1 । फलों ने धूल, रोगाणुओं और अन्य रोगजनकों के शरीर को साफ किया है जो दृष्टि और उड़ान जैसे सामान्य शारीरिक कार्य को रोक सकते हैं, या महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा चुनौतियां पैदा कर सकते हैं। संवेदन और दोनों यांत्रिक 2 का जवाब देने और प्रतिरक्षा सक्रियण 3 में, बार-बार उनके पैरों को एक साथ या एक लक्षित शरीर के क्षेत्र पर रगड़ना मक्खियों जब तक यह पर्याप्त रूप से साफ है और संवारने शरीर के दूसरे हिस्से की प्रगति। मक्खियों अलग-अलग मुकाबले में सौंदर्य आंदोलनों प्रदर्शन करते हैं जो बड़े पैमाने पर टकसाली पैटर्न 1 , 4 में होते हैं । एक व्यवहार पदानुक्रम स्पष्ट हो जाता है क्योंकि संकेतों को प्राथमिकता दी जाती है। सर्किट और गतिविधि के पैटर्न को समर्थन में पहचान की गई है oएफए मॉडल है कि पदानुक्रम के शीर्ष पर सौंदर्य कार्यक्रम पहले पाए जाते हैं और शरीर के उन क्षेत्रों से समानांतर संकेतों को दबा देते हैं जो बाद में 5 तैयार किए जाते हैं। सर्वोच्च प्राथमिकता सिर को दी जाती है, फिर पेट, पंख, और आखिर में छाती 5 ।
डी। मेलेनोगास्टर में सौंदर्य कार्यक्रम न्यूरल सर्किट, मॉंड्युलेटरी आणविक संकेतों और न्यूरोट्रांसमीटर का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉफिब्रोमिन फंक्शन 6 , ड्रोसोफिला नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन ( डीएफएमआर 1 ) 7 की हानि , और बिस्फेनोल ए (बीपीए) 8 के संपर्क में होने के कारण सभी अत्यधिक संवारने और अन्य व्यवहार जो न्यूरॉफिब्रोमैटिस के असतत मानव लक्षणों के समान हैं, नाजुक एक्स सिंड्रोम, और आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और ध्यान-घाटे सक्रियता विकार (एडीएचडी) के पहलू, क्रमशः। सौंदर्य व्यवहार भी आदत हो सकता हैउत्परिवर्ती उपभेदों में भिन्न रूप से टेड 2 , व्यवहार मोटर के अध्ययन के लिए इस मोटर कार्यक्रम को उधार दे। ड्रोसोफिला द्वारा मॉड्यूलन किए जा सकने वाली न्यूरोलॉजिकल घटनाओं की चौड़ाई में खुद को तैयार करने के लिए मक्खियों की क्षमता को मापने के लिए एक उपन्यास तुलनात्मक दृष्टिकोण की मांग होती है।
वेश्युलर मोनोमोना ट्रांसपोर्टरों की संयुक्त कार्रवाई और शरीर में डोपामाइन और अन्य बायोजेनिक अमीनों के रिश्तेदार बहुतायत से फल की सफाई 9 , 10 के बीच उड़ान भरने के लिए दिखाया गया है। ऑक्टापामाइन और डोपामाइन decapitated मक्खियों में तुलनीय hindleg सौंदर्य गतिविधि को उत्तेजित करते हैं, जबकि tyramine, octopamine के अग्रदूत, भी कम सीमा 7 को संवारने triggers। डी। मेलेनोगास्टर 11 , 12 , 13 , 14 में चार डोपामिन रिसेप्टर्स की पहचान की गई है डोपआर, डीडीए 1, गूंगा ) के लिए एक भूमिका निभाई है, जो कि 15 वीं शल्य चिकित्सा के लिए तैयार है।
सफाई परोक्ष रूप से सफाई की मात्रा को देखकर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जिसके द्वारा एक जानवर पूरी तरह से एक मार्कर डाई या फ्लोरोसेंट धूल 5 , 16 के साथ पूरे शरीर को धूल करने के बाद दूल्हे से दूषित कर सकता है। शरीर पर छोड़ दिया धूल का शेष समग्र व्यवहार के लिए रिश्तेदार मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। दुल्हन के लिए पर्याप्त समय दिए जाने के बाद डस्टी मक्खियों को व्यवहार को संतुलित करने में विशिष्ट घाटे को प्रकट किया जा सकता है। के रूप में संवारने जांच और अधिक व्यापक हो गए हैं, प्रोटोकॉल गर्दन संयोजी नसों 10 पर औषधीय उपचार जोड़ने के लिए कत्ल के रूप में इस तरह के व्यवहार को शामिल किया है, बाल के स्पर्श उत्तेजना संवारने प्रतिक्रिया 2 प्रकाश में लाना,और व्यवहार 15 की वीडियो रिकॉर्डिंग संवारने का प्रत्यक्ष अवलोकन आसानी से दृश्य अवलोकन का उपयोग कर और मैन्युअल रूप से आवृत्ति और विशिष्ट सौंदर्य घटनाओं 4 की अवधि रिकॉर्डिंग द्वारा अध्ययन किया जा सकता है।
हमने एक पंद्रह अच्छी तरह के सौंदर्य कक्ष बनाया है जिसे 3 डी प्रिंटर या लेजर कटर के साथ बनाया जा सकता है और ब्लूप्रिंट डिज़ाइन प्रजनन 15 के लिए उपलब्ध हैं। यह डिज़ाइन क्रमशः मक्खियों और / या डाई लोड किए जाने वाले दो से अधिक मध्यवर्ती प्लेट्स का उपयोग करता है, जो मैचों से मेल खाते हैं और अलग-अलग जाल और दो अतिरिक्त स्लाइडिंग शीर्ष और नीचे की प्लेटें हैं। दूषित मक्खियों को दूषित करने की अनुमति देने के बाद, हम डाई के तरंग दैर्ध्य पर डाई को हल करने और इस समाधान के शोषक को मापने के लिए उन्हें इथेनॉल में जमा करते हैं। अलग-अलग नमूनों के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग किया जा सकता है, एक से अधिक समानांतर नमूनों या एकल-पढ़े हुए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि से निपटने और अल द्वारा प्रेरित त्रुटि को कम करता हैछोटे, लागत प्रभावी स्केल पर चलाने के लिए एलेक्स को तैयार करने के लिए चढ़ाव यह विधि जूली सिम्पसन और एंड्रयू सीड्स द्वारा विकसित तरीके से प्राप्त की गई है, जो तापमान संवेदनशील सर्किट जोड़तोड़ 5 के लिए ताप तत्वों के साथ बड़े सौंदर्य कक्ष का उपयोग करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल पूरे शरीर को संवारने की मात्रा का विवरण देता है और व्यक्तिगत शरीर के अंगों पर डाई संचय के मात्रा के लिए वैकल्पिक तरीकों को दिखा रहा है। हम WT और DopR म्यूटेंट्स के बीच नमूना तुलना डेटा भी प्रस्तुत करते हैं, साथ ही साथ व्यवहार को सुचारू बनाने के लिए एक साधारण प्रदर्शन इंडेक्स की गणना के तरीकों के लिए।
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Protocol
1. तैयारी
- एक संस्कृति की शीशी से रहने वाले ड्रोसोफिला को तैयार करने के लिए एक एस्पिरेटर तैयार करें। अभेद्य व्यवहारशील कक्षों को चेतन पशुओं के हस्तांतरण की अनुमति देता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि संज्ञाहरण बाद के व्यवहारिक अवलोकन को प्रभावित नहीं करता है।
- कैंची का उपयोग टागॉन टयूबिंग आईडी 1.5 फीट में कटौती ⅛ ", ओडी ¼" .एक 1 एमएल डिस्पोजेबल माइक्रोप्रिपेट टिप की नोक के कम से कम 1 इंच बंद करें। कट टिप पर एक 1 सेमी चौकोर जाल (0.196 इंच खोलने) को पकड़ो।
नोट: अधिकांश 1 एमएल युक्तियों में एक क्रम रेखा है जहां टिप पैकेज बॉक्स में बैठता है, आमतौर पर उस पंक्ति में कट जाता है - जाली / कट टिप पर एक ताजा 1 एमएल माइक्रोप्रिपेट टिप रखें। जाल प्रपत्र को दो युक्तियों के बीच एक तंग बाधा का निरीक्षण करें नई टिप के अंदर मक्खियों के लिए एक होल्डिंग चैंबर बनाता है।
- एक एकल मक्खी के पारित होने की अनुमति देने के लिए खोलने की चौड़ाई को चौड़ा करने के लिए नई माइक्रोप्रिपेट टिप की चरम चीट कट। द होलई लगभग ऑर्गेनिक्स चैंबर (लगभग 1.5-2 मिमी व्यास) के उद्घाटन से मेल खाएगा।
- टॉगन टयूबिंग के अंत में नेस्टेड टिप्स को चुपचाप करें। वैक्यूम दबाव की अनुमति के लिए एक तंग फिट सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब में टिप्स को दबाएं।
- टयूबिंग के दूसरे छोर पर, 200 μL माइक्रोप्रिपेट टिप का टिप कट कर टयूबिंग में संकीर्ण कटौती के अंत में फिट हो। यह एस्पिरेटर के "मुंह" पक्ष है
- कैंची का उपयोग टागॉन टयूबिंग आईडी 1.5 फीट में कटौती ⅛ ", ओडी ¼" .एक 1 एमएल डिस्पोजेबल माइक्रोप्रिपेट टिप की नोक के कम से कम 1 इंच बंद करें। कट टिप पर एक 1 सेमी चौकोर जाल (0.196 इंच खोलने) को पकड़ो।
- धूल विभाज्य ट्यूबों को तैयार करें ताड़ के वजन वाले पेपर पर लगभग 5 मिलीग्राम का शानदार पीला डाईंग लें। धूल को 0.6 एमएल माइक्रोसेंट्रिज्यूज ट्यूब में डालें और टोपी को कसकर बंद करें।
नोट: हम विभाज्य तैयारी के दौरान नाइट्रीले दस्ताने के उपयोग की सलाह देते हैं, क्योंकि कुछ लाटेकस दस्ताने डाई के लिए पारगम्य हैं। - प्रयोग में सभी नमूनों के लिए चरण 1.2 (दोहराएं)) (प्रत्येक कक्ष में प्रत्येक फ्लाई के लिए एक)
- इथेनॉल (EtOH) ट्यूबों को तैयार करें: 1.5 एमएल माइक्रोप्रतियव्यू ट्यूब में 100% एटओएच के पाइपेट 1 एमएल। जीनोटाइप या शर्तों के लिए लेबल ट्यूब/ Li>
- प्रयोग में सभी नमूनों के लिए चरण 1.4 को दोहराएं) (प्रत्येक कक्ष में प्रत्येक फ्लाई के लिए एक) कैश और एटीओएच ट्यूब्स को संवारने की परख के पूरा होने के लिए बचाएं। इसके अलावा कम से कम एक "खाली" नमूना भी शामिल करें जो कि केवल 1 एमएल एटीओएच नं।
- स्लाइडिंग टॉप प्लेट (छोटे छेदों के साथ) को पकाकर प्रत्येक सौंदर्य कक्ष को इकट्ठा करें, लेकिन धूल से नीचे के प्लेट को छोड़कर (बड़े छेद के साथ) हटा दिया गया।
- प्रत्येक आवश्यक सौंदर्य कक्ष को एक मेज पर शीर्ष चेहरा नीचे के साथ रखें। प्रवेश पक्ष फ्लाई चेहरा नीचे है
- वांछित अच्छी तरह से ऊपर के कक्ष की सतह के विरुद्ध ट्यूब को टैप करके प्रत्येक कमरे में 5 मिलीग्राम शानदार पीला डाई विभाज्य लोड करें। तालिका के खिलाफ चैंबर को टैप करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी धूल शीर्ष जाल के ऊपर मेष के माध्यम से गिर जाएंगे।
- प्रत्येक कक्ष पर निचले प्लेट को भाड़ें, इस तरह से शंक्वाकार खुलने के बड़े छोर बाहर निकलते हैं और छेद कुओं पर आराम नहीं करते हैं। बॉट को सुरक्षित करेंटॉम प्लेट कसकर इतना है कि यह डाई को स्लाइड और रिलीज़ नहीं करता है।
- चैम्बर पर फ्लिप करें और इसे टेबल के खिलाफ फ्लैट पर दस्तक दो बार दबाएं ताकि धूल नीचे की थाली पर आराम करने के लिए मेष के माध्यम से गिर जाए।
- कक्ष की शीर्ष प्लेट को "खुली स्थिति" में स्लाइड करें ताकि छोटे छेद पंद्रह कुओं के साथ संरेखित हो जाएं, जिससे व्यक्तिगत कुओं में मक्खियों की शुरूआत हो सके।
2. फ्लाई-डस्टिंग और ग्रूमिंग
- एच्छिक के एक छोर से धीरे-धीरे चूसने से मुंह ऐस्पिरेटर में एक फ्लाई लोड करें जैसे कि पुआल का उपयोग करना। मक्खियों को हल्के ढंग से उड़ाने और लक्ष्य की ओर उद्घाटन निर्देशित करके जमा करें।
- प्रयोग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रत्येक में उड़ने की आकांक्षा। अच्छी तरह से लोड होने के बाद, शीर्ष प्लेट को स्लाइड करें ताकि मक्खी कक्ष में फंस हो और दूसरे कुओं को लोड करते समय मक्खी के बचने को रोकने के लिए पूरे चैम्बर के लोड होने के दौरान उस खुलने के दौरान टेप को जगह दी जा सके। यदि कई मक्खी एक सिंगल में aspirated हैंई अच्छी तरह से, जब तक कि केवल एक मक्खी रहता खुला जब तक खोलने छोड़ दें।
- सभी आवश्यक कुओं मक्खियों से भरे हुए हैं, कक्ष को फ्लिप करें जैसे कि नीचे की थाली ऊपरी होती है ताकि धूल में जाल के माध्यम से गिरने से मक्खियों को कोट की क्षमता हो।
- शिकंजा कसने से ऊपर और नीचे की प्लेटों को सख्ती से सुरक्षित रखें, और चारों के लिए मक्खियों को धूल करने के लिए कक्ष को भंवर।
- चैम्बर (टॉप प्लेट चालाक) को एक मेज के खिलाफ दो बार दस्तक दें ताकि डाई दूसरे तरफ से गिर जाए। उसके बाद, चैम्बर से ऊपर (शीर्ष प्लेट चेहरा-अप) फ्लिप करें और चैम्बर को दो बार खटखटाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि शीर्ष चैंबर में मक्खी से नीचे चैम्बर की मंजिल पर रंग डाला जाता है।
- नियंत्रण मक्खियों के लिए जो दूल्हे की अनुमति नहीं है, तुरंत प्रोटोकॉल के चरण 3 में आगे बढ़ें। मक्खियों के लिए जो परख पूरा करेगा, चरण 2.7 आगे बढ़ें
- मक्खियों को दुल्हन की अनुमति देने के लिए तीस मिनट के लिए शीर्ष प्लेट के साथ एक मेज या काउंटरटॉप पर फ्लैट कक्ष को आराम करें। चंबे को रखेंएआर एक शोर और कंपन-मुक्त अंतरिक्ष में अपने पर्यावरण को सभी सौंदर्य प्रयोगों (प्रकाश स्तर, आर्द्रता, और तापमान) के लिए निरंतर रखने के लिए। आरटी पर एक टेबलटॉप इनक्यूबेटर या आर्द्रता नियंत्रण के साथ 25 डिग्री सेल्सियस आदर्श है।
3. नमूने और अवशोषण विश्लेषण की तैयारी
- ऊपर की तरफ ऊपर की तरफ के साथ चैम्बर स्तर को रखते हुए, धीरे-धीरे नीचे की प्लेट को खोल देना और इसे कक्ष से हटा दें, सावधानी बरतें, डाई को खोना न दें।
- मक्खियों को कम किया जा रहा है जब तक कम हवा का प्रवाह के साथ एक मक्खी सीओ 2 पैड पर चैम्बर रखें।
- कक्ष से शीर्ष प्लेट को खोलें पैर को पकड़ने के लिए सावधानी से संदंश का उपयोग करें और प्रत्येक कक्ष से एक धूल फ्लाइंग ले जाएं और इसे 1.5 एमएल माइक्रोप्रोटीज युक्त एटओएच युक्त जमा करें। एक फ्लाई युक्त प्रत्येक 15 कक्षों के लिए स्थानांतरण का समय लगभग 3-5 मिनट है प्रयोगकर्ताओं के हस्तांतरण के समय में कारगर होना चाहिए, यदि / जब कई कक्षों के साथ चक्कर लगाने वाले प्रयोगों को प्रयोगों के कुशल मचान सुनिश्चित करने के लिए। एक बार प्रत्येक माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूब में 1 मक्खी होती है, कैप को बंद करें और तीन बार डाई और इथेनॉल के समाधान को उत्तेजित करके मिलाएं।
- मक्खी से डाई को हटाने के लिए समाधान में 5 घंटे के लिए इथेनॉल और मक्खियों वाले ट्यूब्स सेते हैं। 5 घंटे के बाद, मक्खियों से डाई को निकालने के लिए प्रत्येक ट्यूब (2 एस) को संक्षेप में भंवर।
- प्लेट पर प्रत्येक नमूने के स्थान की नोट लेते हुए उपलब्ध होने पर 96-अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से प्रयोगात्मक 1.5 एमएल ट्यूब के 50 μL को विभाज्य। नमूना 5x पतला करने के लिए 200 μL EtOH जोड़ें। कमजोर पड़ने से भारी धूल मक्खियों या बड़े सुर्खियों के दोषों के छत के प्रभाव से बचा जाता है।
- 397 एनएम पर प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक प्लेट रीडर का उपयोग करें वैकल्पिक रूप से, दृश्यमान स्पेक्ट्रम में एक मानक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर व्यक्तिगत नमूनों और रिक्त स्थान के लिए अवशोषण उपाय यदि कोई प्लेट रीडर अनुपलब्ध है।
- प्लेट रीडर के माध्यम से नमूना को पढ़ें और रिकॉर्ड करें और रिकॉर्ड के साथ स्प्रेडशीट को बचाएंप्लेट पर डी नमूने
4. परिणाम का मात्रा
- सभी नमूनों के लिए परिणाम संकलित करें और प्रत्येक जीनोटाइप या स्थिति के लिए भिन्नता को मापें।
नोट: समय पर 0 मिनट में डाई संचय और समय पर 30 मिनट अलग-अलग परिस्थितियों के रूप में एकतरफा एनोवा और बोनफोरोनि सुधार या कई समांतर तुलना के लिए अन्य सुधारों द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग किया जाता है। - निम्न समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक जीनोटाइप / हालत के लिए प्रतिशत के अनुपात में अंतर की गणना करें: [(डाई संचय का समय 0 समय पर होता है - डाई संचय का मतलब समय 30 पर होता है) / डाई संचय का मतलब समय 0] x 100 है।
- बार भूखंडों में प्रत्येक जीनोटाइप और हालत का प्रतिशत व्यक्त करें और जीनोटाइप और शर्तों में तुलना करें।
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Representative Results
संवारने के लिए मापन के निर्धारित समय (30 मिनट) के बाद मक्खियों के शरीर पर छोड़ दिया गया संचित डाई के रिश्तेदार शेष के आधार पर, व्यवहार निष्पादन का आकलन करने के लिए तैयार करने की आकांक्षात्मक मात्रा में मात्रा पैदा होती है। स्लाइडिंग सौंदर्य कक्ष डिजाइन और परख के प्रमुख कदम की नमूना चित्रों चित्रा 1 में उजागर कर रहे हैं। डाई ( चित्रा 2 डी, 2 ई ) की उपस्थिति में भंवर द्वारा तत्काल झाड़न से एक महत्वपूर्ण मात्रा में डाई उभरती है। डस्टेड मक्खियों को रंग-संचय पोस्ट-परय ( चित्रा 2 एफ, 2 जी ) की एक श्रेणी को बनाए रख सकते हैं। इसलिए, EtOH में डाई संचय को सुलझाने और व्यक्तिगत नमूनों के शोषक को मापने की क्षमता को प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अत्यधिक मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करता है।
डोपआर के इस अध्ययन में hindleg संवारने के विनियमन में, हम एक मजबूत हाइपोमोर्फ के सुन्दर प्रदर्शन की तुलना करते हैं (
मतभेदों की जांच करने के लिएपूर्वनिर्मित बनाम हिंदगैल तैयार करने वाले कार्यक्रमों की क्षमताओं को ध्यान में रखते हुए, हमने सीधा वस्त्रों के दौरान अलग-अलग शरीर के अंगों पर डाई संचय का मूल्यांकन किया ( चित्रा 4 )। व्यक्तियों के सिर, पंखों, या "शरीर" (पेट / छाती / पैर) को विदारक करके, हम परख के बाद मक्खियों को मज़बूती से जीनटाइपों के बीच अंतर और समानता को मापने में सक्षम थे। निष्कर्षों ने एक व्याख्या का समर्थन किया कि पूर्ववर्ती सौंदर्य कार्यक्रमों के लिए कोई मतभेद मौजूद नहीं थे, क्योंकि डब्ल्यूटी बनाम के प्रमुखों के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। डोपआर म्यूटेंट हालांकि, जीनोटाइप के बीच दोनों पंख और शरीर माप के लिए महत्वपूर्ण अंतर देखा गया। यह पूरक तकनीक पूरे मक्खियों के बजाय शरीर के अंगों पर प्राथमिक परख करने के लिए एक सरल विधि को पहले से बनाम हेंडेलेग सौंदर्य कार्यक्रमों में अंतर करने की अनुमति देता है। इन परिणामों को और अधिक विस्तारित किया गया और सावधान वर्तनात्मक अवलोकन और वीडियो रिकॉर्डिंग या पूर्ववर्ती या एच के व्यक्तिगत घटकों के ट्रैकिंग द्वारा समर्थित किया गयाइंडेग व्यवहार आंकड़े 2-4 से सभी परिणाम जीन, मस्तिष्क, और व्यवहार 15 से अनुमति के साथ पुन: उत्पन्न किए जाते हैं।
चित्रा 1: ड्रोसोफिला ग्रूमिंग परख कार्यप्रवाह यह सरलीकृत फ्लोचार्ट, सौंदर्यप्रयोग प्रोटोकॉल में प्रमुख कदमों की रूपरेखा है, जिसमें कुछ आवश्यक सामग्री और उपकरणों पर प्रकाश डाला गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: सौंदर्यीकरण का मात्राकरण आधारित डाई संचय पर आधारित। ( ए ) ग्रूमिंग चैंबर व्यक्तिगत मक्खियों और शानदार पीले डाई को अलग-अलग कुएं में रखा जाता है (1 मक्खी: 1 अच्छी तरह से) आयामऔर पूरक डेटा में उत्पादन के लिए ब्लूप्रिंट ( बी, डी, एफ ) डब्ल्यूटी वयस्क पुरुष ड्रोसोफिला (+ / +) ( सी, ई, जी ) डोप आर एफ 022676 / डोप आर एफ 202676 वयस्क पुरुष ड्रोसोफिला ( बी, सी ) झूलने से पहले मक्खियों। ( डी, ई ) सौंदर्य से पहले (समय: 0 मिनट) vortexing कक्ष द्वारा धूल करने के तुरंत बाद उड़ता है। ( एफ, जी ) तैयार करने के बाद मक्खियों (समय: 30 मिनट) स्केल बार = 400 माइक्रोन जीन, मस्तिष्क, और व्यवहार 15 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: सौंदर्यप्रवाह व्यवहार के मॉडुलन के लिए डोपामिन रिसेप्टर ( डोपआर / डीडीए 1 / गूंगा ) आवश्यक है। ( ए, सी, ई ) गैरूमिनझिलमिलाहट के बाद 0 मिनट या 30 मिनट पर जंगली सूक्ष्म (नीला) और उत्परिवर्ती मक्खियों (लाल / नारंगी) का जी। एसईएम प्रत्येक जीनोटाइप और हालत के लिए मापा जाता है। ( ए, बी ) एन = 43 प्रति जीनोटाइप और स्थिति मक्खियों। ( ए ) डब्ल्यूआरटी और डॉपआर एफ 202676 दोनों एक्सपोज़र को तैयार करने के व्यवहार (/ + + 30 '+/ + 0' = पी मूल्य <0.0001, डोपआर एफ 0 9 776 30 'की तुलना में डीओपीआर एफ 0,0676 0' = पी वैल्यू <0.0001) के मुकाबले मक्खियों में मक्खी है । डॉपआर मक्खियों को दूल्हे और साथ ही डब्ल्यूटीटी जानवरों ( DopR f02676 30 'की तुलना में + / + 30' = पी मूल्य <0.001) में विफल रहता है। धूल के बराबर संचय में 0 'परिणाम पर प्रत्येक जीनोटाइप के तीव्र झुकाव (एनएस = महत्वपूर्ण नहीं)। ( बी, डी, एफ ) ग्रूमिंग प्रतिशत अंतर प्रत्येक जीनोटाइप के लिए गणना की जाती है (डाई एक्सपैम। 0 '- डाई एक्सचेंज .30' / डाई एक्सम। 0 'x 100) में संवारने के व्यवहार की तुलना के लिए एक सापेक्ष मूल्य प्रदान करना। ( सी ) डोपआर एटप / डीओपीआर
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चित्रा 4: डोपामिन रिसेप्टर फंक्शन हिंदुस्त ग्रूमिंग को मजबूत करता है। ( ए ) डब्ल्यूटीएल (नीला) और डोपआर एफ 022676 / डीओपीआर एफ 0,0676 (लाल) के अलग-अलग क्षेत्रों को तैयार करने के बाद 30 मिनट में धुलाई और बाद में विच्छेदन के बाद मापा जाता है। पंख संवारने के लिए मूल्य पी = 0.0204 शरीर के लिए पी मान = 0.0302 एन = 33-35 सभी शर्तों के लिए मक्खियों एसईएम प्रत्येक जीनोटाइप और हालत के लिए मापा जाता है। वन वे एनोवा और बॉनिफेरोनी सुधार द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। जीन, मस्तिष्क, और व्यवहार 15 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
पूरक चित्रा: एनआईएच छवि जे पिक्सेल तीव्रता सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तैयार करने के व्यवहार के दृश्य मात्राकरण के लिए वैकल्पिक पद्धति। ( ए ) वील का विज़ुअलाइज़ेशनविदारक दायरे के तहत ड्रोसोफिला की विशेषता ओवल पिक्सेल तीव्रता के लिए विश्लेषण के क्षेत्र के रूप में पृष्ठीय पेट को परिभाषित करता है ( बी ) अल्ट्रा ग्रीन वी 10 फ्लोरोसेंट रंग वर्णक के साथ धूल के बाद पृष्ठीय पेट के विज़ुअलाइज़ेशन। हरे रंग की प्रतिदीप्ति के लिए मानक फिल्टर नीले-हरे वर्णक को कैप्चर करता है। ( सी ) यूटीवी 10 रंगद्रव्य (प्रीगरूमिंग) के साथ कोटिंग के बाद डब्ल्यू टी पशु। ( ई ) यूटीवी 10 रंगद्रव्य (पोस्टग्रूमिंग) के साथ कोटिंग के बाद डब्ल्यू टी पशु। ( डी ) DopRf02676 UGV10 रंगद्रव्य (pregrooming) के साथ कोटिंग के बाद homozygous उत्परिवर्ती। ( एफ ) DopRf02676 homogygous उत्परिवर्ती UGV10 रंगद्रव्य (पोस्ट सौंदर्य) के साथ कोटिंग के बाद। ( जी ) सभी परिस्थितियों के लिए पिक्सेल तीव्रता का मात्रा। प्रत्येक जीनोटाइप या स्थिति के लिए एन = 15 मक्खियों। वन वे एनोवा और बॉनिफेरोनी सुधार द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। Ns = nonsignificant अंतर *** एपी <0.001 का प्रतिनिधित्व करता है Plआसानी से इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सौंदर्य परख अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन हम प्रयोगकर्ताओं को निम्न मुद्दों पर विशेष ध्यान देने के लिए सावधानी बरतें। मक्खियों को शुरू करने के बाद शीर्ष और नीचे की प्लेटों पर शिकंजा को कस कर तंग सील बनाए रखना प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए आवश्यक है। शानदार पीले डाई बहुत ठीक है और ढीली जोड़ों से कक्ष के किनारों से डाई के नुकसान की अनुमति होगी। प्रत्येक अच्छी तरह से डाई कंटेंट में अनियमितता को आसानी से फीताईजिंग को फेंक दिया जा सकता है क्योंकि नॉन-वर्दी धूलिंग से घटनाओं को बढ़ाने के लिए विचरण और झूठी सकारात्मक दरों में वृद्धि होगी। इसके अतिरिक्त, हम प्रयोगकर्ताओं को पर्यावरण के बारे में पता करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं जिसमें वे 30 मिनट की सजा अवधि के दौरान सौंदर्य कक्ष को चुनते हैं। ड्रोसोफिला व्यवहार एनेल्स के लिए लगातार प्रदर्शन के लिए तापमान, प्रकाश, दिन का समय और आर्द्रता के लिए पर्यावरणीय स्थिरता आवश्यक है। ध्यान देने योग्य ओ को कम करने के लिए एक छोटे से इनक्यूबेटर के भीतर संवारने वाले कक्षों को पकड़े हुए हैंआर वैरिएबल लैब वातावरण परिणाम की अधिकतम प्रजनन के लिए आदर्श है, लेकिन अन्य स्थानिक व्यवस्था भी सफल हो सकती है।
संचय माप डाई जाने के संबंध में, हमने देखा है कि डाई लेटेक्स दस्ताने के लिए प्रचलित है, इसलिए नैट्रीले दस्ताने धूल से निपटने और वजन करने के लिए बेहतर हैं। लैब सतहों में व्यापक रूप से धूल को फैलाने के लिए सावधानी बरतें, क्योंकि यह आसानी से कपड़े दाग लेगा और संभावित रूप से सतहों या उपकरणों को दूषित कर सकता है। एक क्षेत्र और एक फ्लाई स्टेशन / सीओ 2 पैड को अलग-अलग प्रयोगों से अलग करना, डाई एक्सपोजर को शामिल करना बेहतर है। हम प्रयोगकर्ताओं को यूवी-पारदर्शी 96-अच्छी तरह प्लेट्स का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए भी प्रोत्साहित करते हैं। शानदार पीले डाई के लिए 397 एनएम शोषक पीक, यूवी स्पेक्ट्रम के पास है, और मानक 96 अच्छी तरह प्लेटें डाई dilutions के लिए कमजोर या गलत उपाय दे सकती हैं। डाई एटओएच के विकल्प के रूप में पानी में भी घुलनशील है। हालांकि, ड्रोसोफिला पानी में बिना किसी महत्वपूर्ण झरझरा और छोटे हवा के बुलबुले के बिना डूबने लगते हैंरंगे जानवरों के शरीर को कम स्थिरता और डाई की विलेयता दिखाते हैं। इथनॉल सीधे तुलना में लगातार बेहतर परिणाम और निम्न भिन्नता दिखाता है।
हमारी परख आसानी से पूरक तकनीकों और अधिक परिशोधित अध्ययनों के लिए संशोधित की जा सकती है, जैसे मक्खी शरीर के बाद के परख ( चित्रा 4 ) के विच्छेदन। इस प्रकार की खुराक को समझना आवश्यक हो सकता है कि कौन से सौंदर्य कदम प्रभावित हो रहे हैं, क्योंकि डाई संचय केवल मौलिक जैविक या तंत्रिका कारणों को सीधे संबोधित किए बिना व्यवहारिक बदलावों को संदर्भित करता है। एक बार मतभेद दिखाई देते हैं, तो दक्षता को संवारने में किसी भी मतभेद की व्यवहारिक जड़ को समझने में वीडियो रिकॉर्डिंग या प्रत्यक्ष-निरीक्षण पद्धतियों के उपयोग के समानांतर प्रयोग आवश्यक हैं। यह एनआईएच आईजेडीजे सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के माध्यम से पिक्सेल तीव्रता उपायों का उपयोग करके विशिष्ट शरीर के अंगों पर धूल कण संचय के दृश्य मात्रा का ठहराव द्वारा आगे की जांच की जा सकती है, साथ ही अग्रगमन और हिंडालेज के प्रत्यक्ष ट्रैकिंग के साथवीडियो फुटेज स्कोरिंग से व्यवहार फ्लोरोसेंट धूल के दृश्य मात्रा का ठहराव के वैकल्पिक तरीकों के संबंध में, प्रयोगशाला में प्रारंभिक प्रयोगों ने अल्कालीन रेयर अर्थ मेटल सिलिकेट-अल्युमिनेट ऑक्साइड यूरोपियम से प्राप्त फ्लोरोसेंट रंग वर्णक का उपयोग किया। मक्खियों को फ्लोरोसेंट रंग के रंगों के साथ धूल करने और जानवरों को सौंदर्यीकरण करने के बाद एनाटेटिटिंग या डीपिटिट करने के बाद, निकायों को एक विदारक क्षेत्र ( पूरक डेटा ) पर जीएफपी के लिए एक मानक फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग करके डिजिटल माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज और विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि यह विधि पिक्सेल तीव्रता के सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, जो कि शानदार पीले डाई का उपयोग करते हुए परिणामों को समानता प्रदान करता है, हमने पाया कि इस पद्धति का प्रवाह अपेक्षाकृत धीमा है और वर्णक कण आकार में थोड़ा भिन्न होते हैं और ब्राइटियंट के लिए देखे गए कोटिंग से कम समान होते हैं पीला डाई हालांकि कुछ प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए यह वैकल्पिक विधि उपयुक्त है, और उपलब्ध फ्लो में महत्वपूर्ण विविधताएं हैंड्रोसोफिला और नैन्ड्रोसोफिला अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकते हैं या अलग-अलग घटनाओं की मात्रा का ठहराव करने के लिए उपयोगी हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रंग वर्णक ही पानी में घुलनशील है, लेकिन पानी में इसकी प्रतिदीप्ति को तेजी से खो देता है, जो मानक अवशोषण उपायों के लिए इस रंगद्रव्य की उपयोगिता को गंभीरता से बाधित करता है।
एक विशेष प्रकार की विशिष्टता को समझने के लिए विशिष्ट पूर्वकाल या हिंडाल्जेजिंग घटनाओं को लक्षित करने के लिए इन प्रकार के तरीकों की आवश्यकता होती है और यह आगे की जांच के लिए संभावित तंत्रिका सर्किट या गतिरोध कार्यक्रमों को उजागर कर सकता है। इसके अतिरिक्त, समानांतर नियंत्रण प्रयोगों के लिए, संभावित गैर-विशिष्ट व्यवहार कारणों से शासन करना जरूरी है क्योंकि सौंदर्य को प्रभावित किया जा सकता है यदि जानवरों को व्यापक मोटर घाटे या असामान्यताएं दिखती हैं, तो यह संभव है कि सौंदर्य घटकों को व्यापक गतिरोधी फेनोटाइप के माध्यम से जोड़ा जा सके। उत्परिवर्ती या परिभ्रमण बनाम डब्ल्यूटीई जानवरों का सरल वीडियो-ट्रैकिंगसीट में हेरफेर की स्थिति आसानी से बड़े पैमाने पर बदलाव या कुल दूरी की यात्रा के बीच भेदभाव कर सकती है, जो कि घाटे को संरक्षित करने के लिए स्वतंत्र है।
इस परिष्कृत multistep locomotor कार्यक्रम के छोटे और बड़े पैमाने पर अध्ययन दोनों के लिए उपयुक्त परछाई एक बहुमुखी पद्धति है; डिजाइन आसानी से चैम्बर आयाम या संख्या 15 को बढ़ाने के लिए संशोधित किया जाता है इस पद्धति की वजह से मक्खियों की 'सौंदर्य क्षमता' के तुलनात्मक आकलन के लिए आदर्श मात्रात्मक मात्रात्मक डेटा पैदा होता है। कक्षों का उत्पादन लागत प्रभावी है, और उपलब्ध संसाधनों के आधार पर कई विभिन्न मशीनों (3 डी प्रिंटर, लेजर कटर, सीएनसी मिल्स) का उपयोग करके किया जा सकता है। यह तकनीक व्यक्तिगत नमूनों के मध्यवर्ती थ्रूपुट के लिए अनुमति देता है जो आनुवंशिक स्क्रीन और कार्यात्मक सर्किट-मैपिंग अध्ययनों के लिए आसानी से विस्तारित हो सकते हैं।
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Disclosures
लेखक किसी प्रकार के हित संघर्ष की घोषणा नहीं करते।
Acknowledgments
हम इस कार्यप्रणाली और चैम्बर डिज़ाइनों के परीक्षण और स्थापना में प्रारंभिक कार्य के लिए ब्रायन शेफर्ड, तत उदमुतथिरुज, हारून विली, रूबी फूम, एलिस पिटमन, और रोज हेदरिन को धन्यवाद देना चाहते हैं। पांडुलिपि पढ़ने और संपादित करने के लिए हम केली टेललेज़ और ग्राहम बुकन को धन्यवाद देते हैं। हम एंड्रयू सीड्स और जूली सिम्पसन को उनके अग्रणी काम के लिए और उनकी सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद करते हैं, जो कि शानदार पीला डाई (सिग्मा) का इस्तेमाल करते हैं। यह काम मैरी ई। ग्रॉफ सर्जिकल एंड मेडिकल रिसर्च एंड एजुकेशन चैरिटेबल ट्रस्ट, ब्रॉन्फ़मैन साइंस सेंटर और हेलमैन फैलो प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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