このプロトコールは、グルーミング行動を測定するための堅牢で定量的なデータをもたらす、 ショウジョウバエにおけるスケーラブルな個々のグルーミングアッセイ技術を記載する。この方法は、一定期間にわたり、無毛化された動物と不毛化した動物の体の色素蓄積の差を比較することに基づいている。
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この記事について
サマリー
要約
ショウジョウバエのグルーミング行動は、前肢および後肢の両方の協調運動を必要とする複雑な多段階歩行プログラムである。ここでは、 ショウジョウバエのグルーミングの小規模または大規模の研究のいずれかのための費用対効果とスケーラビリティであるグルーミングアッセイプロトコルと新規チャンバーデザインを紹介します。ハエはブリリアントイエロー染料と体内の体から染料を除去するために与えられた時間で彼らの体のいたるところに散布されます。次に、フライを一定量のエタノール中に沈着させて色素を可溶化する。グルーミングされた動物と不毛飼育された動物の色素 - エタノール試料の相対的な吸光度を測定し、記録する。プロトコルは個々のハエの色素蓄積の定量的データをもたらし、これは容易に平均化され、サンプル間で比較され得る。これにより、実験的デザインは、突然変異動物研究または回路操作のためのグルーミング能力を容易に評価することが可能になる。この効率的な手順は、汎用性と拡張性の両方を備えています。我々はwを示すショウジョウバエ I型ドーパミン受容体（ DopR ）のためのWT動物と突然変異動物との間のプロトコルおよび比較データのork-flow。
概要
ショウジョウバエmelanogaster （ D. melanogaster ）のグルーミングは、複数の独立した運動プログラムの調整を含む強力な生得的な行動である1 。フルーツの飛行は、ビジョンや飛行などの正常な生理機能を阻害する可能性のあるほこり、微生物、およびその他の病原体の体を清潔にするか、または重大な免疫挑戦につながります。機械的2および免疫活性化3の両方を感知し、応答すると、十分にきれいになり、グルーミングが身体の別の部分に進行するまで、ハエはそれらの足を一緒に、または対象の身体領域上で繰り返し擦る。ハエは、主に定型パターン1,4で発生する異なる発作でグルーミング運動を行います。グルーミング信号が優先されると、行動階層が明らかになる。回路と活動のパターンは、階層の最上部にあるグルーミングプログラムが最初に発生し、その後5手入れされている身体の領域からパラレル信号を抑制FAモデル。頭部に最も高い優先順位が与えられ、次に腹部、翼部、そして最後に胸部が与えられる5 。
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プロトコル
1.準備
- 生きたショウジョウバエを培養バイアルからグルーミングチャンバーに移動するための吸引器を準備する。アスピレーターは、麻酔がその後の行動観察に影響しないように、行動室に意識のある動物を移すことを可能にする。
- はさみを使用して、1.5フィートのタイゴンチューブID 1/8 "、OD¼"を切断します。1 mLの使い捨てマイクロピペットチップの先端から少なくとも1インチは外します。カット先端に1cm四方のメッシュ（開口部0.196インチ）を保持する。
注記：ほとんどの1mLチップには、チップがパッケージボックスに収まるグラデーションラインがあります。通常、そのラインまでカットされます。 - 新しい1 mLのマイクロピペットチップをメッシュ/カットチップの上にしっかりと置きます。 2つのヒントの間にメッシュフォームがきつい障壁があることを確認してください。新しいチップの内側はハエのための保持室を作ります。
- 新しいマイクロピペット先端の極端な先端を切断して、シングルフライの通過を可能にするのに十分な開口部を広げる。ホールeは、グルーミングチャンバの開口部（直径約1.5~2mm）にほぼ一致する。
- 入れ子状の先端をタイゴンチューブの端にぴったりとはめ込みます。ヒントをチューブに押し込んで、真空圧力に耐えられるようにしっかりと固定します。
- チュービングのもう一方の端で、20....
- はさみを使用して、1.5フィートのタイゴンチューブID 1/8 "、OD¼"を切断します。1 mLの使い捨てマイクロピペットチップの先端から少なくとも1インチは外します。カット先端に1cm四方のメッシュ（開口部0.196インチ）を保持する。
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結果
グルーミングアッセイは、グルーミングの測定時間（30分）後にハエの体に残った色素の相対的残量に基づいて行動性能を評価するための定量的データをもたらす。スライドグルーミングチャンバー設計のサンプル画像およびアッセイの主要なステップが図1に示されています 。ハエは、色素の存在下でボルテックスすることにより、即時の散布からかなりの量の色素を凝集させる（ 図2d、2e ）。散布されたハエは、アッセイ後の色素蓄積の範囲を保持することができる（ 図2f、2g ）。したがって、EtOH中に色素蓄積を可溶化し、個々の試料の吸光度を測定することにより、再現可能で非常に定量的なグルーミング能力の評価が提供される。
後肢グルーミングの調節にDopRのこの研究では、（強いハイポモルフのグルーミングの性能を比較しました
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ディスカッション
グルーミングアッセイは比較的簡単ですが、以下の問題に特別な注意を払うように実験者に注意します。ハエと染料を導入した後、上板と下板のネジを締めることでしっかりとシールを維持することは、再現性のある結果には不可欠です。ブリリアントイエロー染料は非常に細かく、ゆるいジョイントはチャンバーの端から染料を失うことになります。個々のウェルの色素含有量の不規則性は、不均一な散布がグルーミングイベントの変動および偽陽性率を増加させるため、グルーミング定量化を容易に捨てることができる。さらに、実験者は、30分間のグルーミング期間中にグルーミングチャンバーを保持する環境を知っておくことをお勧めします。 ショウジョウバエ行動アッセイの一貫した性能を得るためには、温度、照明、時間、および湿度に対する環境の不変性が不可欠です。気を散らすことを最小限に抑えるために小さなインキュベーター内にグルーミングチャンバーを保持するさまざまなラボ環境が結果の最大限の再現性には理想的ですが、他の空間配置も成功する可能性があります。
色素蓄積測定に関しては、色素がラテックス手袋に対して透過性であることが観察.......
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開示事項
著者らは、利害の対立を宣言していない。
謝辞
この方法論とチャンバデザインのテストと確立の初期の仕事については、Brian Shepherd、Tat Udomritthiruj、Aaron Willey、Ruby Froom、Elise Pitmon、Rose Hedreenに感謝します。私たちはKelly TellezとGraham Buchanに原稿の読み書きについて感謝します。 Brilliant Yellow Dye（Sigma）の使用を提案する上での先駆的な仕事と助言と支援についてAndrew SeedsとJulie Simpsonに感謝します。この仕事は、Mary E. Groff外科医学研究および教育慈善団体、ブロンフマン科学センター、ヘルマンフェロープログラムによって一部サポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ハイフレックスタイゴンPVCクリアチューブ | マクマスターカー5229K54 | ID 1/8インチ、OD 1/4インチ、マイクロピペットチップとメッシュを使用して口内吸引器を構築 | |
| マイクロピペットチップ(1mLおよび200 μL) | ジェネシーサイエンティフィック | 24-165、24-150R | |
| ナイロンメッシュスクリーン、2 x 2.6インチ | McMaster-Carr | 9318T44 | グルーミングチャンバーと口の吸引器を構築するために使用されます |
| デュモン#5鉗子 | ロボッツ手術器具 | RS-5050 | |
| リアントイエロー染料 | グマアルドリッチ | 201375-25G | この製品を |
| 取り扱う際にはニトリル手袋の使用をお勧めしますVortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| エタノール | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL 微量遠心チューブ | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL 微量遠心チューブ | VWR International | 20170-293 | チューブは、連続アッセイで再利用可能 |
| UV 96 ウェルプレート | Corning | ||
| BioTek Synergy HTX プレートリーダー | BioTek | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview | |
| Microsoft Excel | Microsoft | にアクセスするためにカタログをダウンロードする必要がありますhttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| ショウジョウバエインキュベータ | ーTritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4 "アクリルプラスチック | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1 "六角キャップネジ | McMaster-Carr | 92185A199 | 底板は、このサイズのネジ8 |
| - 32 x 1/2 "六角キャップネジのためにタップする必要があります | マクマスター | カー92185A194 | 上から2番目のプレートは、 |
| タップする必要があります2 - 56 3/8"フラットヘッドフィリップス小ネジ | McMaster-Carr | 91500A088 | これらは、2つの中間プレートを一緒に保持 |
| 0.175インチID、1/4インチOD、0.34インチアルミパイプ | マクマスターカー92510A044 | 自社で製造。記載されている製品はほぼ同じ寸法で、サイズ8のネジで機能します。 これらは1インチネジのシースとして機能し、六角キャップをトッププレートの表面から少し上に設置 |
参考文献
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F.
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再版と許可
