Summary
このプロトコールは、グルーミング行動を測定するための堅牢で定量的なデータをもたらす、 ショウジョウバエにおけるスケーラブルな個々のグルーミングアッセイ技術を記載する。この方法は、一定期間にわたり、無毛化された動物と不毛化した動物の体の色素蓄積の差を比較することに基づいている。
Abstract
ショウジョウバエのグルーミング行動は、前肢および後肢の両方の協調運動を必要とする複雑な多段階歩行プログラムである。ここでは、 ショウジョウバエのグルーミングの小規模または大規模の研究のいずれかのための費用対効果とスケーラビリティであるグルーミングアッセイプロトコルと新規チャンバーデザインを紹介します。ハエはブリリアントイエロー染料と体内の体から染料を除去するために与えられた時間で彼らの体のいたるところに散布されます。次に、フライを一定量のエタノール中に沈着させて色素を可溶化する。グルーミングされた動物と不毛飼育された動物の色素 - エタノール試料の相対的な吸光度を測定し、記録する。プロトコルは個々のハエの色素蓄積の定量的データをもたらし、これは容易に平均化され、サンプル間で比較され得る。これにより、実験的デザインは、突然変異動物研究または回路操作のためのグルーミング能力を容易に評価することが可能になる。この効率的な手順は、汎用性と拡張性の両方を備えています。我々はwを示すショウジョウバエ I型ドーパミン受容体（ DopR ）のためのWT動物と突然変異動物との間のプロトコルおよび比較データのork-flow。
Introduction
ショウジョウバエmelanogaster （ D. melanogaster ）のグルーミングは、複数の独立した運動プログラムの調整を含む強力な生得的な行動である1 。フルーツの飛行は、ビジョンや飛行などの正常な生理機能を阻害する可能性のあるほこり、微生物、およびその他の病原体の体を清潔にするか、または重大な免疫挑戦につながります。機械的2および免疫活性化3の両方を感知し、応答すると、十分にきれいになり、グルーミングが身体の別の部分に進行するまで、ハエはそれらの足を一緒に、または対象の身体領域上で繰り返し擦る。ハエは、主に定型パターン1,4で発生する異なる発作でグルーミング運動を行います。グルーミング信号が優先されると、行動階層が明らかになる。回路と活動のパターンは、階層の最上部にあるグルーミングプログラムが最初に発生し、その後5手入れされている身体の領域からパラレル信号を抑制FAモデル。頭部に最も高い優先順位が与えられ、次に腹部、翼部、そして最後に胸部が与えられる5 。
D. melanogasterのグルーミングプログラムは、神経回路、調節分子シグナル、および神経伝達物質を研究するための理想的なシステムです。例えば、ニューロフィブロミン機能6の妥協、 ショウジョウバエ脆弱X精神遅滞タンパク質（ dfmr1 ） 7の 喪失 、およびビスフェノールA（BPA） 8への曝露はすべて、神経線維腫症の個別のヒト症状である壊れやすいX症候群に類似した過剰なグルーミングおよび他の挙動を引き起こすシンドローム、および自閉症スペクトル障害および注意欠陥多動性障害（ADHD）の局面が含まれる。グルーミングの行動もハビツァになることができます突然変異株2を差別的に区別し、この運動プログラムを行動可塑性の研究に貸与する。 ショウジョウバエによってモデル化され得る神経学的現象の幅は、ハエが自分自身を調整する能力を測定するための新規な比較アプローチを必要とする。
小胞モノアミントランスポーターの組み合わせ作用と体内のドーパミンおよび他の生体アミンの相対的存在量は行動9、10グルーミングショウジョウバエを媒介することが示されています。オクトパミンとドーパミンは、断頭されたハエの同等の後部グルーミング活動を刺激しますが、オクトパミンの前駆物質であるチラミンもまた、より少ない程度でグルーミングを引き起こします7 。四つのドーパミン受容体はキイロショウジョウバエ 11、12、13、14で同定されています15におけるI型ファミリードーパミン受容体DopR（ DopR、dDA1、dumb ）の役割を決定した15 。
グルーミングを間接的に動物が完全マーカー色素または蛍光ダスト5、16で全体体を散布した後、グルーミングことが可能な清浄度の程度を調べることによって定量することができます。身体に残った残りの塵は、全体的な行動の相対的マーカーとして使用することができます。グルーミングするのに十分な時間が与えられた後のほこりは、グルーミング行動の特定の欠点を示している可能性がある。グルーミング調査がより広範になったので、プロトコルは、首の結合神経10に薬理学的処置を加えるための断頭、グルーミング応答2を誘発するための剛毛の触覚刺激、行動のビデオ録画15 。グルーミングの直接観察は、目視観察を使用し、特定のグルーミングイベントの頻度と期間を手作業で記録することによって、容易に研究することができます4 。
我々は、3Dプリンタまたはレーザーカッターで構築できる15ウェルのグルーミングチャンバーを設計し、青写真のデザインは再現のために利用可能である15 。この設計では、メッシュで仕切られた開口部を有する2つの接合された中央プレートと、ハエおよび/または染料がそれぞれ装填される2つの追加のスライド式上部および底部プレートとを使用する。散布したハエの草分けを許可した後、我々はそれらをエタノールに沈殿させて染料を可溶化し、この溶液の吸光度を染料の波長で測定する。複数の平行なサンプルにはプレートリーダーを使用でき、個々のサンプルにはシングルリード分光光度計を使用できます。この方法は、ハンドリングによって引き起こされる誤差を最小限にし、より小さな、コスト効率の高いスケールで実行されるグルーミングアッセイの最低水準。この方法は、温度感受性回路操作5ための加熱要素と、より大きなグルーミングチャンバを使用ジュリーシンプソンとAndrew種子、によって開拓された方法に由来し、修飾されています。以下のプロトコールは、全身の毛づくろいの定量化を示し、個々の身体部分に色素蓄積の定量化のための代替方法を示す。我々はまた、WTとDopR突然変異体の間のサンプル比較データ、およびグルーミング行動のための単純な性能指数を計算する方法を提示する。
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Protocol
1.準備
- 生きたショウジョウバエを培養バイアルからグルーミングチャンバーに移動するための吸引器を準備する。アスピレーターは、麻酔がその後の行動観察に影響しないように、行動室に意識のある動物を移すことを可能にする。
- はさみを使用して、1.5フィートのタイゴンチューブID 1/8 "、OD¼"を切断します。1 mLの使い捨てマイクロピペットチップの先端から少なくとも1インチは外します。カット先端に1cm四方のメッシュ（開口部0.196インチ）を保持する。
注記：ほとんどの1mLチップには、チップがパッケージボックスに収まるグラデーションラインがあります。通常、そのラインまでカットされます。 - 新しい1 mLのマイクロピペットチップをメッシュ/カットチップの上にしっかりと置きます。 2つのヒントの間にメッシュフォームがきつい障壁があることを確認してください。新しいチップの内側はハエのための保持室を作ります。
- 新しいマイクロピペット先端の極端な先端を切断して、シングルフライの通過を可能にするのに十分な開口部を広げる。ホールeは、グルーミングチャンバの開口部（直径約1.5~2mm）にほぼ一致する。
- 入れ子状の先端をタイゴンチューブの端にぴったりとはめ込みます。ヒントをチューブに押し込んで、真空圧力に耐えられるようにしっかりと固定します。
- チュービングのもう一方の端で、200μLのマイクロピペットチップの先端を切断し、細い切断端をチューブにはめ込む。これはアスピレーターの「口」側です。
- はさみを使用して、1.5フィートのタイゴンチューブID 1/8 "、OD¼"を切断します。1 mLの使い捨てマイクロピペットチップの先端から少なくとも1インチは外します。カット先端に1cm四方のメッシュ（開口部0.196インチ）を保持する。
- アリコートチューブを準備する。風袋計量紙に約5mgのブリリアントイエロー染料を秤量する。塵を0.6 mLのマイクロ遠心チューブに注ぎ、キャップをしっかり閉めます。
注：一部のラテックス手袋は染料に対して透過性であるため、アリコート調製中にニトリル手袋を使用することをお勧めします。 - 実験中のすべてのサンプル（各チャンバーのすべてのフライに対して1つずつ）について、ステップ1.2）を繰り返す。
- エタノール（EtOH）チューブを調製する：100mLのEtOH 1mLを1.5mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れる。遺伝子型または条件についてチューブにラベルを付ける</ li>
- 実験のすべてのサンプル（各チャンバーのすべてのフライに対して1つずつ）について、ステップ1.4）を繰り返す。グルーミングアッセイの完了のためにEtOHチューブをキャップして保存する。少なくとも1つの「ブランク」サンプルも含まれています。このサンプルは、ネガティブコントロールのためのフライなしでEtOH 1 mLのみになります。
- 各グルーミングチャンバーを、摺動天板（より小さな穴を有する）をねじ込むことによって組み立てるが、ほこりの添加のために底板（より大きな穴を有する）を取り外したままにする。
- 各必要なグルーミングチャンバーを、上面を下にした台の上に平らに置きます。フライエントリー側がフェイスダウンです。
- チューブを所望のウェルの上にあるチャンバの表面に当てて、各チャンバに5mgのブリリアントイエロー色素アリコートをロードする。すべてのほこりがメッシュを通って天板に落ちるように、テーブルに向かってチャンバーをタップします。
- 円錐形の開口部の広い方の端が外側を向くように、底板を各チャンバーにねじ込み、穴がウェルの上に載っていないようにします。ボットを保護するトムプレートがしっかりとスライドして染料を放出しないようにします。
- チャンバーを裏返しにして、テーブルに数回平らにノックして、ほこりがメッシュを通って底板に載るようにします。
- 小さな穴が15個のウェルと整列するように、チャンバーの天板を「開位置」にスライドさせて、個々のウェルにハエを導入できるようにします。
2.フライダストとグルーミング
- ストローを使用しているかのようにアスピレーターの一端を静かに吸い込んで、1本のフライを口腔アスピレーターに入れます。軽く吹いて、ターゲットに向かって開口部を向けることによって、ハエを沈着させる。
- 実験に使用された各ウェルに1つのフライを吸う。ウェルをロードした後、フライがチャンバー内に閉じ込められるようにトッププレートをスライドさせ、他のウェルをロードしている間にフライの脱出を防ぐためにチャンバー全体のローディング中にテープをウェルの開口部の上に置きます。複数のハエが1つに吸引された場合eは、1つのフライだけが残るまで、その開口部を開けたままにしておきます。
- 必要な井戸のすべてがハエで満たされた後、ボトムプレートが上向きになるようにチャンバを反転させて、ホコリがメッシュを通ってハエを覆う可能性があるようにします。
- スクリューを締めて上部と下部のプレートをしっかりと固定し、ボルテックスして4秒間飛ばします。
- 染料が反対側に落ちるように、テーブル（上のプレートを下にして）を2度ノックしてください。次にチャンバーを裏返し（天板を上にして）、チャンバーを2回ノックして、上部チャンバーに保持されたフライから底部チャンバーの床に染料が落ち着くようにします。
- グルーミングが許可されていないコントロールハエについては、すぐにプロトコールのステップ3に進む。アッセイを完了するハエについては、ステップ2.7に進む。
- 上のプレートを上にしてテーブルまたはカウンタートップに30分間部屋を平らに置いて、ハエがきれいになるようにします。チャンバーを置く騒音と振動のない空間で、すべてのグルーミング実験（照明レベル、湿度、温度）を一定に保ちます。 RTまたは25°Cの湿度コントロールを備えた卓上型インキュベーターが理想的です。
試料の調製および吸光度分析
- 天板を上にしてチャンバーを水平に保ち、底板を緩やかに緩めて、チャンバーから取り出し、色素を失わないように注意してください。
- ハエが麻酔されるまで、気流の少ないフライCO 2パッドにチャンバーを置きます。
- チャンバーからトッププレートを外します。注意深く鉗子を使用して脚をつかみ、各チャンバーから1つの飛散したフライを動かし、EtOHを含む1.5mLの微量遠心チューブに入れてください。各フライを含む15個のチャンバーの移動時間は約3〜5分である。実験の効率的なステージングを確保するために、複数のチャンバーで驚異的な実験を行う場合、実験者は移動時間を考慮する必要があります。 各マイクロ遠心チューブに1フライが含まれたら、キャップを閉めてチューブを3回転倒させて、色素とエタノールの溶液を攪拌して混合します。
- エタノールとハエを含むチューブを室温で5時間インキュベートして、フライから溶液中に染料を完全に除去する。 5時間後、各チューブ（2秒間）を短時間ボルテックスして、ハエからの染料のクリアランスを確保する。
- プレート上の各サンプルの位置に注目して、使用可能であれば、96ウェルプレートのウェルに50μLの実験用1.5mLチューブを分注する。試料5xを希釈するために200μLのEtOHを添加する。この希釈は、多量の飛散したハエや大きなグルーミング欠陥の天井効果を回避します。
- プレートリーダーを使用して、各サンプルを397 nmで分析します。あるいは、プレートリーダーが利用できない場合、可視スペクトルの標準分光光度計で個々のサンプルおよびブランクの吸光度を測定する。
- プレートリーダーを介してサンプルを読み取り、記録し、スプレッドシートをレコーダーで保存するdプレート上のサンプル。
4.結果の定量化
- すべてのサンプルの結果をコンパイルし、各遺伝子型または条件の分散を測定します。
注：時間0分および時間30分の色素蓄積は、一元配置ANOVAおよびBonferroni補正または複数の平行比較のための他の補正による統計分析を用いて、別個の条件とみなされる。 - 次の式を使用して、各遺伝子型/条件についてのグルーミングパーセンテージ差を計算する：[時間0における色素蓄積平均値 - 時間30 'における色素蓄積平均値] /時間0における色素蓄積平均値]×100。
- バープロットで各遺伝子型と状態のパーセンテージを表現し、遺伝子型と条件を比較する。
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Representative Results
グルーミングアッセイは、グルーミングの測定時間（30分）後にハエの体に残った色素の相対的残量に基づいて行動性能を評価するための定量的データをもたらす。スライドグルーミングチャンバー設計のサンプル画像およびアッセイの主要なステップが図1に示されています 。ハエは、色素の存在下でボルテックスすることにより、即時の散布からかなりの量の色素を凝集させる（ 図2d、2e ）。散布されたハエは、アッセイ後の色素蓄積の範囲を保持することができる（ 図2f、2g ）。したがって、EtOH中に色素蓄積を可溶化し、個々の試料の吸光度を測定することにより、再現可能で非常に定量的なグルーミング能力の評価が提供される。
後肢グルーミングの調節にDopRのこの研究では、（強いハイポモルフのグルーミングの性能を比較しました
違いを調べるには前腕部と後部部のグルーミングプログラムのトゥイーングルーミング能力を比較するために、グルーミング中に分離可能な身体部分に色素蓄積を直接評価しました（ 図4 ）。アッセイ後の個々のハエの頭部、羽、または「身体」（腹部/胸部/脚部）を解剖することによって、我々は遺伝子型間の差異および類似性を確実に定量することができた。 WT Vの頭部に有意差が認められなかったため、前肢グルーミングプログラムに差異がなかったという解釈を支持した。 DopR変異体。しかし、遺伝子型間の羽と体の両方の測定で有意差が認められた。ハエ全体ではなく、身体部分で一次アッセイを行うこの補足技術は、前肢と後肢のグルーミングプログラムを最初に区別する簡単な方法を可能にする。これらの結果は、前向きまたは後ろ向きの個々の成分の慎重な行動観察およびビデオ記録または追跡によってさらに拡張され、支持されたindlegのふるまい。 図2-4のすべての結果は、Genes、Brain、およびBehavior 15の許可を得て再現されます。
図1：ショウジョウバエのグルーミングアッセイワークフロー。この簡略化されたフローチャートは、グルーミングプロトコルの主要なステップを概説し、必要な材料と機器の一部を強調しています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：グルーミングベースの色素蓄積の定量。 （ a ）グルーミングチャンバー。個々のハエとブリリアントイエロー染料を個々のウェルに入れる（1フライ：1ウェル）。寸法補足データでの生産のための青写真。 （ b、d、f ）WT成体雄ショウジョウバエ（+ / +）。 （ c、e、g ） DopR f02676 / DopR f02676成体男性ショウジョウバエ。 （ b、c ）散布前に飛ぶ。 （ d、e ）グルーミング（時間：0分）の前に、ボルテックスチャンバーによる散布の直後に飛ぶ。 （ f、g ）グルーミング後の飛行時間（時間：30分）。スケールバー=400μm。 Genes、Brain、Behaviorの許可を得て転載15 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：ドパミンレセプター（ DopR / dDA1 / dumb ）は、グルーミング行動の調節に必要です。 （ a、c、e ）Groomin散布後0分または30分で野生型（青色）および突然変異型ハエ（赤/オレンジ）を測定した。各遺伝子型および状態についてSEMを測定する。 （ a、b ）n =遺伝子型および条件ごとに43個のハエ。 （ a ）WTおよびDopR f02676ハエは、両方とも、 DopR f02676 0 '= p値<0.0001）と比較して、グルーミング行動（+ / + 0' = p値<0.0001、 DopR f02676 30 'と比較して+/- 30' DopRハエは、WT動物と同様にグルーミングに失敗する（ DopR f02676 30 '+ + 30' = p値<0.001）。 0 'における各遺伝子型の急性散布は、同等のダストの蓄積をもたらす（ns =有意ではない）。 （ b、d、f ）グルーミング率の差は、各遺伝子型（色素蓄積量0 ' - 色素蓄積量30' /色素蓄積量0 '×100）で計算され、グルーミング挙動を比較する相対値を提供する。 （ c ） DopR attp / DopR
g4.jpg "/>
図4：ドーパミンレセプター機能は、後天性グルーミングを増強する。 （ a ）散布およびその後の解剖の30分後に測定したWT（青色）およびDopR f02676 / DopR f02676 （赤色）の個々の領域のグルーミング。ウィンググルーミングのp値= 0.0204。ボディのp値= 0.0302。すべての条件に対してn = 33〜35のハエ。各遺伝子型および状態についてSEMを測定する。一元配置ANOVAおよびボンフェロンニ補正による統計分析。 Genes、Brain、Behaviorの許可を得て転載15 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
補足図：NIH Image J Pixel Intensityソフトウェアを使用したグルーミング動作のビジュアル定量化のための代替法。 （ A ）wilの可視化解剖スコープの下でdtypeショウジョウバエ。楕円形は、ピクセル強度の解析領域として背側腹部を定義する。 （ B ）ウルトラグリーンV10蛍光塗料顔料による散布後の背面腹部の可視化。緑色蛍光の標準フィルターは青緑色の色素を捕捉します。 （ C ）UGV10色素でコーティングした後のWT動物（プリグルーミング）。 （ E ）UGV10色素でコーティングした後のWT動物（ポストグルーミング）。 （ D ）DopRf02676 UGV10色素でコーティングした後のホモ接合突然変異体（予備形成）。 （ F ）DopRf02676 UGV10色素でコーティングした後のホモ接合突然変異体（ポストグルーミング）。 （ G ）すべての条件のピクセル強度の定量化。各遺伝子型または条件についてn = 15個のハエが存在する。一元配置ANOVAおよびボンフェロンニ補正による統計分析。 ns =有意差なし。 ***はp <0.001を表す。 Plここをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。
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Discussion
グルーミングアッセイは比較的簡単ですが、以下の問題に特別な注意を払うように実験者に注意します。ハエと染料を導入した後、上板と下板のネジを締めることでしっかりとシールを維持することは、再現性のある結果には不可欠です。ブリリアントイエロー染料は非常に細かく、ゆるいジョイントはチャンバーの端から染料を失うことになります。個々のウェルの色素含有量の不規則性は、不均一な散布がグルーミングイベントの変動および偽陽性率を増加させるため、グルーミング定量化を容易に捨てることができる。さらに、実験者は、30分間のグルーミング期間中にグルーミングチャンバーを保持する環境を知っておくことをお勧めします。 ショウジョウバエ行動アッセイの一貫した性能を得るためには、温度、照明、時間、および湿度に対する環境の不変性が不可欠です。気を散らすことを最小限に抑えるために小さなインキュベーター内にグルーミングチャンバーを保持するさまざまなラボ環境が結果の最大限の再現性には理想的ですが、他の空間配置も成功する可能性があります。
色素蓄積測定に関しては、色素がラテックス手袋に対して透過性であることが観察されているので、ニトリル手袋はハンドリングおよび計量ダストにとって好ましい。衣類を汚しやすく、表面や装置を汚染する可能性があるため、実験室の表面に塵を広げないように注意してください。実験のために1つのエリアと1つのフライステーション/ CO 2パッドを分離することは、染料曝露を含むことが好ましい。実験者はUV透過性の96ウェルプレートを確実に使用することを奨励する。ブリリアントイエロー色素の397nm吸光度ピークはUVスペクトルに近く、標準96ウェルプレートは色素希釈の弱いまたは不正確な測定値を与えることがある。この染料はまた、EtOHの代替物として水に可溶性である。しかしながら、 ショウジョウバエは、有意なボルテックスおよび小さな気泡を伴わずに水中で容易に沈むことはない染色された動物の体は染料の一貫性と溶解性が低い。エタノールは、一貫して良好な結果を示し、直接比較ではより低い差異を示す。
私たちのアッセイは、補足的なテクニックや、フライドポストアッセイの解剖（ 図4 ）などのより洗練された研究のために簡単に変更することができます。そのようなサプリメントは、基本的な生物学的または神経的原因に直接的に対処することなく、色素の蓄積が行動のシフトを広く指しているだけなので、どのグルーミングステップが影響を受けるかを理解するために必要であり得る。相違点が確認されたら、ビデオ録画または直接観察法を使用した並行実験は、グルーミング効率の違いの行動根を理解する上で不可欠です。これは、NIH ImageJソフトウェアプログラムによるピクセル強度測定を使用して、特定の身体部分上の塵粒子の蓄積を視覚的に定量化することによって、さらに、前肢および後肢の直接的な追跡とともに調査することができるビデオ映像のスコアリングによる行動蛍光塵の視覚的定量化の代替方法に関して、研究室での初期の実験では、アルカリ希土類金属ケイ酸塩 - アルミン酸塩のユーロピウム由来の蛍光塗料を使用した。蛍光塗料色素でハエを撒き、グルーミング後に動物を麻酔または断頭した後、身体を記録し、解剖学的スコープ上のGFP用標準蛍光フィルター（ 補足データ ）を用いてデジタル顕微鏡で分析することができる。この方法はブリリアントイエロー色素を使用して観察された結果と並行するピクセル強度の正確な定量を可能にするが、この方法のスループットは比較的遅く、顔料粒子はサイズがわずかに異なり、ブリリアントイエロー染料。しかし、いくつかの実験的適用の場合、この代替方法は適切であり、利用可能なフルオショウジョウバエおよび非 ショウジョウバエの適用または別個の事象の定量化が必須である反復散布実験に有用でありうる色の濃い色である。塗料顔料自体は水溶性であるが、水中で急速に蛍光を失い、標準的な吸光度測定のためにこの顔料の有用性をひどく害することに注意すべきである。
表現型の正確な性質を理解するためには、特定の前肢または後肢のグルーミングイベントを対象とするこれらの種類の方法が不可欠であり、神経回路または運動プログラムの潜在的可能性をさらに詳しく調べることがあります。さらに、並行制御実験では、グルーミングが影響を受ける可能性のある非特異的な行動上の理由を排除することが不可欠です。動物が幅広い運動障害または異常を示す場合、グルーミング障害は広範な運動表現型の第2である可能性がある。 WT動物と突然変異体またはcirの簡単なビデオ追跡操作された条件は、グルーミングの欠損とは無関係に、速度の大きなシフトまたは移動した総距離を容易に区別することができる。
グルーミングアッセイは、この複雑な多段階歩行プログラムの小規模および大規模の両方の研究に適した多目的方法である。設計が容易チャンバ寸法又は数15を増加させるために修飾されます。この方法は、ハエの毛づくろい能力の比較評価に理想的な堅牢な定量データをもたらす。チャンバーの生産はコスト効率がよく、利用可能なリソースに応じて多くの異なるマシン（3Dプリンター、レーザーカッター、CNCミル）を使用して作成することができます。この技術は、遺伝子スクリーニングおよび機能的回路マッピング研究のために容易に拡大することができる個々のサンプルの中間処理能力を可能にする。
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Disclosures
著者らは、利害の対立を宣言していない。
Acknowledgments
この方法論とチャンバデザインのテストと確立の初期の仕事については、Brian Shepherd、Tat Udomritthiruj、Aaron Willey、Ruby Froom、Elise Pitmon、Rose Hedreenに感謝します。私たちはKelly TellezとGraham Buchanに原稿の読み書きについて感謝します。 Brilliant Yellow Dye（Sigma）の使用を提案する上での先駆的な仕事と助言と支援についてAndrew SeedsとJulie Simpsonに感謝します。この仕事は、Mary E. Groff外科医学研究および教育慈善団体、ブロンフマン科学センター、ヘルマンフェロープログラムによって一部サポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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