Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية التحجيم الفردي الاستجالة قابلة للتحلل في ذبابة الفاكهة التي تعطي بيانات قوية، كمية لقياس السلوك الاستمالة. ويستند هذا الأسلوب على مقارنة الفرق في تراكم الصبغة على جثث الحيوانات غير مستعد مقابل الحيوانات على مدى فترة محددة من الزمن.
Abstract
سلوك الاستمالة ذبابة الفاكهة هو برنامج حركي متعدد الخطوات المعقدة التي تتطلب حركة منسقة من كل من الأفرع و هيندليغس. هنا نقدم بروتوكول الفحص الاستمالة وتصميم غرفة الرواية التي هي فعالة من حيث التكلفة وقابلة للدراسات الصغيرة أو الكبيرة على نطاق واسع من الاستمالة ذبابة الفاكهة . يتم غبار الذباب في جميع أنحاء الجسم مع صبغ أصفر باهر وإعطاء الوقت لإزالة الصبغة من أجسادهم داخل الغرفة. ثم تودع الذباب في حجم مجموعة من الإيثانول لذوبان الصبغة. يتم قياس وتسجيل الامتصاصية الطيفية النسبية لعينات الصبغة الإيثانول للحيوانات المستعد مقابل الحيوانات غير المستغلة. بروتوكول ينتج بيانات كمية من تراكم الصبغة للذباب الفردية، والتي يمكن بسهولة متوسط ومقارنة عبر العينات. وهذا يسمح التصاميم التجريبية لتقييم بسهولة القدرة الاستمالة للدراسات الحيوانية متحولة أو التلاعب الدائرة. هذا الإجراء الفعال على حد سواء تنوعا وقابلة للتطوير. نظهر wأورك تدفق البروتوكول والبيانات المقارنة بين الحيوانات وت الحيوانات المتحولة لنوع ذبابة الفاكهة I مستقبلات الدوبامين ( دوبر ).
Introduction
الاستمالة في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ( D. ميلانوغاستر ) هو السلوك الفطري قوية التي تنطوي على تنسيق برامج المحركات المستقلة متعددة 1 . الفاكهة الذباب تنظيف أجسادهم من الغبار والميكروبات، ومسببات الأمراض الأخرى التي يمكن أن تمنع وظيفة فسيولوجية طبيعية مثل الرؤية والطيران، أو تؤدي إلى تحديات مناعية كبيرة. في الاستشعار والاستجابة لكل من الميكانيكية 2 والتنشيط المناعي 3 ، الذباب تتكاثر ساقيه بشكل متكرر أو على منطقة الجسم المستهدف حتى أنها نظيفة بما فيه الكفاية والاستمالة تقدم إلى جزء آخر من الجسم. الذباب أداء الحركات الاستمالة في نوبات متميزة التي تحدث إلى حد كبير في أنماط نمطية 1 ، 4 . ويظهر التسلسل الهرمي السلوكي كما يتم إعطاء الأولوية لإشارات التهيأ. وقد تم تحديد الدوائر وأنماط النشاط في دعم oفا نموذج أن برامج الاستمالة في الجزء العلوي من التسلسل الهرمي تحدث أولا وقمع إشارات موازية من مناطق الجسم التي يتم إعدادها في وقت لاحق 5 . وتعطى أولوية قصوى للرأس، ثم البطن، والأجنحة، وأخيرا الصدر 5 .
برنامج الاستمالة في D. ميلانوغاستر هو نظام مثالي لدراسة الدوائر العصبية، والإشارات الجزيئية مودولاتوري، والناقلات العصبية. على سبيل المثال، حل وسط من وظيفة النيوروفيبرومين 6 ، وفقدان ذبابة الفاكهة هشة X التخلف العقلي البروتين ( dfmr1 ) 7 ، والتعرض لالبسفينول A (ببا) 8 كل سبب الاستمالة المفرطة والسلوكيات الأخرى التي هي مماثلة لأعراض بشرية منفصلة من الورم العصبي الليفي، والمتلازمة، وجوانب اضطرابات طيف التوحد واضطراب فرط الحركة ونقص الانتباه (أدهد)، على التوالي. السلوك الاستمالة يمكن أيضا أن يكون هابيتواتيد تفاضليا عبر سلالات متحولة 2 ، والإقراض هذا البرنامج الحركي لدراسات اللدونة السلوكية. اتساع الظواهر العصبية التي يمكن أن تكون نموذجا من قبل ذبابة الفاكهة يتطلب نهجا مقارنة جديدة لقياس قدرة الذباب على العريس أنفسهم.
وقد تبين العمل المشترك من الناقلين أحادي الأمين الحويصلة وفرة النسبية من الدوبامين والأمينات الحيوية الأخرى في الجسم للتوسط ذبابة الفاكهة السلوك الاستمالة 9 ، 10 . أوكتوبامين والدوبامين تحفز نشاط الاستمالة هيندليغ مماثلة في الذباب ديكابيتاتد، في حين أن تيرامين، السلائف من أوكتوبامين، يؤدي أيضا الاستمالة إلى حد أقل 7 . تم التعرف على أربعة مستقبلات الدوبامين في D. ميلانوغاستر 11 ، 12 ، 13 ، 14 دوبر، DDA1، البكم ) في السلوك الاستمالة هيندليغ 15 .
الاستمالة يمكن أن يكون كميا بشكل غير مباشر من خلال النظر في مدى النظافة التي الحيوان يمكن أن العريس تماما بعد غبار الجسم كله مع صبغ علامة أو غبار الفلورسنت 5 ، 16 . ما تبقى من الغبار اليسار على الجسم يمكن أن تستخدم علامة النسبية للسلوك العام. الذباب الغبار بعد إعطاء الوقت الكافي للعريس قد يظهر عجزا محددا في سلوك الاستمالة. كما أصبحت الاستمالة التحقيقات أكثر اتساعا، وأدرجت بروتوكولات مثل ممارسات قطع الرأس لإضافة العلاجات الدوائية على الرقبة الأعصاب الضامة 10 ، التحفيز عن طريق اللمس من شعيرات لانتزاع استجابة الاستمالة 2 ،وتسجيل الفيديو من السلوك 15 . الملاحظة المباشرة من الاستمالة يمكن دراستها بسهولة باستخدام المراقبة البصرية وتسجيل يدويا وتيرة ومدة الأحداث الاستمالة محددة 4 .
قمنا بتصميم غرفة الاستمالة خمسة عشر جيدا التي يمكن بناؤها مع طابعة 3D أو الليزر القاطع، وتصاميم المخطط متوفرة للاستنساخ 15 . تصميم يستخدم اثنين من لوحات الوسطى انضم مع فتحات المتطابقة وفصلها عن طريق شبكة واثنين من انزلاق لوحات أعلى وأسفل إضافية، والتي يتم تحميل الذباب و / أو الصبغة، على التوالي. بعد السماح للذباب الذباب الوقت العريس، ونحن إيداعها في الإيثانول لذوبان الصبغة وقياس امتصاص هذا الحل في الطول الموجي للصبغة. قارئ لوحة يمكن استخدامها لعينات موازية متعددة أو مقياس واحد قراءة يمكن استخدامها لعينات الفردية. هذا الأسلوب يقلل من الخطأ الناجم عن المناولة و آلانخفاض مستويات المقايسات التي يتم تشغيلها على نطاق أصغر، وكفاءة من حيث التكلفة. يتم اشتقاق هذه الطريقة وتعديلها من أساليب رائدة من قبل جولي سيمبسون وأندرو البذور، الذين يستخدمون غرف الاستمالة أكبر مع عناصر التدفئة لدرجات الحرارة الحساسة التلاعب 5 . بروتوكول التالية يعرض الكمي من الاستمالة من الجسم كله، فضلا عن عرض أساليب بديلة لكميات تراكم الصبغة على أجزاء الجسم الفردية. كما نقدم عينة من بيانات المقارنة بين المسوخ وت ودوبر ، وكذلك طرق لحساب مؤشر أداء بسيط لسلوك الاستمالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد
- إعداد الشافطة لتحريك ذبابة الفاكهة الحية من قارورة ثقافة إلى غرفة الاستمالة. تسمح الشافطات بنقل الحيوانات الواعية إلى الغرف السلوكية للتأكد من أن التخدير لا يؤثر على الملاحظة السلوكية اللاحقة.
- باستخدام مقص قطع 1.5 قدم من تيغون معرف الأنابيب ⅛ "، أود ¼". خفض 1 بوصة على الأقل قبالة غيض من 1 مل طرف المتاح ميكروبيبيت. عقد قطعة 1 سم مربع من شبكة (افتتاح 0.196 بوصة) على طرف قطع.
ملاحظة: معظم النصائح 1mL لديها خط تدرج حيث يجلس طرف في مربع حزمة، عادة قطع إلى هذا الخط. - وضع مكان الطازجة 1 مل طرف ميكروبيبيت على شبكة / قطع طرف. مراقبة شبكة شكل حاجز ضيق بين النصائح اثنين. داخل الطرف الجديد يخلق غرفة القابضة للذباب.
- قطع طرف المدقع من طرف ميكروبيبيت جديدة لتوسيع افتتاح ما يكفي للسماح مرور ذبابة واحدة. هولe سوف تتطابق تقريبا مع افتتاح غرفة الاستمالة (حوالي 1.5-2 ملم في القطر).
- تناسب بسهولة نصائح متداخلة على نهاية أنابيب تيغون. دفع النصائح في أنبوب لضمان تناسب ضيق للسماح للضغط فراغ.
- على الطرف الآخر من الأنابيب، وقطع غيض من طرف ميكروبيبيت 200 ميكرولتر وتناسب نهاية قطع ضيق في الأنابيب. هذا هو الجانب "الفم" من الشافطة.
- باستخدام مقص قطع 1.5 قدم من تيغون معرف الأنابيب ⅛ "، أود ¼". خفض 1 بوصة على الأقل قبالة غيض من 1 مل طرف المتاح ميكروبيبيت. عقد قطعة 1 سم مربع من شبكة (افتتاح 0.196 بوصة) على طرف قطع.
- إعداد أنابيب قسامة الغبار. تزن حوالي 5 ملغ من الصبغة الصفراء الرائعة على ورقة وزنها تاريد. صب الغبار في أنبوب ميكروسنتريفوج 0.6 مل وإغلاق بإحكام الغطاء.
ملاحظة: ننصح باستخدام قفازات النتريل خلال إعداد قسامة، وبعض قفازات اللاتكس نفاذية للصبغة. - كرر الخطوة 1.2) لجميع العينات في التجربة (واحد لكل ذبابة في كل غرفة).
- إعداد الإيثانول (إتوه) أنابيب: الماصة 1 مل من إتوه 100٪ إلى 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. أنابيب التسمية للأنماط الجينية أو الشروط. </ لى>
- كرر الخطوة 1.4) لجميع العينات في التجربة (واحد لكل ذبابة في كل غرفة). كاب وحفظ أنابيب إتوه لاستكمال الفحص الاستمالة. وتشمل أيضا على الأقل واحد "فارغ" العينة التي ستكون فقط 1 مل إتوه دون ذبابة للضوابط السلبية.
- تجميع كل غرفة الاستمالة عن طريق ثقب لوحة أعلى انزلاق (مع الثقوب الصغيرة) ولكن ترك لوحة أسفل (مع الثقوب الكبيرة) إزالتها لإضافة الغبار.
- وضع كل غرفة الاستمالة اللازمة شقة على طاولة مع الوجه العلوي إلى أسفل. الجانب دخول يطير هو الوجه لأسفل.
- تحميل 5 ملغ الرائعة أصفر قسامة صبغ في كل غرفة من خلال الاستفادة من أنبوب ضد سطح الغرفة فوق المطلوب بشكل جيد. اضغط على غرفة ضد الطاولة للتأكد من أن كل من الغبار يقع من خلال شبكة إلى لوحة أعلى.
- برغي لوحة أسفل على كل غرفة بحيث أن نهايات أوسع من فتحات المخروطية تواجه الخارج والثقوب لا تبقي على الآبار. تأمين بوتلوحة توم بإحكام بحيث لا تنزلق والافراج عن صبغ.
- الوجه الغرفة على وضربها مسطحة ضد طاولة عدة مرات بحيث الغبار يسقط من خلال شبكة للراحة على لوحة أسفل.
- حرك لوحة أعلى من الغرفة في "موقف فتح" بحيث الثقوب الصغيرة محاذاة مع خمسة عشر بئرا، والسماح لإدخال الذباب في الآبار الفردية.
2. يطير والغبار والاستمالة
- تحميل واحد يطير في الشافطة الفم عن طريق امتصاص بلطف من خلال نهاية واحدة من الشافطة كما لو كان استخدام القش. إيداع الذباب عن طريق تهب طفيفة وتوجيه الانفتاح نحو الهدف.
- نضح ذبابة واحدة في كل بئر تستخدم لهذه التجربة. بعد تحميل بئر، الشريحة أعلى لوحة بحيث يتم المحاصرين في الطاير ووضع شريط على افتتاح ذلك جيدا أثناء تحميل الغرفة بأكملها لمنع الهروب يطير أثناء تحميل الآبار الأخرى. إذا يتم استنشاق الذباب متعددة إلى سينغلحسنا، اترك هذا الافتتاح مكشوفا حتى لا يبقى سوى ذبابة واحدة.
- بعد كل الآبار اللازمة مليئة الذباب، الوجه الغرفة بحيث لوحة أسفل هو أعلى بحيث الغبار لديه القدرة على معطف الذباب عن طريق السقوط من خلال شبكة.
- تأمين بإحكام لوحات أعلى وأسفل عن طريق تشديد مسامير، ودوامة الغرفة لغبار الذباب لمدة 4 ثوان.
- ضرب الغرفة (أعلى لوحة واجهت) ضد طاولة مرتين بحيث الصبغة تقع من خلال إلى الجانب الآخر. ثم، الوجه الغرفة على (أعلى لوحة الوجه متابعة) وتدق الغرفة مرتين لضمان صبغ يستقر على الأرض من الغرفة السفلى بعيدا عن الطاير الذي عقد في الغرفة العليا.
- لذباب السيطرة التي لا يسمح للعريس، انتقل فورا إلى الخطوة 3 من البروتوكول. بالنسبة للذباب التي ستكمل الفحص، انتقل إلى الخطوة 2.7.
- بقية غرفة شقة على طاولة أو كونترتوب مع لوحة أعلى التصاعدي لمدة ثلاثين دقيقة للسماح للذباب العريس. وضع تشامبإيه في مساحة خالية من الضوضاء والاهتزاز للحفاظ على البيئة الخاصة بك ثابتة لجميع التجارب الاستمالة (مستويات الإضاءة والرطوبة ودرجة الحرارة). حاضنة الطاولة في رت أو 25 درجة مئوية مع ضوابط الرطوبة مثالية.
3. إعداد العينات وتحليل الامتصاص
- الحفاظ على مستوى الغرفة مع أعلى لوحة صعودا، وفك بلطف أسفل لوحة وإزالته من الغرفة، مع الحرص على عدم فقدان صبغ.
- وضع الغرفة على لوحة ذبابة كو 2 مع تدفق الهواء المنخفض حتى يتم تخدير الذباب.
- فك اللوحة العلوية من الغرفة. استخدام ملقط بعناية لانتزاع الساق ونقل ذبابة غبار واحد من كل غرفة وإيداعه في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل تحتوي على إتوه. الوقت نقل لمدة 15 غرفة كل تحتوي على ذبابة واحدة حوالي 3-5 دقيقة. يجب أن يجرب المجارب في أوقات النقل إذا / عندما تجارب مذهلة مع غرف متعددة لضمان كفاءة انطلاق التجارب. مرة واحدة كل أنبوب ميكروسنتريفوج يحتوي على 1 يطير، أغلق الغطاء وعكس الأنبوب ثلاث مرات لتحريض وتخلط الحل من الصبغة والإيثانول.
- احتضان أنابيب تحتوي على الإيثانول والذباب لمدة 5 ساعات في رت لضمان الإزالة الكاملة للصبغة من الطاير إلى حل. بعد 5 ساعة، ودوامة لفترة وجيزة كل أنبوب (2 ق) لضمان إزالة الصبغة من الذباب.
- قسامة 50 ميكرولتر من أنبوب 1.5 مل التجريبية في بئر من لوحة 96 جيدا إذا كانت متوفرة، مع الأخذ في الحسبان من موقع كل عينة على لوحة. إضافة 200 ميكرولتر من إتوه لتمييع العينة 5X. التخفيف يخفف آثار السقف من الذباب غبار بشدة أو عيوب الاستمالة الكبيرة.
- استخدام قارئ لوحة لتحليل كل عينة في 397 نانومتر. بدلا من ذلك، قياس الامتصاصية للعينات الفردية والفراغات على مقياس الطيف القياسية في الطيف المرئي إذا كان قارئ لوحة غير متوفر.
- قراءة وتسجيل العينة من خلال القارئ لوحة وحفظ جدول البيانات مع السجلd عينات على لوحة.
4 - التحديد الكمي للنتائج
- تجميع النتائج لجميع العينات وقياس التباين لكل النمط الوراثي أو الشرط.
ملاحظة: تراكم صبغ في الوقت 0 دقيقة وفي الوقت المحدد 30 دقيقة تعتبر شروط منفصلة باستخدام التحليل الإحصائي عن طريق اتجاه واحد أنوفا وتصحيح بونفيروني أو تصحيحات أخرى لمقارنات متوازية متعددة. - حساب الفرق نسبة الاستمالة لكل النمط الوراثي / حالة باستخدام المعادلة التالية: [(الصبغة تراكم متوسط القيمة في الوقت 0 '- تراكم الصبغة يعني القيمة في الوقت 30') / تراكم الصبغة يعني القيمة في الوقت 0] × 100.
- التعبير عن النسبة المئوية لكل النمط الجيني والحالة في مؤامرات شريط ومقارنة عبر الأنماط الجينية والظروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اختبار الاستمالة ينتج بيانات كمية لتقييم الأداء السلوكي على أساس المتبقية النسبية من الصبغة المتراكمة المتبقية على أجسام الذباب بعد وقت محدد من القياس للاستمالة (30 دقيقة). يتم تسليط الضوء على الصور عينة من انزلاق تصميم غرفة الاستمالة والخطوات الرئيسية للفحص في الشكل 1 . الذباب تجميع كمية كبيرة من الصبغة من الغبار فوري فورتيكسينغ في وجود صبغ ( الشكل 2D، 2E ). الذباب غبار يمكن أن تحتفظ مجموعة من تراكم الصبغة بعد الفحص ( الشكل 2F، 2G ). ولذلك، سولوبيليزينغ تراكم الصبغة في إتوه وقياس الامتصاصية من العينات الفردية يوفر استنساخ وتقييم كمي للغاية من القدرة الاستمالة.
في هذه الدراسة من دوبر في تنظيم الاستمالة هيندليغ، قارنا أداء الاستمالة من هيبومورف قوية (
للتحقيق في الاختلافات يكونتوين الاستمالة قدرات أليغل مقابل هيندليغ الاستمالة البرامج، قمنا بتقييم مباشرة تراكم الصبغة على أجزاء الجسم فصل خلال الاستمالة ( الشكل 4 ). من خلال تشريح رؤساء، أجنحة، أو "الجسم" (البطن / الصدر / الساقين) من الذباب الفردية بعد الفحص، كنا قادرين على كوانتيتات موثوق الاختلافات والتشابه بين الأنماط الجينية. وأيدت النتائج تفسير أنه لا توجد فروق للبرامج الاستمالة فورليغ، كما لم تلاحظ اختلافات كبيرة لرؤساء وت فس . دوبر المسوخ. ومع ذلك، لوحظت اختلافات كبيرة في كل من قياسات الجناح والجسم بين الأنماط الجينية. هذه التقنية التكميلية لإجراء الفحص الأولي على أجزاء الجسم بدلا من الذباب كله يسمح طريقة بسيطة لتمييز في البداية بينيليغ مقابل هيندليغ الاستمالة البرامج. وتم توسيع نطاق هذه النتائج ودعمها بمالحظات سلوكية دقيقة وتسجيل فيديو أو تعقب للمكونات الفردية للوحدة أو hسلوكيات إندليغ. يتم استنساخ جميع النتائج من أرقام 2-4 بإذن من الجينات والدماغ والسلوك 15 .
الشكل 1: ذبابة الفاكهة الاستمالة فحص سير العمل. هذا المخطط المبسط يحدد الخطوات الرئيسية في بروتوكول الاستمالة، وتسليط الضوء على بعض المواد والمعدات اللازمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكمي من الاستمالة على أساس تراكم الصبغة. ( أ ) غرفة الاستمالة. يتم وضع الذباب الفردية والصبغة الصفراء الرائعة في الآبار الفردية (1 ذبابة: 1 بئر). الأبعادومخططات الإنتاج في البيانات التكميلية. ( b، d، f ) وت ذكور ذبابة الفاكهة ذكور (+ / +). ( ج، ه، ز ) دوبر f02676 / دوبر f02676 ذكور ذبابة الفاكهة الذكور. ( ب، ج ) الذباب قبل الغبار. ( د، ه ) الذباب مباشرة بعد الغبار بواسطة غرفة فورتيكسينغ، قبل الاستمالة (الوقت: 0 دقيقة). ( f، g ) الذباب بعد الاستمالة (الوقت: 30 دقيقة). شريط مقياس = 400 ميكرون. أعيد طبعها بإذن من الجينات والدماغ والسلوك 15 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الدوبامين مستقبلات ( دوبر / dDA1 / البكم ) مطلوب لتحوير السلوك الاستمالة. ( a، c، e ) غرومينز من ويلديب (الأزرق) والذباب متحولة (أحمر / برتقالي) تقاس في 0 دقيقة أو 30 دقيقة بعد الغبار. يتم قياس سيم لكل النمط الوراثي والشرط. ( أ، ب ) ن = 43 الذباب في النمط الجيني والحالة. ( أ ) ويطير كل من وت و دوبر f02676 كلا من سلوك الاستمالة المعروض (+ / + 30 'مقارنة ب + / + 0' = p <0.0001، دوبر f02676 30 'مقارنة ب دوبر f02676 0' = p p <0.0001). تفشل الذباب دوبر في العريس وكذلك الحيوانات وت ( دوبر f02676 30 'مقارنة + + + 30' = قيمة p <0.001). الغبار الحادة من كل النمط الجيني في 0 'النتائج في تراكم ما يعادلها من الغبار (نس = ليست كبيرة). ( b، d، f ) يتم حساب الفرق في نسبة الاستمالة لكل نمط وراثي (تراكم الصبغة عند 0 '- تراكم الصبغة عند 30' / صبغ تراكم 0 × 100) مما يوفر قيمة نسبية لمقارنة سلوكيات الاستمالة. ( ج ) دوبر أتب / دوبر
g4.jpg "/>
الشكل 4: الدوبامين مستقبلات وظيفة الجهد هيندليغ الاستمالة. ( أ ) الاستمالة من المناطق الفردية من وت (الأزرق) و دوبر f02676 / دوبر f02676 (الأحمر) يقاس في 30 دقيقة بعد الغبار والتشريح اللاحقة. p قيمة الجناح الاستمالة = 0.0204. قيمة p للجسم = 0.0302. ن = 33-35 الذباب لجميع الظروف. يتم قياس سيم لكل النمط الوراثي والشرط. التحليل الإحصائي بواسطة طريقة واحدة أنوفا و بونفيروني تصحيح. أعيد طبعها بإذن من الجينات والدماغ والسلوك 15 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي: طريقة بديلة للكمي البصري للسلوك الاستمالة باستخدام المعاهد الوطنية للصحة إيماج J بيكسيل إنتنسيتي سوفتوار. ( A ) التصور من فيلدتيب ذبابة الفاكهة تحت نطاق تشريح. البيضاوي يعرف البطن الظهري كما منطقة التحليل لشدة بكسل. ( B ) التصور من البطن الظهرية بعد الغبار مع الترا الأخضر V10 الفلورسنت الطلاء الصباغ. مرشح قياسي للمضان الأخضر يلتقط الصباغ الأزرق والأخضر. ( C ) وت الحيوان بعد طلاء مع UGV10 الصباغ (بريغرومينغ). ( E ) وت الحيوان بعد طلاء مع UGV10 الصباغ (بوستغرومينغ). ( D ) DopRf02676 متحولة متماثل بعد طلاء مع UGV10 الصباغ (بريغرومينغ). ( F ) DopRf02676 متماثل متماثل بعد طلاء مع UGV10 الصباغ (بعد الاستمالة). ( G ) الكمي من كثافة بكسل لجميع الظروف. ن = 15 الذباب لكل النمط الجيني أو الشرط. تحليلات إحصائية بواسطة طريقة واحدة أنوفا وتصحيح بونفيروني. نس = فارق غير هام. *** يمثل أب <0.001. ررسهولة انقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المقايسة هي واضحة نسبيا، ولكننا نحرص المجربين على إيلاء اهتمام خاص إلى القضايا التالية. الحفاظ على ختم ضيق عن طريق تشديد مسامير على أعلى وأسفل لوحات بعد إدخال الذباب وصبغ ضروري للنتائج استنساخه. الصبغة الصفراء الرائعة هي غرامة جدا والمفاصل فضفاضة تسمح خسائر الصبغة من حواف الغرفة. عدم انتظام في محتوى الصبغة لكل بئر يمكن بسهولة التخلص من الاستمالة الكمي والغبار غير موحدة وزيادة التباين ومعدلات إيجابية كاذبة للاستمالة الأحداث. بالإضافة إلى ذلك نحن نشجع المجربين أن يكون على بينة من البيئة التي يختارون لعقد غرفة الاستمالة خلال فترة الاستمالة 30 دقيقة. الثبات البيئي لدرجة الحرارة، والإضاءة، والوقت من اليوم، والرطوبة ضرورية لأداء ثابت للفحوصات السلوك ذبابة الفاكهة . عقد غرف الاستمالة داخل حاضنة صغيرة للحد من تشتيت سr بيئات المختبر المتغير مثالية لاستنساخ القصوى من النتائج، ولكن الترتيبات المكانية الأخرى يمكن أيضا أن تكون ناجحة.
وفيما يتعلق بقياسات تراكم الصبغة، لاحظنا أن الصبغة قابلة للنفاذ إلى قفازات اللاتكس، لذلك فإن قفازات النتريل مفضلة للمناولة وتزن الغبار. احرص على عدم انتشار الغبار على نطاق واسع عبر أسطح المختبر، حيث أنها ستلطخ بسهولة الملابس وربما تلوث الأسطح أو المعدات. عزل منطقة واحدة ومحطة ذبابة واحدة / كو 2 لوحة للتجارب هو الأفضل لاحتواء التعرض صبغ. كما نشجع المجربين على التأكد من استخدام الأشعة فوق البنفسجية شفافة 96 لوحات جيدا. ذروة الامتصاص 397nm للصبغة الصفراء الرائعة بالقرب من طيف الأشعة فوق البنفسجية، ومعيار 96 لوحات جيدا قد تعطي تدابير ضعيفة أو غير دقيقة لتخفيف الصبغات. الصبغة هي أيضا قابلة للذوبان في الماء كبديل ل إتوه. ومع ذلك، ذبابة الفاكهة لا تغرق بسهولة في الماء دون فورتيكسينغ كبيرة وصغيرة فقاعات الهواء ألونانوغرام الجسم من الحيوانات مصبوغ تظهر أقل الاتساق وذوبان الصبغة. الإيثانول يظهر نتائج أفضل باستمرار وانخفاض التباين في المقارنات المباشرة.
لدينا مقايسة يمكن تعديلها بسهولة للتقنيات التكميلية والدراسات أكثر دقة، مثل تشريح الجسم بعد الطاير مقايسة ( الشكل 4 ). قد تكون هذه المكملات ضرورية لفهم أي خطوات الاستمالة تتأثر، حيث أن تراكم الصبغة يشير فقط إلى التحولات السلوكية دون معالجة مباشرة للقضية البيولوجية أو العصبية الأساسية. وبمجرد ملاحظة الاختلافات، والتجارب الموازية باستخدام تسجيل الفيديو أو أساليب المراقبة المباشرة ضرورية لفهم الجذر السلوكي لأي اختلافات في كفاءة الاستمالة. وهذا يمكن التحقيق أكثر من ذلك عن طريق القياس البصري لتراكم الجسيمات الغبار على أجزاء الجسم محددة باستخدام تدابير كثافة بكسل من خلال برنامج نيه إيماجيج البرنامج، جنبا إلى جنب مع تتبع مباشر من أليغل و هيندليغالسلوكيات من خلال تسجيل لقطات الفيديو. وفيما يتعلق بالطرق البديلة للكمية البصرية من الغبار الفلورسنت، استخدمت التجارب المبكرة في المختبر صبغة الفلورسنت الطلاء المستمدة من القلوية النادرة معدن سيليكات-ألومينات أكسيد اليوروبيوم. بعد الغبار مع الذباب مع الفلورسنت الطلاء الصباغ والتخدير أو قطع رأس الحيوانات بعد الاستمالة، يمكن تسجيل الأجسام وتحليلها بواسطة المجهري الرقمي باستخدام فلتر الفلورسنت القياسية ل غفب على نطاق تشريح ( البيانات التكميلية ). في حين أن هذا الأسلوب لا يسمح لكمية دقيقة من كثافة بكسل أن يوازي النتائج التي لوحظت باستخدام صبغ الأصفر الرائعة، وجدنا أن الإنتاجية من هذه الطريقة بطيئة نسبيا، والجسيمات الصباغ تختلف قليلا في الحجم وأقل اتساقا من الطلاء لوحظ ل بريليانت الأصفر، دي. ولكن بالنسبة لبعض التطبيقات التجريبية هذه الطريقة البديلة مناسبة، وهناك تنوع كبير في فلو المتاحةوالألوان ريسنت التي يمكن أن تكون مفيدة لتطبيقات ذبابة الفاكهة وتطبيقات نوندروسوفيلا أو تجارب تكرارية الغبار حيث الكمي من أحداث منفصلة ضرورية. وتجدر الإشارة إلى أن الطلاء الصباغ نفسه هو للذوبان في الماء ولكن يفقد بسرعة مضانها في الماء، وتعطيل بشدة فائدة هذا الصباغ لتدابير الامتصاص القياسية.
هذه الأنواع من الأساليب التي تستهدف أحداث الاستمالة الفردية أو هيندليغ محددة ضرورية لفهم الطبيعة الدقيقة للنمط الظاهري ويمكن تسليط الضوء على الدوائر العصبية المحتملة أو البرامج الحركية لمزيد من التحقيق. بالإضافة إلى ذلك، لتجارب التحكم الموازية، من الضروري استبعاد الأسباب السلوكية غير المحددة المحتملة التي يمكن أن تتأثر الاستمالة. إذا عرضت الحيوانات عجزا كبيرا في المحرك أو تشوهات، فمن الممكن أن العجز الاستمالة هي ثانوية إلى المظاهر الحركية واسعة. بسيطة تتبع الفيديو من الحيوانات وت مقابل متحولة أو الدوائركويت الظروف التلاعب يمكن بسهولة التمييز بين التحولات الكبيرة في السرعة أو المسافة الإجمالية المقطوعة، مستقلة عن العجز الاستمالة.
الاستمالة مقايسة هي طريقة تنوعا مناسبة للدراسات الصغيرة والكبيرة على حد سواء من هذا البرنامج الحركي متعددة المراحل المعقدة. يتم تعديل التصاميم بسهولة لزيادة أبعاد الغرفة أو رقم 15 . طريقة ينتج بيانات كمية قوية التي هي مثالية للتقييم المقارن للذباب الاستمالة القدرة. إنتاج الغرف هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن يتم باستخدام العديد من الآلات المختلفة (طابعات 3D، تقطيع الليزر، مصانع نك) اعتمادا على الموارد المتاحة. وتسمح هذه التقنية بالإنتاجية المتوسطة للعينات الفردية التي يمكن توسيعها بسهولة للشاشات الجينية والدراسات الوظيفية لرسم خرائط الدوائر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أعلن المؤلفون أنه لا يوجد اختلاف في الاهتمامات.
Acknowledgments
نود أن نشكر براين شيبيرد، تات أودومريتثيروج، آرون ويلي، روبي فروم، إليز بيتمون، وروز هدرين للعمل المبكر في اختبار ووضع هذه المنهجية وتصاميم الغرفة. نشكر كيلي تليز وجراهام بوكان لقراءة وتحرير المخطوطة. نشكر أندرو البذور وجولي سيمبسون لعملهم الرائد والمشورة والدعم في اقتراح استخدام الصبغة الصفراء الرائعة (سيغما). ويدعم هذا العمل جزئيا من قبل ماري E. غروف الجراحية والبحوث الطبية والتعليم الخيرية الثقة، ومركز العلوم برونفمان، وبرنامج الزملاء هلمان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
