Summary
Denne protokol beskriver en skalerbar individuel grooming assay teknik i Drosophila, der giver robuste, kvantitative data til måling af grooming opførsel. Metoden er baseret på at sammenligne forskellen i akkumulering af farvestoffer på kroppen af ikke-preparerede versus dyrede dyr over en bestemt periode.
Abstract
Drosophila grooming adfærd er et komplekst multi-trins lokomotorisk program, der kræver koordineret bevægelse af både forben og bagben. Her præsenterer vi en grooming assay protokol og nyt kammer design, der er omkostningseffektivt og skalerbar til enten små eller store undersøgelser af Drosophila grooming. Fluer er støvet over deres krop med Brilliant Yellow farve og givet tid til at fjerne farvestoffet fra deres kroppe i kammeret. Fluer deponeres derefter i et sæt volumen ethanol for at opløse farvestoffet. Den relative spektralabsorbans af farvestof-ethanolprøver til forplejede versus ungrumsdyr måles og registreres. Protokollen giver kvantitative data om farvestofakkumulering for individuelle fluer, som let kan gennemsnitligt sammenlignes over prøver. Dette gør det muligt for eksperimentelle designs at let vurdere grooming evne til mutant dyreforsøg eller kredsløb manipulationer. Denne effektive procedure er både alsidig og skalerbar. Vi viser wOrk-flow af protokollen og sammenlignende data mellem WT dyr og mutante dyr til Drosophila type I Dopamin Receptor ( DopR ).
Introduction
Grooming i Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) er en robust medfødt adfærd, der involverer koordinering af flere uafhængige motorprogrammer 1 . Frugtflugter renser deres stof af støv, mikrober og andre patogener, som kunne hæmme normal fysiologisk funktion som syn og fly eller føre til betydelige immunforsvar. Ved at føle og reagere på både mekanisk 2 og immunaktivering 3 , flyver fluer gentagne gange deres ben sammen eller på en målrettet kropsregion, indtil den er tilstrækkelig ren, og grooming skrider frem til en anden del af kroppen. Fluer udfører grooming bevægelser i forskellige begivenheder, der stort set forekommer i stereotype mønstre 1 , 4 . Et adfærdsmæssigt hierarki bliver tydeligt, da groomsignaler prioriteres. Kredsløb og aktivitetsmønstre er blevet identificeret i support oFa model, at plejeprogrammer øverst i hierarkiet forekommer først og undertrykker parallelle signaler fra områder af kroppen, der forberedes efterfølgende 5 . Højeste prioritet gives til hovedet, derefter maven, vingerne og til sidst thoraxen 5 .
Plejeprogrammet i D. melanogaster er et ideelt system til undersøgelse af neurale kredsløb, modulerende molekylære signaler og neurotransmittere. For eksempel kompromittering af neurofibrominfunktion 6 , tab af Drosophila fragile X mentalt retardationsprotein ( dfmr1 ) 7 og eksponering for bisfenol A (BPA) 8 forårsager alt for groom pleje og anden adfærd, der er analog med diskrete humane symptomer på neurofibromatose, skrøbelig X Syndrom og aspekter af autismespektrumforstyrrelser og henholdsvis ADHD (Attention-Deficit Hyperactivity Disorder). Grooming opførsel kan også være habituaTed differentielt på tværs af mutante stammer 2 , udlån denne motor program til undersøgelser af adfærdsmæssig plasticitet. Bredden af neurologiske fænomener, der kan modelleres af Drosophila, kræver en ny komparativ tilgang til måling af fluernes evne til at pleje sig selv.
Den kombinerede virkning af vesikulære monoamintransportører og den relative overflod af dopamin og andre biogene aminer i kroppen har vist sig at formidle frugtsluftsplejende adfærd 9 , 10 . Octopamin og dopamin stimulerer sammenlignelig hindleg grooming aktivitet i decapitated fluer, mens tyramin, forløber for octopamin, også udløser pleje i mindre grad 7 . Fire dopaminreceptorer er blevet identificeret i D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, dum ) i hindleg grooming adfærd 15 .
Grooming kan indirekte kvantificeres ved at se på omfanget af renlighed, hvormed et dyr helt kan gifte sig efter at støv hele kroppen med et markørfarve eller fluorescerende støv 5 , 16 . Resten af støv tilbage på kroppen kan bruges som en relativ markør for den overordnede opførsel. Dusty flyver efter at have fået tilstrækkelig tid til at gifte sig kan vise sig et specifikt underskud i plejeadfærd. Som grooming undersøgelser er blevet mere omfattende, har protokoller indarbejdet sådanne praksis som halshugning for at tilføje farmakologiske behandlinger på nakkebindende nerver 10 , taktil stimulation af børster for at fremkalde grooming respons 2 ,Og videooptagelse af adfærd 15 . Direkte observation af pleje kan let undersøges ved hjælp af visuel observation og manuelt registrering af frekvens og varighed af specifikke plejehændelser 4 .
Vi har designet et femten brøndkammer, der kan konstrueres med en 3D-printer eller laserskærer, og tegningen er tilgængelig til reproduktion 15 . Designet anvender to sammenføjede centrale plader med åbninger, der er matchet og adskilt af mesh og to yderligere glidende top- og bundplader, hvorfra fluer og / eller farvestof er anbragt. Efter at have ladet støvede fluer tid til at pleje, deponerer vi dem i ethanol for at opløse farvestoffet og måle absorbansen af denne opløsning ved farvets bølgelængde. En pladelæser kan bruges til flere parallelle prøver eller et enkeltlæs spektrofotometer kan anvendes til individuelle prøver. Denne metode minimerer fejlen induceret ved håndtering og alLows for grooming analyser skal køres på en mindre, omkostningseffektiv skala. Denne metode er afledt og modificeret fra de metoder, som pioneret af Julie Simpson og Andrew Seeds, der bruger større plejekamre med varmeelementer til temperaturfølsomme kredsløbsmanipulationer 5 . Den følgende protokol viser kvantificering af grooming af hele kroppen såvel som viser alternative metoder til kvantificering af farvestofakkumulering på individuelle kropsdele. Vi præsenterer også stikprøve sammenligningsdata mellem WT og DopR mutanter, samt metoder til beregning af et simpelt præstationsindeks for plejeadfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling
- Forbered en aspirator til at flytte levende Drosophila fra et kulturflaske til plejekammeret. Aspiratorer tillader overførsel af bevidste dyr til adfærdskamrene for at sikre, at anæstesi ikke påvirker efterfølgende adfærdsmæssig observation.
- Brug saks skåret 1,5 fod tygon slange ID ⅛ ", OD ¼". Sæt mindst 1 tommer af spidsen af en 1 ml engangs mikropipette tip. Hold et 1 cm kvadratmaske (åbning 0,196 tommer) over snittespidsen.
BEMÆRK: De fleste 1mL tips har en graderingslinje, hvor spidsen sidder i kassen, typisk skåret til den linje. - Anbring en frisk 1 ml mikropipettespids nøje over net / snittespidsen. Vær opmærksom på maskenes form en tæt barriere mellem de to spidser. Indersiden af det nye tip skaber et holdkammer til fluer.
- Skær den ekstreme spids af den nye mikropipette tip for at udvide åbningen nok til at tillade passage af en enkelt flyve. HolenE vil omtrent svare til åbningen af plejekammeret (ca. 1,5-2 mm i diameter).
- Stram de nestede spidser nede på tygonrørets ende. Skub spidserne ind i røret for at sikre en stram pasform, der muliggør vakuumtryk.
- På den anden ende af slangen skæres spidsen af en 200 μl mikropipettip og passer den smalle snitende ende ind i slangen. Dette er "munden" side af aspiratoren.
- Brug saks skåret 1,5 fod tygon slange ID ⅛ ", OD ¼". Sæt mindst 1 tommer af spidsen af en 1 ml engangs mikropipette tip. Hold et 1 cm kvadratmaske (åbning 0,196 tommer) over snittespidsen.
- Forbered støv alikvot rør. Væg ca. 5 mg Brilliant Yellow farvestof på tareret vejningspapir. Hæld støvet i et 0,6 ml mikrocentrifugerør og luk tæt hætten.
BEMÆRK: Vi anbefaler brug af nitrilhandsker under fremstilling af alikvoter, da nogle latexhandsker er permeable til farvestoffet. - Gentag trin 1.2) for alle prøver i eksperimentet (en for hver flyvning i hvert kammer).
- Forbered ethanol (EtOH) rør: Pipet 1 ml 100% EtOH i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Etikettrør til genotyper eller betingelser. </ Li>
- Gentag trin 1.4) for alle prøver i eksperimentet (en for hver flyvning i hvert kammer). Cap og gem EtOH-rørene til afslutning af grooming-analysen. Inkluder også i det mindste en "Blank" prøve, som kun vil være 1 ml EtOH uden flyve til negative kontroller.
- Saml hvert plejekammer ved at skrue den glidende topplade (med de mindre huller), men lad bundpladen (med de større huller) fjernes for tilsætning af støv.
- Placer hvert nødvendigt plejekammer fladt på et bord med topfladen nedad. Fly-entry-siden er forsiden nedad.
- Indsæt 5 mg Brilliant Yellow farvestof-alikvot i hvert kammer ved at tappe røret mod kammerets overflade over den ønskede brønd. Tryk kammeret mod bordet for at sikre, at alt støv falder gennem nettet til toppladen.
- Skru bundpladen på hvert kammer, så de bredere ender af de koniske åbninger vender udad, og hullerne hviler ikke over brøndene. Sikre bottenTom plade stramt, så det ikke glider og frigiver farvestof.
- Vip kammeret over og bank det fladt mod et bord et par gange, så støvet falder gennem nettet for at hvile på bundpladen.
- Skyd kammerets øverste plade ind i "åben stilling", så de små huller retter sig mod de femten brønde, hvilket tillader indførelse af fluer i individuelle brønde.
2. Fly-dusting og pleje
- Læg en flyve ind i mundens aspirator ved forsigtigt at suge gennem den ene ende af aspiratoren, som om du bruger et strå. Indsæt fluerne ved let at blæse og lede åbningen mod målet.
- Aspirér en flyve ind i hver brønd, der anvendes til eksperimentet. Efter at have læst en brønd, skub den øverste plade, så flyve er fanget i kammeret og læg tape over åbningen af brønden under lastning af hele kammeret for at forhindre flugens flugt under læsning af andre brønde. Hvis flere fluer suges ind i en singelGodt, lad den åbning blive afdækket, indtil kun en flyver er tilbage.
- Når alle de nødvendige brønde er fyldt med fluer, skal du vende kammeret således, at bundpladen er opad, så støvet har potentiale til at belægge fluerne ved at falde gennem nettet.
- Fastgør top- og bundpladerne stramt ved at skrue skruerne og vortex kammeret for at støve fluerne i 4 s.
- Knock kammeret (øverste plade nedad) mod et bord to gange, så farvestoffet falder gennem til den anden side. Derefter flip kammeret over (øverste plade med forsiden op) og slå kammeret to gange for at sikre, at farvestoffet sætter sig på bunden af bundkammeret væk fra fløjet i topkammeret.
- For kontrolflyvninger, som ikke må gifte sig, skal du straks fortsætte til trin 3 i protokollen. For fluer, der vil afslutte analysen, fortsæt til trin 2.7.
- Resten kammeret fladt på et bord eller bordplade med toppladen opad i 30 minutter for at tillade fluerne at gifte sig. Placer kammenEr i et støj- og vibrationsfrit rum for at holde dit miljø konstant for alle plejeforsøg (belysningsniveauer, fugtighed og temperatur). En bordplade inkubator ved RT eller 25 ° C med fugtighedskontrol er ideel.
3. Fremstilling af prøver og absorptionsanalyse
- Ved at holde kammerniveauet med toppladen opad, skrues forsigtigt bundpladen af og fjernes fra kammeret, og pas på ikke at tabe farvestof.
- Placer kammeret på en Fly CO 2 pude med lav luftstrøm, indtil fluerne er bedøvet.
- Skru toppladen fra kammeret. Brug forsigtigt tænger til at gribe et ben og flyt en støvet flue fra hvert kammer og deponér det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende EtOH. Overførselstiden for 15 kamre, der hver indeholder en flyve, er ca. 3-5 min. Eksperimenter bør have faktor i overførselstider, hvis / når forskrækkende eksperimenter med flere kamre for at sikre effektiv opstilling af forsøg. Når hver mikrocentrifugerør indeholder 1 fly, lukkes hætten og inverterer røret tre gange for at agitere og blande opløsningen af farvestof og ethanol.
- Inkuber rør indeholdende ethanol og flyver i 5 timer ved stuetemperatur for at sikre fuldstændig fjernelse af farvestoffet fra flyve til opløsning. Efter 5 h, vortex hvert rør (2 s) kort for at sikre clearance af farvestoffet fra fluerne.
- Aliquot 50 μL af den eksperimentelle 1,5 ml rør ind i en brønd i en 96-brønds plade, hvis den er tilgængelig, idet man noterer placeringen af hver prøve på pladen. Tilsæt 200 μl EtOH for at fortynde prøven 5x. Fortyndingen undgår loftvirkninger af stærkt støvede fluer eller store grooming defekter.
- Brug en pladelæser til at analysere hver prøve ved 397 nm. Alternativt måles absorbansen for individuelle prøver og emner på et standard spektrofotometer i det synlige spektrum, hvis en pladelæser ikke er tilgængelig.
- Læs og optag prøven gennem pladelæser og gem regnearket med recordeD prøver på pladen.
4. Kvantificering af resultater
- Kompilere resultater for alle prøver og måle variansen for hver genotype eller tilstand.
BEMÆRK: Farveakkumulering på tidspunktet 0 min og til tiden 30 min betragtes som separate betingelser ved hjælp af statistisk analyse ved envejs ANOVA- og Bonferroni-korrektion eller andre korrektioner for flere parallelle sammenligninger. - Beregn groom procentforskel for hver genotype / tilstand ved brug af følgende ligning: [(Middelværdi for dyeakkumulering ved tid 0 '- Farveakkumuleringsmiddelværdi ved tid 30') / Farveakkumuleringsmiddelværdi ved tidspunkt 0] x 100.
- Udtryk procentdelen for hver genotype og tilstand i linjeposter og sammenlign på tværs af genotyper og betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groomanalysen giver kvantitative data for at vurdere adfærdsmæssig ydeevne baseret på den relative rest af akkumuleret farvestof efterladt på fluerens kroppe efter en fastsat måltid for grooming (30 min). Prøvebilleder af den glidende plejekammerdesign og de vigtigste trin i analysen er fremhævet i figur 1 . Flyver aggregerer en betydelig mængde farvestof fra øjeblikkelig afstøvning ved vortexning i nærvær af farvestof ( figur 2d, 2e ). Dustede fluer kan bibeholde en række farvestof-akkumulering efter-analyse ( figur 2f, 2g ). Solubilisering af farvestofakkumulering i EtOH og måling af absorption af individuelle prøver giver derfor en reproducerbar og meget kvantitativ vurdering af plejeevne.
I denne undersøgelse af DopR i regulering af hindleg grooming sammenlignede vi groomytelsen af en stærk hypomorf (
At undersøge forskellene væreMellem plejeevner i forbenet mod hindleg grooming-programmer, vurderede vi direkte farvestofakkumulering på adskilte kropsdele under pleje ( figur 4 ). Ved at dissekere hoved, vinger eller "krop" (abdomen / thorax / ben) af individuelle fluer efter-analyse kunne vi pålideligt kvantificere forskelle og ligheder mellem genotyper. Resultaterne understøttede en fortolkning om, at der ikke var nogen forskel for foreleg-pleje-programmer, da der ikke blev observeret væsentlige forskelle for lederne af WT Vs. DopR mutanter. Imidlertid blev der observeret signifikante forskelle for både vinge- og kropsmålinger mellem genotyper. Denne supplerende teknik til at udføre det primære assay på kropsdele i stedet for hele fluer muliggør en simpel metode til i første omgang at skelne mellem foreleg og hindleg grooming-programmer. Disse resultater blev yderligere udvidet og understøttet af omhyggelige adfærdsmæssige observationer og videooptagelse eller sporing af individuelle komponenter i forbenet eller hIndleg adfærd. Alle resultater fra figur 2-4 gengives med tilladelse fra gener, hjerne og adfærd 15 .
Figur 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Dette forenklede flowchart beskriver de vigtigste trin i plejeprotokollen og fremhæver nogle af de nødvendige materialer og udstyr. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Quantification of Grooming baseret på farvestof akkumulering. ( A ) Grooming kammer. Individuelle fluer og Brilliant Yellow farvestof anbringes i individuelle brønde (1 fly: 1 brønd). DimensionerOg tegninger til produktion i supplerende data. ( B, d, f ) WT voksne mandlige Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 voksne mandlige Drosophila. ( B, c ) Fluer før støvning. ( D, e ) Flyver straks efter støvning ved hvirvelkammeret, før pleje (tid: 0 min). ( F, g ) Flyver efter pleje (tid: 30 min). Målestang = 400 μm. Genoptrykt med tilladelse fra gener, hjerne og adfærd 15 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dopaminreceptor ( DopR / dDA1 / dum ) er påkrævet for modulation af plejeadfærd. ( A, c, e ) GroominG wildtype (blå) og mutant fluer (rød / orange) målt til 0 min eller 30 min efter støvning. SEM måles for hver genotype og tilstand. ( A, b ) n = 43 flyver per genotype og tilstand. ( A ) WT og DopR f02676 flyver begge udstiller plejeadfærd (+ / + 30 'sammenlignet med + / + 0' = p værdi <0,0001, DopR f02676 30 'sammenlignet med DopR f02676 0' = p værdi <0,0001). DopR fluer undlader at gifte sig såvel som WT dyr ( DopR f02676 30 'i forhold til + / + 30' = p værdi <0,001). Akut dusting af hver genotype ved 0 'resulterer i tilsvarende ophobning af støv (ns = ikke signifikant). ( B, d, f ) Grooming procentforskel beregnes for hver genotype (farvestof akkum. Ved 0 '- farvestof akkum. Ved 30' / farvestof akkum. 0 'x 100), der giver en relativ værdi til sammenligning af plejeadfærd. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figur 4: Dopaminreceptorfunktion fremmer hindleg grooming. ( A ) Grooming af individuelle regioner af WT (blå) og DopR f02676 / DopR f02676 (rød) målt efter 30 minutter efter støvning og efterfølgende dissektion. P værdi for wing grooming = 0,0204. P værdi for krop = 0,0302. N = 33-35 fluer for alle forhold. SEM måles for hver genotype og tilstand. Statistisk analyse på en måde ANOVA og Bonferonni Correction. Genoptrykt med tilladelse fra gener, hjerne og adfærd 15 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur: Alternativ metode til visuel kvantificering af plejeadfærd ved brug af NIH Image J Pixel Intensity Software. ( A ) Visualisering af wilDtype Drosophila under dissekere omfang. Oval definerer dorsal mave som analysegruppen for pixelintensitet. ( B ) Visualisering af dorsal mave efter støvning med Ultra Green V10 fluorescerende maling pigment. Standardfilter for grøn fluorescens fanger det blågrønne pigment. ( C ) WT dyr efter belægning med UGV10-pigment (prægrooming). ( E ) WT dyr efter belægning med UGV10-pigment (postgrooming). ( D ) DopRf02676 homozygot mutant efter belægning med UGV10 pigment (pregrooming). ( F ) DopRf02676 homozygot mutant efter belægning med UGV10 pigment (post-grooming). ( G ) Kvantificering af pixelintensitet for alle forhold. N = 15 flyver for hver genotype eller tilstand. Statistiske analyser på en måde ANOVA og Bonferonni Correction. Ns = ubetydelig forskel. *** repræsenterer ap <0,001. plLethed klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grooming-analysen er relativt ligetil, men vi vil forsigtige eksperimenter have særlig opmærksomhed på følgende spørgsmål. Vedligeholdelse af en tæt forsegling ved at stramme skruerne på top- og bundpladerne efter introduktion af fluer og farvestoffer er afgørende for reproducerbare resultater. Det strålende gule farvestof er meget fint, og løse led kan tillade tab af farvestoffer fra kammerets kanter. Uregelmæssigheden i farvestofindholdet for hver brønd kunne let smide af grooming-kvantificering, da ikke-ensartet støvning vil øge variansen og falsk-positive satser for grooming-begivenheder. Derudover opfordrer vi eksperimenter til at være opmærksomme på det miljø, hvor de vælger at holde plejekammeret i løbet af 30 min. Plejeperioden. Miljøbestandighed for temperatur, belysning, tid på dagen og fugtighed er afgørende for ensartet ydeevne for Drosophila adfærdstest. Holde plejekamrene i en lille inkubator for at minimere distraherende oR variable laboratoriemiljøer er ideelle til maksimal reproducerbarhed af resultater, men andre rumlige arrangementer kan også lykkes.
Med hensyn til farvestof-akkumuleringsmålinger har vi observeret, at farvestoffet er permeabelt for latexhandsker, så nitrilhandsker foretrækkes til håndtering og vejning af støv. Pas på ikke at sprede støv bredt på tværs af laboratorieflader, da det let kan plette tøj og potentielt forurene overflader eller udstyr. Isolering af et område og en fly-station / CO 2 pad til forsøg er at foretrække at indeholde farvestof eksponering. Vi opfordrer også eksperimenter til at være sikker på at bruge UV-gennemsigtige 96-brønds plader. Den absorberende top på 397 nm for Brilliant Yellow farve er nær UV spektret, og standard 96-brønds plader kan give svage eller unøjagtige foranstaltninger til farvestoffortyndinger. Farvestoffet er også opløseligt i vand som et alternativ til EtOH. Imidlertid sinker Drosophila ikke let i vand uden signifikant vortexing og små luftbobler aloNg kroppen af farvede dyr viser lavere konsistens og opløselighed af farvestof. Ethanol viser konsekvent bedre resultater og lavere variation i direkte sammenligninger.
Vores assay kan let modificeres til supplerende teknikker og mere raffinerede undersøgelser, såsom dissektion af flylegemets efteranalyse ( Figur 4 ). Sådanne tillæg kan være nødvendige for at forstå, hvilke groomingstræk er berørt, da farvestofakkumuleringen kun brede peger på adfærdsskift uden direkte at adressere den grundlæggende biologiske eller neurale årsag. Når der er observeret forskelle, er parallelle eksperimenter, der bruger videooptagelser eller direkte observationsmetoder, afgørende for at forstå den adfærdsmæssige rot af eventuelle forskelle i grooming effektivitet. Dette kan undersøges yderligere ved visuel kvantificering af støvpartikelakkumulering på specifikke kropsdele ved hjælp af pixelintensitetsforanstaltninger gennem NIH ImageJ softwareprogrammet sammen med direkte sporing af forben og hindleglegAdfærd ved at score videooptagelser. Med hensyn til alternative metoder til visuel kvantificering af fluorescerende støv anvendte tidlige eksperimenter i laboratoriet et fluorescerende malingspigment afledt af Alkaline Rare Earth Metal Silicium-Aluminate Oxide Europium. Efter afstødning af fluer med fluorescerende malingpigmentet og bedøvelse eller afkapning af dyrene efter pleje, kan legemene optages og analyseres ved digital mikroskopi ved anvendelse af et standard fluorescerende filter til GFP på et dissekeringsområde ( Supplemental Data ). Selv om denne metode tillader en nøjagtig kvantificering af pixelintensitet, der svarer til resultaterne iagttaget med Brilliant Yellow-farvestof, fandt vi, at gennemstrømningen af denne metode er relativt langsom, og pigmentpartiklerne varierer lidt i størrelse og er mindre ensartede end belægningen observeret for Brilliant Gul farvestof. For nogle eksperimentelle applikationer er denne alternative metode imidlertid hensigtsmæssig, og der er betydelig variation i tilgængelig fluoRescent farver, som kunne være nyttige til drosophila og nondrosophila applikationer eller iterative støvforsøg , hvor kvantificering af separate hændelser er afgørende. Det skal bemærkes, at malingspigmentet selv er vandopløseligt, men taber hurtigt sin fluorescens i vand, hvilket vanskeliggør brugen af dette pigment til standardabsorptionsforanstaltninger.
Disse former for metoder, der er rettet mod specifikke forben eller forhindrende plejehændelser, er afgørende for forståelsen af en fænotypes nøjagtige karakter og kan fremhæve potentielle neurale kredsløb eller lokomotoriske programmer til at undersøge yderligere. For parallelle kontrolforsøg er det desuden vigtigt at udelukke potentielle ikke-specifikke adfærdsmæssige årsager, at grooming kan blive påvirket. Hvis dyr udviser brede motorunderskud eller abnormiteter, er det muligt, at groom-underskud er sekundære for de brede lokomotoriske fænotyper. Enkel video-sporing af WT-dyr mod mutanten eller cirCuit manipulerede forhold kan let diskriminere mellem store skift i hastighed eller total distance tilbagelagt uafhængig af grooming underskud.
Grooming assay er en alsidig metode, der er egnet til både små og store studier af dette komplekse multistep lokomotoriske program; Designene ændres let for at øge kammerdimensionen eller nummer 15 . Metoden giver robuste kvantitative data, der er ideelle til sammenlignende vurdering af fluer 'grooming evne. Produktion af kamrene er omkostningseffektiv og kan fremstilles ved hjælp af mange forskellige maskiner (3D-printere, laserskærere, CNC-møller) afhængigt af tilgængelige ressourcer. Teknikken muliggør mellemliggende gennemløb af individuelle prøver, der let kunne udvides til genetiske skærme og funktionelle kredsløbskartingsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi ønsker at takke Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon og Rose Hedreen for tidligt arbejde med at teste og etablere denne metodologi og kammerdesign. Vi takker Kelly Tellez og Graham Buchan for at læse og redigere manuskriptet. Vi takker Andrew Seeds og Julie Simpson for deres banebrydende arbejde og deres råd og støtte til at foreslå brugen af Brilliant Yellow Dye (Sigma). Dette arbejde støttes dels af Mary E. Groff Kirurgisk og Medicinsk Research and Education Charitable Trust, Bronfman Science Center og Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
