Summary
Este protocolo describe una técnica de ensayo escalable de aseo personal en Drosophila que proporciona datos robustos y cuantitativos para medir el comportamiento de la preparación. El método se basa en la comparación de la diferencia en la acumulación de colorantes en los cuerpos de los animales no ceñidos frente a los cuidados durante un período determinado de tiempo.
Abstract
El comportamiento de aseo de Drosophila es un complejo programa locomotor de varios pasos que requiere un movimiento coordinado tanto de las patas delanteras como de las patas posteriores. Aquí presentamos un protocolo de ensayo de aseo personal y un nuevo diseño de cámara que es rentable y escalable para estudios pequeños o en gran escala de aseo de Drosophila . Las moscas se espolvorean por todo su cuerpo con colorante amarillo brillante y se da tiempo para eliminar el tinte de sus cuerpos dentro de la cámara. Las moscas se depositan entonces en un volumen establecido de etanol para solubilizar el colorante. Se mide y se registra la absorbancia espectral relativa de muestras de tinte-etanol para animales cepillados frente a no cepillados. El protocolo proporciona datos cuantitativos de acumulación de colorantes para las moscas individuales, que pueden ser fácilmente promediados y comparados entre muestras. Esto permite que los diseños experimentales evalúen fácilmente la capacidad de preparación para estudios en animales mutantes o manipulaciones de circuitos. Este procedimiento eficiente es versátil y escalable. Mostramos wOrk-flow del protocolo y datos comparativos entre animales WT y animales mutantes para el Receptor de Dopamina Drosophila tipo I ( DopR ).
Introduction
El aseo en Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) es un comportamiento innato robusto que implica la coordinación de múltiples programas motores independientes 1 . Las moscas de la fruta limpian sus cuerpos de polvo, microbios y otros patógenos que podrían inhibir la función fisiológica normal, como la visión y el vuelo, o dar lugar a desafíos inmunológicos importantes. Al detectar y responder tanto a la mecánica 2 como a la activación inmunitaria 3 , las moscas se frotan repetidamente las piernas juntas o en una región del cuerpo objetivo hasta que esté suficientemente limpia y el aseo progrese hacia otra parte del cuerpo. Las moscas realizan movimientos de aseo en episodios distintos que ocurren en gran medida en patrones estereotipados 1 , 4 . Una jerarquía de comportamiento se hace evidente a medida que las señales de aseo se priorizan. Se han identificado circuitos y patrones de actividad paraFa que los programas de aseo en la parte superior de la jerarquía ocurren primero y suprimen las señales paralelas de las áreas del cuerpo que se preparan posteriormente 5 . La máxima prioridad se da a la cabeza, luego al abdomen, alas y finalmente al tórax 5 .
El programa de aseo en D. melanogaster es un sistema ideal para estudiar circuitos neuronales, señales moleculares moduladoras y neurotransmisores. Por ejemplo, el compromiso de la función de la neurofibromina 6 , la pérdida de la proteína de retraso mental X frágil de Drosophila ( dfmr1 ) 7 y la exposición al bisfenol A (BPA) 8 causan excesiva higiene y otros comportamientos análogos a los síntomas humanos discretos de neurofibromatosis, X frágil Síndrome y aspectos de los trastornos del espectro autista y trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), respectivamente. El comportamiento de la preparación también puede ser habituaDiferenciadamente a través de las cepas mutantes 2 , otorgando este programa motor a estudios de plasticidad conductual. La amplitud de los fenómenos neurológicos que pueden ser modelados por Drosophila exige un nuevo enfoque comparativo para medir la capacidad de las moscas para prepararse.
La acción combinada de transportadores de monoaminas vesiculares y la abundancia relativa de la dopamina y otras aminas biogénicas en el cuerpo se ha demostrado que mediar mosca de la fruta comportamiento 9, 10 de la preparación. La octopamina y la dopamina estimulan la actividad comparativa de aseo de las patas traseras en las moscas decapitadas, mientras que la tiramina, precursora de la octopamina, también desencadena el aseo en menor grado 7 . Se han identificado cuatro receptores de dopamina en D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, tonto ) en el comportamiento de aseo de la espalda 15 .
El aseo se puede cuantificar indirectamente mirando el grado de limpieza por el cual un animal puede prepararse completamente después de limpiar el cuerpo entero con un tinte marcador o polvo fluorescente 5 , 16 . El resto de polvo que queda en el cuerpo puede usarse como un marcador relativo para el comportamiento general. Moscas polvorientas después de ser dado tiempo suficiente para el novio puede estar manifestando un déficit específico en el comportamiento de aseo. A medida que las investigaciones de aseo se han vuelto más extensas, los protocolos han incorporado prácticas tales como la decapitación para agregar tratamientos farmacológicos a los nervios conectivos del cuello 10 , estimulación táctil de cerdas para obtener la respuesta de aseo 2 ,Y grabación de vídeo de comportamiento 15 . La observación directa de la preparación puede ser fácilmente estudiada mediante el uso de la observación visual y el registro manual de la frecuencia y la duración de los eventos de aseo específicos 4 .
Diseñamos una cámara de preparación de quince pocillos que puede ser construida con una impresora 3D o cortador láser, y los diseños de planos están disponibles para su reproducción 15 . El diseño utiliza dos placas centrales unidas con aberturas emparejadas y separadas por malla y dos placas deslizantes superiores y inferiores adicionales, de las cuales se cargan moscas y / o tintes, respectivamente. Después de permitir que las moscas espolvoreadas se preparen, se depositan en etanol para solubilizar el colorante y se mide la absorbancia de esta solución a la longitud de onda del colorante. Se puede utilizar un lector de placas para múltiples muestras paralelas o un espectrofotómetro de lectura única para muestras individuales. Este método minimiza el error inducido por la manipulación yBajos para los ensayos de aseo para funcionar en una escala más pequeña y rentable. Este método se deriva y se modifica a partir de los métodos pioneros de Julie Simpson y Andrew Seeds, que utilizan cámaras de grooming más grandes con elementos de calefacción para la temperatura de manipulación de circuitos sensibles [ 5] . El siguiente protocolo muestra la cuantificación de la preparación de todo el cuerpo, así como muestra métodos alternativos para la cuantificación de la acumulación de tinte en partes del cuerpo individuales. También se presentan los datos de comparación de muestras entre WT y DopR mutantes, así como los métodos para calcular un índice de rendimiento simple para el comportamiento de aseo.
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Protocol
1. Preparación
- Preparar un aspirador para mover vivo Drosophila de un frasco de cultivo a la cámara de aseo. Los aspiradores permiten la transferencia de animales conscientes a las cámaras conductuales para asegurar que la anestesia no afecte a la observación conductual posterior.
- Usando tijeras cortar 1,5 pies de tubería Tygon ID ⅛ ", OD ¼". Cortar por lo menos 1 pulgada de la punta de una punta de micropipeta desechable de 1 ml. Sostenga un pedazo cuadrado de 1 cm de malla (abertura 0,196 pulgadas) sobre la punta cortada.
NOTA: La mayoría de las puntas de 1mL tienen una línea de gradación donde la punta se encuentra en la caja del paquete, normalmente cortada en esa línea. - Coloque una punta de micropipeta fresca de 1 ml sobre la malla / punta cortada. Observe que la malla forma una barrera hermética entre las dos puntas. El interior de la nueva punta crea una cámara de retención para las moscas.
- Corte la punta extrema de la nueva punta de la micropipeta para ensanchar la abertura lo suficiente para permitir el paso de una sola mosca. El holE coincidirá aproximadamente con la apertura de la cámara de aseo (aproximadamente 1,5-2 mm de diámetro).
- Encaje perfectamente las puntas anidadas en el extremo de la tubería tygon. Empuje las puntas en el tubo para asegurar un ajuste apretado para permitir la presión del vacío.
- En el otro extremo de la tubería, corte la punta de una punta de micropipeta de 200 μl y ajuste el extremo de corte estrecho en el tubo. Este es el lado "boca" del aspirador.
- Usando tijeras cortar 1,5 pies de tubería Tygon ID ⅛ ", OD ¼". Cortar por lo menos 1 pulgada de la punta de una punta de micropipeta desechable de 1 ml. Sostenga un pedazo cuadrado de 1 cm de malla (abertura 0,196 pulgadas) sobre la punta cortada.
- Prepare los tubos alícuotas de polvo. Pesar aproximadamente 5 mg de colorante Brilliant Yellow sobre papel de pesado tarado. Vierta el polvo en un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml y cierre firmemente la tapa.
NOTA: Recomendamos el uso de guantes de nitrilo durante la preparación de la alícuota, ya que algunos guantes de látex son permeables al colorante. - Repita el paso 1.2) para todas las muestras en el experimento (una para cada mosca en cada cámara).
- Preparación de tubos de etanol (EtOH): Pipetar 1 ml de EtOH al 100% en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Rotular tubos para genotipos o condiciones. <Li
- Repita el paso 1.4) para todas las muestras en el experimento (una para cada mosca en cada cámara). Cap y guardar los tubos de EtOH para completar el ensayo de aseo. Incluya también al menos una muestra "en blanco" que sólo será de 1 ml de EtOH sin mosca para los controles negativos.
- Montar cada cámara de grooming atornillando la placa superior deslizante (con los agujeros más pequeños) pero dejando la placa inferior (con los agujeros más grandes) quitados para la adición del polvo.
- Coloque cada cámara de aseo necesaria plana sobre una mesa con la cara superior hacia abajo. El lado de entrada de la mosca está boca abajo.
- Cargue 5 mg de alícuota de colorante Amarillo Brillante en cada cámara golpeando el tubo contra la superficie de la cámara por encima del pozo deseado. Toque la cámara contra la mesa para asegurarse de que todo el polvo caiga a través de la malla hasta la placa superior.
- Atornille la placa inferior en cada cámara de tal manera que los extremos más anchos de las aberturas cónicas estén hacia fuera y los orificios no descansen sobre los pocillos. Asegure el botTom de la placa firmemente para que no se deslice y liberar colorante.
- Voltear la cámara y golpearla plana contra una mesa unas cuantas veces para que el polvo caiga a través de la malla para descansar en la placa inferior.
- Deslice la placa superior de la cámara en la "posición abierta" para que los pequeños agujeros se alineen con los quince pozos, permitiendo la introducción de moscas en pozos individuales.
2. Mosca-polvo y aseo
- Cargue una mosca en el aspirador bucal succionando suavemente por un extremo del aspirador como si estuviera usando una pajita. Deposite las moscas soplando ligeramente y dirigiendo la abertura hacia el objetivo.
- Aspirar una mosca en cada pocillo utilizado para el experimento. Después de cargar un pozo, deslice la placa superior para que la mosca quede atrapada en la cámara y coloque cinta sobre la abertura de ese pozo durante la carga de toda la cámara para evitar el escape de la mosca mientras se carga otros pozos. Si se aspiran múltiples moscas en unE, deja esa abertura descubierta hasta que quede una sola mosca.
- Después de que todos los pocillos necesarios estén llenos de moscas, voltee la cámara de tal manera que la placa inferior esté hacia arriba de modo que el polvo tenga el potencial para revestir las moscas al caer a través de la malla.
- Asegure firmemente las placas superior e inferior apretando los tornillos, y vórtice la cámara para quitar el polvo de las moscas durante 4 s.
- Golpee la cámara (placa superior boca abajo) contra una mesa dos veces para que el colorante caiga al otro lado. Luego, voltee la cámara sobre (la placa superior boca arriba) y golpee la cámara dos veces para asegurar que el colorante se asiente en el piso de la cámara inferior lejos de la mosca sostenida en la cámara superior.
- Para moscas de control que no están permitidas para preparar, proceder inmediatamente al Paso 3 del protocolo. Para las moscas que completarán el ensayo, proceda al Paso 2.7.
- Apoyar la cámara sobre una mesa o mostrador con la placa superior hacia arriba durante treinta minutos para permitir que las moscas para preparar. Coloque el chambEn un espacio libre de ruidos y vibraciones para mantener constante el ambiente en todos los experimentos de aseo (niveles de iluminación, humedad y temperatura). Un incubador de mesa a temperatura ambiente o 25 ° C con controles de humedad es ideal.
3. Preparación de muestras y análisis de absorbancia
- Manteniendo la cámara nivelada con la placa superior hacia arriba, desenrosque suavemente la placa inferior y retírela de la cámara, teniendo cuidado de no perder colorante.
- Coloque la cámara en un cojín Fly CO 2 con un flujo de aire bajo hasta que las moscas estén anestesiadas.
- Desenrosque la placa superior de la cámara. Utilice con cuidado pinzas para agarrar una pierna y mover una mosca espolvoreada de cada cámara y depositarla en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga EtOH. El tiempo de transferencia para 15 cámaras cada una conteniendo una mosca es aproximadamente 3-5 min. Los experimentadores deben tener en cuenta los tiempos de transferencia si se realizan experimentos escalonados con cámaras múltiples para asegurar una estadificación eficiente de los experimentos. Una vez que cada tubo de microcentrífuga contenga 1 mosca, cierre la tapa e invierta el tubo tres veces para agitar y mezcle la solución de colorante y etanol.
- Incubar los tubos que contienen etanol y moscas durante 5 h a RT para asegurar la eliminación completa del tinte de la mosca en solución. Después de las 5 h, vórtice brevemente cada tubo (2 s) para asegurar la separación del colorante de las moscas.
- Alícuota de 50 μL del tubo experimental de 1,5 ml en un pocillo de una placa de 96 pocillos si está disponible, tomando nota de la ubicación de cada muestra en la placa. Añadir 200 μl de EtOH para diluir la muestra 5x. La dilución evita los efectos de techo de las moscas pesadamente espolvoreadas o los defectos grandes de la preparación.
- Utilice un lector de placas para analizar cada muestra a 397 nm. Alternativamente, mida la absorbancia para muestras individuales y espacios en blanco en un espectrofotómetro estándar en el espectro visible si un lector de placas no está disponible.
- Leer y registrar la muestra a través del lector de planchas y guardar la hoja de cálculo con el recordeD en la placa.
4. Cuantificación de los resultados
- Compilar los resultados de todas las muestras y medir la varianza para cada genotipo o condición.
NOTA: La acumulación de colorantes en el tiempo 0 min y en el tiempo 30 min se consideran condiciones separadas usando análisis estadístico por ANOVA de una vía y corrección de Bonferroni u otras correcciones para múltiples comparaciones paralelas. - Calcule la diferencia de porcentaje de aseo para cada genotipo / condición utilizando la siguiente ecuación: [(valor medio de acumulación de colorante en el tiempo 0 '- valor medio de acumulación de colorante en el tiempo 30') / valor medio de acumulación de colorante en el tiempo 0] x 100.
- Expresar el porcentaje de cada genotipo y condición en parcelas de barras y comparar a través de genotipos y condiciones.
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Representative Results
El ensayo de aseo proporciona datos cuantitativos para evaluar el rendimiento del comportamiento basado en el resto relativo del colorante acumulado que queda sobre los cuerpos de moscas después de un tiempo establecido de medición para el aseo (30 min). En la Figura 1 se destacan imágenes de muestra del diseño de la cámara de limpieza deslizante y los pasos principales del ensayo. Las moscas agregan una cantidad significativa de colorante de la formación de polvo inmediata por agitación en presencia de colorante ( Figura 2d, 2e ). Las moscas espolvoreadas pueden retener una gama de acumulación de tinte post-ensayo ( Figura 2f, 2g ). Por lo tanto, la solubilización de la acumulación de colorante en EtOH y la medición de la absorbancia de muestras individuales proporciona una evaluación reproducible y altamente cuantitativa de la capacidad de aseo.
En este estudio de DopR en la regulación del aseo de las patas traseras, se comparó el comportamiento de aseo de un hipomorfo fuerte (
Para investigar las diferenciasEntre las habilidades de aseo de los programas de preparación de la pierna delantera y de la pata trasera, evaluamos directamente la acumulación de colorantes en las partes separables del cuerpo durante el aseo ( Figura 4 ). Mediante la disección de las cabezas, alas o "cuerpo" (abdomen / tórax / piernas) de las moscas individuales después del ensayo, pudimos cuantificar de manera fiable las diferencias y similitudes entre los genotipos. Los hallazgos apoyaron una interpretación de que no existían diferencias para los programas de preparación de miembros anteriores, ya que no se observaron diferencias significativas para los jefes de WT Vs. DopR mutantes. Sin embargo, se observaron diferencias significativas tanto para las mediciones del ala como del cuerpo entre genotipos. Esta técnica suplementaria para realizar el ensayo primario sobre partes del cuerpo en lugar de moscas enteras permite que un método simple distinga inicialmente los programas de preparación de la pierna delantera y los de la patas traseras. Estos resultados fueron ampliados y apoyados por observaciones de comportamiento cuidadosa y grabación de video o seguimiento de componentes individuales de la pata delantera o hComportamientos indleg. Todos los resultados de las Figuras 2-4 se reproducen con permiso de Genes, Brain, and Behavior 15 .
Figura 1: Drosophila Grooming Assay Workflow. Este diagrama de flujo simplificado describe los pasos principales en el protocolo de aseo, destacando algunos de los materiales y equipos necesarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cuantificación de Grooming basado en la acumulación de colorantes. (A) cámara de preparación. Las moscas individuales y el tinte Brilliant Yellow se colocan en pocillos individuales (1 mosca: 1 pocillo). DimensionesY planos para la producción en datos suplementarios. ( B, d, f ) WT macho adulto Drosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 macho adulto Drosophila. ( B, c ) Moscas antes de sacudir el polvo. ( D, e ) Moscas inmediatamente después del espolvoreo por vórtice de la cámara, antes del aseo (tiempo: 0 min). ( F, g ) Moscas después del aseo (tiempo: 30 min). Barra de escala = 400 μm. Reimpreso con permiso de Genes, Brain, and Behavior 15 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Receptor de dopamina ( DopR / dDA1 / mudo ) es necesario para la modulación del comportamiento de aseo. (A , c, e ) GroominG de tipo salvaje (azul) y moscas mutantes (rojo / naranja) medidas a 0 min o 30 min después del espolvoreo. SEM se mide para cada genotipo y condición. (A , b ) n = 43 moscas por genotipo y condición. (A) WT y f02676 DopR moscas ambas exhiben el comportamiento de acicalamiento (+ / + 30' en comparación con + / + 0' = valor p <0,0001, DopR f02676 30' en comparación con DopR f02676 0' = valor p <0,0001). Las moscas DopR no se preparan tanto como los animales WT ( DopR f02676 30 'en comparación con + / + 30' = valor p <0,001). La depuración aguda de cada genotipo a 0 'da como resultado una acumulación equivalente de polvo (ns = no significativo). ( B, d, f ) Se calcula la diferencia de porcentaje de aseo para cada genotipo (tinte acumulado a 0 '- acúmulo de tinte a 30' / tinte acumulado 0 'x 100) proporcionando un valor relativo para comparar comportamientos de aseo. ( C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figura 4: Función del receptor de la dopamina Potencializa el aseo de los hilos. (A) Preparación de las regiones individuales de WT (azul) y DopR f02676 / f02676 DopR (rojo) medida a 30 min después de la formación de polvo y la subsiguiente disección. Valor de p para la preparación del ala = 0.0204. Valor de p para el cuerpo = 0,0302. N = 33-35 moscas para todas las condiciones. SEM se mide para cada genotipo y condición. Análisis estadístico por One Way ANOVA y Bonferonni Corrección. Reimpreso con permiso de Genes, Brain, and Behavior 15 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria: Método alternativo para la cuantificación visual del comportamiento de la preparación con NIH Image J Software de intensidad de píxeles. ( A ) Visualización de wilDtype Drosophila bajo alcance de disección. Oval define abdomen dorsal como la región de análisis de la intensidad de píxeles. ( B ) Visualización del abdomen dorsal después del polvorimiento con pigmento de pintura fluorescente Ultra Green V10. Filtro estándar para la fluorescencia verde captura el pigmento azul-verde. ( C ) WT animal después del revestimiento con pigmento UGV10 (preparación previa). ( E ) WT animal después de revestimiento con pigmento UGV10 (post-preparación). ( D ) mutante homocigótico DopRf02676 después de revestir con pigmento UGV10 (preparación previa). ( F ) DopRf02676 mutante homocigótico después de recubrimiento con pigmento UGV10 (post-aseo). ( G ) Cuantificación de la intensidad de píxel para todas las condiciones. N = 15 moscas para cada genotipo o condición. Análisis estadísticos por One Way ANOVA y Bonferonni Correction. Ns = diferencia no significativa. *** representa p <0,001. PlHaga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El ensayo de aseo es relativamente sencillo, pero recomendamos a los experimentadores que presten especial atención a los siguientes temas. Mantener un sello hermético apretando los tornillos en las placas superiores e inferiores después de introducir las moscas y el tinte es esencial para resultados reproducibles. El colorante Brilliant Yellow es muy fino y las articulaciones sueltas permitirán pérdidas de colorante de los bordes de la cámara. La irregularidad en el contenido de colorante para cada pocillo podría fácilmente deshacerse de la cuantificación de aseo ya que el polvillo no uniforme aumentará la varianza y las tasas de falsos positivos para los eventos de aseo. Además, animamos a los experimentadores a ser conscientes del medio ambiente en el que optan por mantener la cámara de aseo durante el período de 30 minutos de aseo. La constancia ambiental para la temperatura, la iluminación, la hora del día y la humedad son esenciales para un rendimiento consistente para los ensayos de comportamiento de Drosophila . Sosteniendo las cámaras de aseo dentro de una pequeña incubadora para minimizar la distracción oR ambientes de laboratorio variable es ideal para la máxima reproducibilidad de los resultados, pero otros arreglos espaciales también pueden ser exitosos.
Con respecto a las medidas de acumulación de colorantes, hemos observado que el colorante es permeable a los guantes de látex, por lo que los guantes de nitrilo son preferibles para manipular y pesar el polvo. Tenga cuidado de no extender el polvo ampliamente a través de las superficies del laboratorio, ya que fácilmente manchará la ropa y potencialmente contaminará las superficies o el equipo. Es preferible aislar un área y una almohadilla de mosquitera / CO 2 para experimentos para contener la exposición al tinte. También alentamos a los experimentadores a asegurarse de usar placas de 96 pocillos transparentes a los rayos UV. El pico de absorbancia de 397 nm para el colorante Brilliant Yellow está cerca del espectro UV y las placas estándar de 96 pocillos pueden dar medidas débiles o inexactas para las diluciones de colorantes. El colorante es también soluble en agua como una alternativa al EtOH. Sin embargo, Drosophila no se hunden fácilmente en agua sin vortexing significativo y pequeñas burbujas de aire aloNg el cuerpo de animales teñidos muestran menor consistencia y solubilidad del colorante. El etanol muestra consistentemente mejores resultados y menor varianza en las comparaciones directas.
Nuestro ensayo puede ser fácilmente modificado para técnicas complementarias y estudios más refinados, como la disección del cuerpo de mosca post-ensayo ( Figura 4 ). Tales suplementos pueden ser necesarios para entender cuáles pasos de aseo se ven afectados, ya que la acumulación de tintes sólo apunta en términos generales a cambios de comportamiento sin abordar directamente la causa biológica o neural fundamental. Una vez que se observan las diferencias, los experimentos paralelos utilizando la grabación de video o métodos de observación directa son esenciales para entender la raíz conductual de cualquier diferencia en la eficiencia de la preparación. Esto puede investigarse adicionalmente mediante la cuantificación visual de la acumulación de partículas de polvo en partes específicas del cuerpo usando medidas de intensidad de píxeles a través del programa de software NIH ImageJ, junto con el seguimiento directo de la pata delantera y la pata posteriorComportamientos mediante la puntuación de imágenes de vídeo. Con respecto a los métodos alternativos para la cuantificación visual del polvo fluorescente, los primeros experimentos en el laboratorio utilizaron un pigmento fluorescente de la pintura derivado del óxido de aluminio de la tierra rara alcalina - óxido de aluminio Europium. Después de quitar el polvo de las moscas con el pigmento de pintura fluorescente y anestesiante o decapitar a los animales después de la limpieza, los cuerpos pueden ser registrados y analizados por microscopía digital utilizando un filtro fluorescente estándar para GFP en un microscopio de disección (Supplemental Data). Aunque este método permite una cuantificación precisa de la intensidad de los píxeles que es paralela a los resultados observados usando colorante amarillo brillante, se encontró que el rendimiento de este método es relativamente lento y las partículas de pigmento varían ligeramente en tamaño y son menos uniformes que el recubrimiento observado para Brilliant Colorante amarillo. Sin embargo, para algunas aplicaciones experimentales, este método alternativo es apropiado, y existe una variedad significativa de fluo disponibleRescent los colores que podrían ser útiles para las aplicaciones de la drosophila y nondrosophila o los experimentos iterativos del polvo donde la cuantificación de acontecimientos separados es esencial. Debe observarse que el pigmento de la pintura en sí es soluble en agua pero pierde rápidamente su fluorescencia en agua, perjudicando gravemente la utilidad de este pigmento para las medidas de absorbancia estándar.
Este tipo de métodos dirigidos específicamente a la pata delantera o los eventos de aseo posterior son esenciales para comprender la naturaleza precisa de un fenotipo y pueden destacar posibles circuitos neuronales o programas locomotores para investigar más. Además, para los experimentos de control paralelo, es esencial descartar posibles razones de comportamiento no específicas que la preparación podría verse afectada. Si los animales presentan deficiencias motoras anchas o anormalidades, es posible que los déficits de la preparación sean secundarios a los fenotipos locomotores amplios. Seguimiento de video simple de animales WT versus el mutante o cirLas condiciones manipuladas pueden fácilmente discriminar entre los grandes cambios de velocidad o la distancia total recorrida, independientemente de los déficits de aseo.
El ensayo de aseo es un método versátil, adecuado tanto para estudios pequeños como a gran escala de este complejo programa locomotor de varios pasos; Los diseños se modifican fácilmente para aumentar la dimensión de la cámara o el número 15 . El método proporciona datos cuantitativos robustos que son ideales para la evaluación comparativa de la capacidad de aseo de las moscas. La producción de las cámaras es rentable, y se puede hacer usando muchas máquinas diferentes (impresoras 3D, cortadores láser, molinos CNC) dependiendo de los recursos disponibles. La técnica permite el procesamiento intermedio de muestras individuales que podrían ser fácilmente expandidas para pantallas genéticas y estudios funcionales de mapas de circuitos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Deseamos agradecer a Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon y Rose Hedreen por sus primeros trabajos en pruebas y establecimiento de esta metodología y diseños de cámara. Agradecemos a Kelly Tellez y Graham Buchan por leer y editar el manuscrito. Damos las gracias a Andrew Seeds y Julie Simpson por su trabajo pionero y su asesoramiento y apoyo en la sugerencia del uso de Brilliant Yellow Dye (Sigma). Este trabajo es apoyado en parte por el Mary E. Groff Cirugía y Investigación Médica y Educación Charitable Trust, el Bronfman Science Center, y el Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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