Summary
Questo protocollo descrive una tecnica di dosaggio individuale scalabile di dosaggio in Drosophila che fornisce dati robusti e quantitativi per misurare il comportamento di manipolazione. Il metodo si basa sulla comparazione della differenza di accumulo di tinture nei corpi di animali non trattati e trattati in un determinato periodo di tempo.
Abstract
Il comportamento di grooming di Drosophila è un complesso programma locomotore multiplo che richiede un movimento coordinato di entrambi i lati e le zampe. Qui presentiamo un protocollo di dosaggio e un nuovo disegno a camera che è economicamente efficiente e scalabile per studi su piccola o larga scala di Drosophila . Le mosche vengono spolverate in tutto il corpo con la colorazione gialla brillante e hanno dato tempo per rimuovere il colorante dai loro corpi all'interno della camera. Le mosche vengono quindi depositate in un determinato volume di etanolo per solubilizzare il colorante. Sono misurate e registrate l'assorbanza spettrale relativa dei campioni di coloranti etanolo per animali da allevamento contro animali non macellati. Il protocollo fornisce dati quantitativi di accumulo di tinture per singole mosche, che possono essere facilmente mediate e confrontate tra campioni. Ciò consente ai disegni sperimentali di valutare facilmente le abilità di cura per gli studi sugli animali mutati o sulle manipolazioni dei circuiti. Questa procedura efficace è versatile e scalabile. Mostriamo wOrc-flow del protocollo e dati comparativi tra animali WT e animali mutanti per il Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).
Introduction
Il grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) è un comportamento robusto innato che coinvolge il coordinamento di più programmi motori indipendenti 1 . I frutti volano puliscono i loro corpi di polvere, microbi e altri agenti patogeni che potrebbero inibire la normale funzione fisiologica, come la vista e il volo, o portare a importanti sfide immunitarie. Nel rilevare e reagire sia all'attivazione meccanica 2 che all'immunizzazione 3 , le mosche si ripetono a strofinare le gambe insieme o su una regione corporea mirata fino a quando non è sufficientemente pulita e il grooming progredisce in un'altra parte del corpo. Le mosche svolgono movimenti di governare in attacchi distinti che in gran parte si verificano nei modelli stereotipati 1 , 4 . Una gerarchia comportamentale diventa evidente come i segnali di governare sono prioritizzati. Circuiti e modelli di attività sono stati identificati in supporto oFa il modello che i programmi di grooming in cima alla gerarchia si verificano in primo luogo e sopprimono i segnali paralleli da aree del corpo che vengono curate in seguito 5 . La massima priorità è data alla testa, poi all'addome, alle ali e infine al torace 5 .
Il programma di grooming in D. melanogaster è un sistema ideale per studiare circuiti neurali, segnali molecolari modulatori e neurotrasmettitori. Ad esempio, il compromesso della funzione neurofibromina 6 , la perdita della proteina Drosophila fragile X retardazione mentale ( dfmr1 ) 7 e l'esposizione a bisfenolo A (BPA) 8 provocano eccessivi trattamenti e altri comportamenti analoghi ai sintomi umani discreti di neurofibromatosi, fragili X Sindrome e aspetti dei disordini dello spettro autistico e disordine di iperattività (ADHD). Il comportamento di grooming può anche essere habituaTed differenzialmente attraverso i ceppi mutanti 2 , prestando questo programma motore a studi di plasticità comportamentale. L'ampiezza dei fenomeni neurologici che può essere modellata da Drosophila richiede un nuovo approccio comparativo per misurare la capacità delle mosche di sposarsi.
Si è dimostrato che l'azione combinata di trasportatori di monoammina vescicolare e la relativa abbondanza di dopamina e di altre ammine biogene nel corpo sono in grado di mediare il comportamento della volatili da frutta 9 , 10 . L'ottopamina e la dopamina stimolano un'attività comparativa di regolazione del collo posteriore nelle mosche decapitate, mentre la tiramina, precursore della ottopamina, innesca anche un grooming in misura minore 7 . Quattro recettori della dopamina sono stati identificati in D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 DopR, dDA1, dumb ) nel comportamento pastorale 15 .
Il grooming può essere quantificato indirettamente guardando l'estensione della pulizia con cui un animale può spogliarsi completamente dopo aver spolverato tutto il corpo con un colorante marcatore o una polvere fluorescente 5 , 16 . Il resto della polvere lasciato sul corpo può essere utilizzato come marcatore relativo per il comportamento complessivo. Dusty vola dopo essere stato dato tempo sufficiente per lo sposo può manifestare un deficit specifico nel comportamento grooming. Mentre le indagini di cura sono diventate più estese, i protocolli hanno incorporato tali pratiche come la decapitazione per aggiungere trattamenti farmacologici sui nervi connettivi del collo 10 , stimolazione tattile delle setole per ottenere la risposta di grooming 2 ,E la registrazione video del comportamento 15 . L'osservazione diretta del grooming può essere facilmente studiata utilizzando l'osservazione visiva e registrando manualmente la frequenza e la durata di eventi specifici di grooming 4 .
Abbiamo progettato una camera da 15 grosse dimensioni che può essere costruita con una stampante 3D o una taglierina laser e i disegni dei modelli sono disponibili per la riproduzione 15 . Il disegno utilizza due piastre centrali unite con aperture abbinate e separate da maglie e due piastre superiore e inferiore di scorrimento aggiuntive, da cui sono caricate rispettivamente mosche e / o tinture. Dopo aver lasciato alle spalle le mosche spolverate, lo depositi in etanolo per solubilizzare il colorante e misurare l'assorbanza di questa soluzione alla lunghezza d'onda del colorante. Un lettore di piastre può essere utilizzato per campioni multipli paralleli o uno spettrofotometro a singolo lettura può essere utilizzato per campioni individuali. Questo metodo minimizza l'errore indotto dalla manipolazione e alI bassi per i test di cura da eseguire su una scala più economica ed economica. Questo metodo è derivato e modificato dai metodi precedenti da Julie Simpson e Andrew Seeds, che utilizzano camere di grooming più grandi con elementi di riscaldamento per manipolazioni di circuiti sensibili alle temperature 5 . Il seguente protocollo mostra la quantificazione della cura di tutto il corpo e mostra metodi alternativi per la quantificazione dell'accumulazione di coloranti sulle singole parti del corpo. Inoltre presentiamo i dati di confronto campione tra i mutanti WT e DopR , nonché i metodi per calcolare un indice di performance semplice per il comportamento di grooming.
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Protocol
1. Preparazione
- Preparare un aspiratore per spostare Drosophila vivo da un flaconcino di cultura alla camera di cura. Gli aspirazione consentono il trasferimento di animali coscienti alle camere comportamentali per assicurare che l'anestesia non pregiudichi l'osservazione comportamentale successiva.
- Usando le forbici tagliate 1,5 piedi di tubo TYGON ID ⅛ ", OD ¼". Cucito almeno 1 pollice fuori dalla punta di una punta da 1 ml di micropipetta usa e getta. Tenere un pezzo di maglia quadrata di 1 cm (apertura 0,196 pollici) sopra la punta tagliata.
NOTA: La maggior parte dei suggerimenti da 1 mL ha una linea di gradazione dove la punta si trova nella confezione, in genere tagliata a quella riga. - Posizionare rigidamente una punta di micropipetta da 1 ml fresca sopra la punta della maglia / taglio. Osservare che la maglia costituisce una barriera tra le due punte. L'interno della nuova punta crea una camera di tenuta per le mosche.
- Tagliare la punta estrema della nuova punta della micropipetta per allargare l'apertura abbastanza per consentire il passaggio di una singola mosca. L'oroE corrisponde approssimativamente all'apertura della camera di grooming (circa 1,5-2 mm di diametro).
- Inserire a fondo le punte nidificate alla fine del tubo di tygon. Spingere le punte nel tubo per assicurare una tenuta stretta per consentire la pressione del vuoto.
- Dall'altra estremità del tubo, tagliare la punta di una punta di micropipetta da 200 μL e montare l'estremità del taglio stretto nel tubo. Questo è il lato "bocca" dell'aspirapolvere.
- Usando le forbici tagliate 1,5 piedi di tubo TYGON ID ⅛ ", OD ¼". Cucito almeno 1 pollice fuori dalla punta di una punta da 1 ml di micropipetta usa e getta. Tenere un pezzo di maglia quadrata di 1 cm (apertura 0,196 pollici) sopra la punta tagliata.
- Preparare i tubi di aliquota della polvere. Pesa circa 5 mg di colorante giallo brillante su carta pesata tarata. Versare la polvere in un tubo da microcentrifuga da 0,6 ml e chiudere bene il tappo.
NOTA: Consigliamo l'uso di guanti di nitrile durante la preparazione di aliquote, poiché alcuni guanti in lattice sono permeabili al colorante. - Ripetere la fase 1.2) per tutti i campioni nell'esperimento (uno per ogni mosca in ciascuna camera).
- Preparare tubi di etanolo (EtOH): Pipettare 1 mL di 100% EtOH in 1,5 mL di microcentrifuga. Tubetti di etichetta per genotipi o condizioni/ Li>
- Ripetere il passo 1.4) per tutti i campioni nell'esperimento (uno per ogni mosca in ogni camera). Coprire e salvare i tubi EtOH per completare il test di cura. Includere anche almeno un campione "vuoto" che sarà solo 1 mL di EtOH senza una mosca per controlli negativi.
- Assemblare ogni camera di manipolazione avvitando la piastra superiore scorrevole (con i fori più piccoli) ma lasciando la piastra inferiore (con i fori più grandi) rimossi per l'aggiunta della polvere.
- Posizionare ogni camera di grooming necessaria su un tavolo con il lato superiore rivolto verso il basso. Il lato di ingresso della mosca è rivolto verso il basso.
- Caricare 5 ml di aliquota brillante di tintura gialla in ciascuna camera toccando il tubo contro la superficie della camera sopra il pozzo desiderato. Toccare la camera contro il tavolo per assicurare che tutta la polvere cada attraverso la maglia alla piastra superiore.
- Avvitare la piastra inferiore su ciascuna camera in modo che le estremità più ampie delle aperture coniche si rivolgano verso l'esterno ei fori non si riposino sui pozzetti. Protegga il botTom piastra in modo che non scivoli e rilasci la tintura.
- Spostare la camera sopra e batterlo piatta su un tavolo poche volte in modo che la polvere cada attraverso la maglia per riposare sulla piastra inferiore.
- Far scorrere la piastra superiore della camera nella "posizione aperta" in modo che i piccoli fori si allineino con i quindici pozzetti, consentendo l'introduzione di mosche in singoli pozzetti.
2. Spruzzando le mosche e coltivando
- Caricare una mosca nell'aspirazione della bocca aspirando delicatamente attraverso un'estremità dell'aspirazione come se si utilizza una paglia. Depositate le mosche colando leggermente e dirigendo l'apertura verso l'obiettivo.
- Aspirare una mosca in ogni pozzo utilizzato per l'esperimento. Dopo aver caricato un pozzo, far scorrere la piastra superiore in modo che la mosca sia intrappolata nella camera e posizionare il nastro sopra l'apertura del pozzo durante il caricamento di tutta la camera per evitare che la mosca sfugga durante il caricamento di altri pozzetti. Se più mosche vengono aspirate in un singoloBene, lasci l'apertura scoperta fino a quando rimane solo una mosca.
- Dopo che tutti i pozzi necessari sono pieni di mosche, flip la camera in modo tale che la piastra inferiore sia in alto in modo che la polvere abbia il potenziale per ricoprire le mosche cadendo attraverso la maglia.
- Serrare bene le piastre superiore e inferiore serrando le viti e vorticola la camera per spolverare le mosche per 4 s.
- Bussare la camera (piastra superiore rivolta verso l'alto) contro un tavolo due volte in modo che la tintura cada dall'altra parte. Quindi, ruotare la camera sopra (piastra superiore rivolta verso l'alto) e bussare due volte la camera per assicurare che il colorante si deposita sul pavimento della camera inferiore dalla mosca tenuta nella camera superiore.
- Per le mosche di controllo che non sono autorizzate a sposo, procedere immediatamente al punto 3 del protocollo. Per le mosche che completeranno il test, procedere al punto 2.7.
- Riposare la camera da letto su un tavolo o il piano di lavoro con la piastra superiore verso l'alto per trenta minuti per permettere alle mosche di sposo. Mettere la cameraIn un ambiente di rumore e senza vibrazioni per mantenere costante l'ambiente per tutti gli esperimenti di cura (livelli di illuminazione, umidità e temperatura). Un incubatore a tavoletta a RT oa 25 ° C con controlli di umidità è l'ideale.
3. Preparazione dei campioni e analisi di assorbanza
- Tenendo il livello della camera con il piatto superiore verso l'alto, svitate delicatamente la piastra inferiore e rimuovila dalla camera, facendo attenzione a non perdere la tintura.
- Posizionare la camera su un cuscinetto Fly CO 2 con flusso d'aria basso fino a quando le mosche sono anestetizzate.
- Svitare la piastra superiore dalla camera. Utilizzare attentamente le pinze per afferrare una gamba e spostare una mosca spolverata da ogni camera e depositarla in un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga contenente EtOH. Il tempo di trasferimento per 15 camere ciascuna contenente una mosca è di circa 3-5 minuti. I esperimenti dovrebbero fatturare i tempi di trasferimento se / quando esperimenti sconcertanti con più camere per assicurare una gestione efficiente degli esperimenti. Una volta che ogni tubo di microcentrifuga contiene una mosca, chiudere il tappo e invertire il tubo tre volte per agitare e mescolare la soluzione di colorante e etanolo.
- Incubare i tubi contenenti etanolo e volare per 5 ore a RT per garantire la completa rimozione del colorante dal fly in soluzione. Dopo i 5 h, brevemente vortexare ogni tubo (2 s) per garantire la distanza del colorante dalle mosche.
- Aliquota 50 μL del tubo sperimentale da 1,5 ml in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, se disponibile, prendendo atto della posizione di ciascun campione sulla piastra. Aggiungere 200 μL di EtOH per diluire il campione 5x. La diluizione evita gli effetti di soffitto di mosche pesanti o grossi difetti di grooming.
- Utilizzare un lettore di piastre per analizzare ogni campione a 397 nm. In alternativa, misurare l'assorbanza per i singoli campioni e gli spazi su uno spettrofotometro standard nello spettro visibile se non è disponibile un lettore di piastre.
- Leggere e registrare il campione tramite il lettore di piastre e salvare il foglio di calcolo con il recordD sulla piastra.
4. Quantificazione dei risultati
- Compilare i risultati per tutti i campioni e misurare la varianza per ogni genotipo o condizione.
NOTA: L'accumulo di tintura a 0 min e in tempo 30 min viene considerato come condizione separata utilizzando analisi statistiche mediante correzione ANOVA e Bonferroni a senso unico e altre correzioni per più confronti paralleli. - Calcola la differenza percentuale di grooming per ciascun genotipo / condizione usando la seguente equazione: [(valore medio di accumulo di tintura al tempo 0 '- valore medio di accumulo di tintura al tempo 30') / valore medio di accumulo di tintura al tempo 0] x 100.
- Esprimere la percentuale per ogni genotipo e condizione nelle barre e confrontare tra genotipi e condizioni.
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Representative Results
Il dosaggio di cure rende dati quantitativi per valutare le prestazioni comportamentali basate sul residuo relativo della colorante accumulata lasciata sui corpi delle mosche dopo un tempo di misura impostato per la cura (30 min). Le figure di esempio del disegno della camera di scorrimento scorrevole e delle fasi principali del dosaggio sono evidenziate in figura 1 . Le mosche aggregano una quantità significativa di tintura dalla polverizzazione immediata vortexing in presenza di colorante ( Figura 2d, 2e ). Le mosche polverose possono mantenere una gamma di post-assay di accumulo di coloranti ( Figura 2f, 2g ). Quindi, solubilizzando l'accumulo di coloranti in EtOH e misurando l'assorbanza di singoli campioni, si ottiene una valutazione riproducibile e altamente quantitativa della capacità di cura.
In questo studio di DopR nella regolazione del tratto posteriore, abbiamo confrontato le prestazioni del grooming di un forte hypomorph (
Per indagare sulle differenzeTra le forme di cura dei piedi e dei piedi, abbiamo valutato direttamente l'accumulo di coloranti sulle parti del corpo smontabile durante la cura ( Figura 4 ). Sutando le teste, le ali, o il "corpo" (addome / torace / gambe) delle singole mosche post-analisi, siamo stati in grado di stabilire in modo affidabile le differenze e le somiglianze tra i genotipi. I risultati hanno sostenuto un'interpretazione che non esistevano differenze per i programmi di cura del foreleg, in quanto non sono state osservate differenze significative per le teste di WT Vs. Mutanti DopR. Tuttavia, sono state osservate differenze significative per le misurazioni sia tra ala e corpo tra i genotipi. Questa tecnica supplementare per eseguire il saggio primario sulle parti del corpo anziché le mosche intere consente un metodo semplice per distinguere inizialmente i programmi foreleg contro il pasticcio. Questi risultati furono ulteriormente estesi e sostenuti da osservazioni comportamentali attenti e registrazione video o tracciamento di singoli componenti del foreleg o hComportamenti indefiniti. Tutti i risultati delle figure 2-4 sono riprodotti con l'autorizzazione da Geni, Brain e Comportamento 15 .
Figura 1: Flusso di lavoro di dosaggio di Drosophila Grooming. Questo diagramma di flessibilità semplificato delinea i principali passi del protocollo di cura, evidenziando alcuni dei materiali e delle attrezzature necessarie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione di Grooming basata sull'accumulazione di coloranti. (A) camera di governare. Le mosche individuali e la colorazione gialla brillante sono collocate in singoli pozzetti (1 mosca: 1 pozzo). DimensioniE schemi di produzione in dati supplementari. ( B, d, f ) maschio adulto maschile Wrosophila (+ / +). ( C, e, g ) DopR f02676 / DopR f02676 maschio adulto Drosophila. ( B, c ) Vola prima di spolverare. ( D, e ) Vola immediatamente dopo aver spolverato dalla camera di vortice, prima del grooming (tempo: 0 min). ( F, g ) Vola dopo il grooming (tempo: 30 min). Barra di scala = 400 μm. Ristampato con l'autorizzazione da parte dei geni, del cervello e del comportamento 15 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ricettore Dopamina ( DopR / dDA1 / dumb ) è richiesto per la modulazione del comportamento di grooming. (A , c, e ) GroominG di wildtype (blu) e mosche mutanti (rosso / arancione) misurate a 0 min o 30 min dopo la polvere. SEM è misurato per ogni genotipo e condizione. (A , b ) n = 43 vola per genotipo e condizione. (A) WT e DopR f02676 aria sia mostre grooming comportamento (+ / + 30' rispetto al + / + 0' = valore di p <0,0001, DopR f02676 30' rispetto al DopR f02676 0' = valore di p <0,0001). Le mosche DopR non sopravvivono né gli animali WT ( DopR f02676 30 'rispetto a + / + 30' = p valore <0.001). La polvere acuta di ogni genotipo a 0 'provoca l'accumulo equivalente di polvere (ns = non significativo). ( B, d, f ) La differenza percentuale di grooming è calcolata per ciascun genotipo (colorante accumato a 0 '- colorante accumulato a 30' / colorante accum. 0 'x 100) fornendo un valore relativo per confrontare i comportamenti di cura. C ) DopR attp / DopR
G4.jpg "/>
Figura 4: Funzione del recettore del dopamina Potenziare il passaggio del cuscinetto. (A) Toilette di singole regioni di WT (blu) e DopR f02676 / DopR f02676 (rosso) misurata a 30 minuti dopo spolverare e successiva dissezione. Valore p per l'aletta di ali = 0.0204. Valore p per corpo = 0.0302. N = 33-35 vola per tutte le condizioni. SEM è misurato per ogni genotipo e condizione. Analisi statistica di One Way ANOVA e Bonferonni Correction. Ristampato con l'autorizzazione da parte dei geni, del cervello e del comportamento 15 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare: Metodo alternativo per la quantificazione visiva del comportamento di grooming usando il software NIH Image J Pixel Intensity. ( A ) Visualizzazione del wilDtype Drosophila sotto campo di dissezione. Ovale definisce l'addome dorsale come regione di analisi per l'intensità dei pixel. ( B ) Visualizzazione dell'addome dorsale dopo la polvere con pigmento Fluorescente Ultra Green V10. Il filtro standard per la fluorescenza verde cattura il pigmento blu-verde. ( C ) WT animale dopo il rivestimento con pigmento UGV10 (pregrooming). ( E ) WT animale dopo il rivestimento con pigmento UGV10 (postgrooming). ( D ) DopRf02676 mutante omozigote dopo il rivestimento con pigmento UGV10 (pregrooming). ( F ) DopRf02676 mutante omozigote dopo il rivestimento con pigmento UGV10 (post-grooming). ( G ) Quantificazione dell'intensità del pixel per tutte le condizioni. N = 15 mosche per ogni genotipo o condizione. Analisi statistiche da One Way ANOVA e Bonferonni Correction. Ns = differenza nonsignificante. *** rappresenta p <0,001. PlFacilità clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il test di cura è relativamente semplice, ma avremmo cautela i sperimentatori a prestare particolare attenzione ai seguenti problemi. Il mantenimento di una guarnizione a tenuta stretta delle viti sulle piastre superiore e inferiore dopo l'introduzione di mosche e tinture è essenziale per i risultati riproducibili. Il colorante giallo brillante è molto fine e le giunture sciolte consentiranno perdite di tintura dai bordi della camera. L'irregolarità del contenuto di tinture per ciascun pozzetto potrebbe facilmente scagliare la quantificazione da parte dei governatori come una spolverazione non uniforme aumenterà la varianza e le tasse false per gli eventi di cura. Inoltre incoraggiamo i sperimentatori ad essere consapevoli dell'ambiente in cui scelgono di tenere la camera di cura durante il periodo di cura di 30 minuti. La costanza ambientale per la temperatura, l'illuminazione, l'ora del giorno e l'umidità sono essenziali per una performance coerente per i comportamenti di comportamento Drosophila . Tenendo le camere di cura all'interno di un piccolo incubatore per minimizzare la distrazioneR ambienti di laboratorio variabile è ideale per la massima riproducibilità dei risultati, ma anche altre disposizioni spaziali possono avere successo.
Per quanto riguarda le misure di accumulo di tinture, abbiamo osservato che il colorante è permeabile ai guanti di lattice, per cui i guanti di nitrile sono preferibili per la manipolazione e la pesatura della polvere. Fare attenzione a non diffondere ampiamente la polvere attraverso le superfici del laboratorio, in quanto facilmente macchia gli indumenti e potenzialmente contaminano superfici o attrezzature. L'isolamento di un'area e di un fly-station / pad CO 2 per esperimenti è preferibile per contenere l'esposizione al colorante. Incoraggiamo anche i sperimentatori ad essere sicuri di utilizzare piatti a 96 pozzetti UV trasparenti. Il picco di assorbanza da 397 nm per la colorazione gialla brillante è vicino allo spettro UV e le piastre standard a 96 pozzetti possono dare misure deboli o imprecise per le diluizioni di tinture. Il colorante è anche solubile in acqua in alternativa all'ETOH. Tuttavia, Drosophila non si affonda prontamente in acqua senza vortex e piccole bolle d'aria aloIl corpo degli animali tinti mostra una consistenza e una solubilità più basse del colorante. L'etanolo mostra risultati sempre migliori e una varianza inferiore in confronto diretto.
Il nostro dosaggio può essere facilmente modificato per tecniche supplementari e studi più raffinati, come la dissezione del post-assay del corpo volante ( Figura 4 ). Tali integratori possono essere necessari per comprendere quali passi di cura sono interessati, in quanto l'accumulo di tinture si riferisce solo in larga misura a movimenti comportamentali senza affrontare direttamente la causa biologica o neurale fondamentale. Una volta che le differenze sono osservate, esperimenti paralleli utilizzando la registrazione video o metodi di osservazione diretta sono essenziali per comprendere la radice comportamentale di tutte le differenze nell'efficienza di cura. Ciò può essere indagato ulteriormente dalla quantificazione visiva dell'accumulo di particelle di polvere su parti del corpo specifiche utilizzando misure di intensità di pixel attraverso il programma software NIH ImageJ, insieme a un monitoraggio diretto di foreleg e hindlegComportamenti scorporando filmati video. Per quanto riguarda i metodi alternativi per la quantificazione visiva della polvere fluorescente, i primi esperimenti del laboratorio hanno utilizzato un pigmento fluorescente di vernice derivato da ossigeno Europium di silicato-alluminato metallico a base di metalli rari. Dopo aver spolverato le mosche con il pigmento fluorescente della vernice e anestetizzando o decapitando gli animali dopo il grooming, i corpi possono essere registrati e analizzati mediante microscopia digitale utilizzando un filtro fluorescente standard per GFP su un campo di dissezione ( Dati Aggiuntivi ). Mentre questo metodo consente una quantificazione accurata dell'intensità di pixel che parallela ai risultati osservati con il colorante giallo brillante, abbiamo scoperto che il passaggio di questo metodo è relativamente lento e le particelle di pigmento variano leggermente in dimensioni e sono meno uniformi rispetto al rivestimento osservato per Brilliant Tintura gialla. Tuttavia per alcune applicazioni sperimentali questo metodo alternativo è appropriato e c'è una notevole varietà di fluo disponibileRientrano colori che potrebbero essere utili per applicazioni di drosophila e nondrosofila o sperimentazioni iterative di polverizzazione dove la quantificazione di eventi separati è essenziale. Va notato che il pigmento della vernice stessa è solubile in acqua ma perde rapidamente la sua fluorescenza in acqua, gravemente handicapping l'utilità di questo pigmento per misure standard di assorbanza.
Questi tipi di metodi che mirano ad eventi specifici per l'allenamento o per il passaggio posteriore sono essenziali per comprendere la natura precisa di un fenotipo e possono evidenziare i potenziali circuiti neurali oi programmi locomotori per indagare ulteriormente. Inoltre, per esperimenti di controllo paralleli, è indispensabile escludere potenziali motivi comportamentali non specifici che potrebbero essere influenzati dai trattamenti. Se gli animali presentano ampie deficienze motorie o anomalie, è possibile che i deficit di somministrazione siano secondari ai fenotipi di ampio locomotore. Semplice monitoraggio video degli animali WT rispetto al mutante o al cirLe condizioni manipolate possono facilmente discriminare tra grandi turni di velocità o di distanza totale percorsi, indipendenti dai deficit di cura.
Il test di cura è un metodo versatile adatto sia per studi su piccola e su larga scala di questo complesso programma locomotore multistep; I disegni sono facilmente modificabili per aumentare la dimensione della camera o il numero 15 . Il metodo fornisce dati quantitativi robusti che sono ideali per la valutazione comparativa delle abilità di cura delle mosche. La produzione delle camere è economicamente conveniente e può essere realizzata utilizzando molteplici macchine (stampanti 3D, taglierini laser, mulini CNC) a seconda delle risorse disponibili. La tecnica consente il passaggio intermedio di singoli campioni che possono essere facilmente estesi per schermate genetiche e studi di mappatura funzionale.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon e Rose Hedreen per iniziare a sperimentare e stabilire questa metodologia e progetti di camera. Ringraziamo Kelly Tellez e Graham Buchan per la lettura e la modifica del manoscritto. Ringraziamo Andrew Seeds e Julie Simpson per il loro lavoro pionieristico e il loro consiglio e supporto per suggerire l'uso di Brilliant Yellow Dye (Sigma). Questo lavoro è sostenuto in parte da Mary E. Groff Chirurgia e Ricerca Medica e Educazione Charitable Trust, il Bronfman Science Center, e Hellman Fellows Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1 mL and 200 μL) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96-well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8 - 32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8 - 32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8 - 32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
References
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- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
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