Summary
여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.
Abstract
Cryopreserved 돌핀 정 충의 사용 수 중 공원 사이 유전 물질의 교환을 용이 하 게 하 고 정 충은 해양 포유 동물 복제에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 연구 실험실에 액세스할 수 있습니다. 분리 IVF, 동종 IVF에 대 한 대체 잠재적인; 정자 비 옥을 테스트 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 연구 생식 체 생리학 및 초기 배아 발달; 그리고 얻기 어려운 귀중 한 돌고래 oocytes의 사용을 피하기 위해. 여기, 우리는 성공적으로 수집 하 고 돌고래 정 충 cryopreserve 사용 된 프로토콜을 제시. 정액의 컬렉션은 훈련 된 돌고래에 수동 자극에 의해 수행 됩니다. Cryopreservation은 글리세롤과 트리 스 달걀 노른자위 기반 extender를 사용 하 여 수행 됩니다. 또한, 우리는 분리 IVF 돌고래 정 충와 소 oocytes를 사용 하 여 설명 하 고는 PCR를 사용 하 여 결과 배아의 하이브리드 성격을 확인 하는 프로토콜을 제시. 분리 수정 수정에 대 한 질문을 제기 하 고 생식 체 생리학과 초기 배아 발달을 공부 하는 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, 분리 IVF의 성공 테스트 돌고래 정자 비 옥 하 게 용량을 추가 검사의 가치가이 기술의 잠재력을 보여 줍니다.
Introduction
보조 생식 기술 해양 포유류를 포함 하 여 야생 동물에 가난 하 게 개발 된다. 정자 기름 성공 평가에 중요 한 방법의 부족 느린 돌고래 종에서 생식 기술 개발에 기여 한다. 그것은 아니었다 최근까지 bottlenose 돌고래 (Tursiops truncatus)의 기본 정액 매개 변수 보고1,2했다. 그러나, 운동 성 및 형태학, 같은 변수 널리 사용 되 고 있지만 생식 효율성에 제한 된 정보 제공. 정자 품질 최고의 지표는 기름 잠재력의 평가.
최근, 우리의 그룹 돌고래 정자 남성 pronuclear 형성 및 zona 그대로 소 oocytes3를 사용 하 여 분리 IVF 후 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 잠재적인 비 옥 평가 메서드를 사용 합니다. 돌고래 소 분리 IVF 사용 하 여 중요 한 이점이 동종 IVF, 돌고래 oocytes를 얻기의 어려움 극복으로 있으며 소 oocyte 성숙 시스템 잘 테스트 체 외에서 사용을 용이 하 게. 종 특이성을 피하려면 분리 수정 ZP의 부재에서 일반적으로 수행 됩니다. Vitelline 막으로 융합 acrosome 반응 정 충의 능력의 평가 대 한 수 있습니다, 하지만 그것은 수정에 관련 된 다른 기능 평가 손상 한다. 설명 하는 절차 zona 그대로 oocytes를 사용 하 고 다음 매개 변수 평가: 정자 zona 바인딩 및 첨부 파일, 침투, polyspermy, pronuclear 형성 및 하이브리드 배아 분열.
여기, 우리가 현재 정자 컬렉션, 기본 정자 분석, 정 충 동결 뿐만 아니라 돌고래 정자 기능 평가 대 한 여러 가지 프로토콜 heterologous 체 외 수정 후 남성 pronuclear 및 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 zona 그대로 사용 하 여 소 oocytes입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
윤리 성명: 실험 절차를 모두 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 Instituto Nacional de Investigación y 기술과 Agraria y 섬유 (INIA)의 위원회에 의해 승인 했다. 복제의 연구, 그리고 해양 포유 동물의 배려를 위한 동물 복지 행위는 사회에 의해 채택 모든 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 되었습니다.
1. 돌고래 정자 수집과 Cryopreservation
- 준비
- 게 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-무료). 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6-mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린 (pH 7.4) 보완 준비.
참고: 사용 당일이 매체를 준비 하 고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에 5% CO 2 분위기 아래 38.5 ° C에서 보관. - 준비 TRIS 계란 노 른 자 기반 버퍼입니다. 30.28 g/L 트리 스, 16.75 g/L 구 연산과 당 12.5 g/L, 그리고 초순에 0.5 g/L 스 분해 (pH 7.3, osmolality = 310 mOsm/kg). 추가 20% 계란 노 른 자 (v/v).
- 게 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-무료). 페르 TALP 매체와 25mm 중 탄산염, 22 m m 나트륨 젖 산 염, 1 mM 나트륨 pyruvate, 6-mg/mL 지방산 무료 BSA, 10 mg/mL 헤 파 린 (pH 7.4) 보완 준비.
- 등 recumbence 자발적인 정액 컬렉션에 대 한 수영장의 가장자리 근처에 거짓말을 입증 된 번 식 남성 bottlenose 돌고래 훈련.
참고: 남성 돌고래 훈련 되어야 6 개월 이상 긍정적인 보강 하 여 앞에서 설명한 4. - 부드럽게 성 기 groove에서 남근의 자발적인 압출을 유도 하는 돌고래의 생식 기 홈의 두개골 영역에 누르면 다양 한 촉각 stimulations 수행.
- 완전 한 발기를 달성 한 후 직접 음 경 끝에 정액을 무 균 용기에.
- 분석까지 37 ° C에서 정자 샘플을 유지합니다. 1.3 및 1.4 단계를 반복 하 여 때마다 새로운 프로필 렌 유리를 사용 하 여 연속 사정 컬렉션.
- 즉시 수령 후, 37 ° C. 평가 색, pH, 그리고 osmolarity (를 사용 하 여 마이크로-osmometer)는 정액의 이전 예 열 졸업된 유리 실린더를 사용 하 여 볼륨을 결정.
- 정액, 정 충의 농도 평가 하는 증류수 90 µ L를 포함 eppendorf 관에 정자 서 스 펜 션의 10 µ L를 추가 합니다. 챔버를 계산 하는 정자를 사용 하 여 정자 농도 결정.
참고: 평가, 동안 유지는 정액의 나머지 37 ° c. - 운동 매개 변수 평가.
- 정자 샘플의 10 µ L을 미리 데워 진된 정자 챔버에 배치.
- 이전 bottlenose 돌고래에 대 한 유효성을 검사 하는 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 사용 하 여 정자의 운동 성 2를 객관적으로 평가 하는 운동 성 평가.
참고: 필요한 경우, 정자의 운동 성의 적절 한 시각화를 위한 페르 매체 (헤 파 린 및 hypotaurine-프리)와 정자 샘플을 희석. 평가, 중 온수 현미경 무대에서 37 ° C에서 샘플 유지.
- 정자 샘플의 20 µ L 고 평가 하는 앞서 설명한 5 생존 능력 및 정자 형태.
- 원심 분리기 튜브에 정자 샘플을 전송. 5 분 동안 250 x g에서 정자 샘플 원심 후 세 챔버를 사용 하 여 정자 농도 결정, 400 x 10 6 정 충/mL을 정자 농도 조정.
참고: 필요한 경우 원심 분리 (250 x g, 10 분)에 의해 같은 정액의 초과 볼륨에서 고립 된 정액 플라스마와 집중된 ejaculates에서 펠 릿을 희석.- 5 분 동안 천천히 희석 정액 샘플 1:1 (v/v) 1.5% 글리세롤을 포함 하는 트리 스 계란 노 른 자 기반 버퍼. 1 h 30 분 5 ° C에서 정자 현 탁 액을 포함 하는 튜브를 놓고
- 수행은 트리 스와 정자의 서 스 펜 션의 두 번째 희석 달걀 노 른 자 기반 버퍼 3% 최종 글리세롤 농도 및 200 x 10 6 정자/mL의 최종 농도 글리세롤을 포함. 10 분 5 ° C에서 정자 현 탁 액을 유지
- 0.25 mL 빨 대에 정자 현 탁 액을 로드. 빨 대 heat-seal 랙 10 분에 대 한 액체 질소 위에서 4.5 cm에에서 빨 대 액체 질소에 빨 대를 빠지게 하 고 평가까지 저장.
2. Heterologous 체 외에서 수정 사용 하 여 구역 그대로 소 Oocytes
- 준비
- 준비는 얼룩이 솔루션 및 장착 매체.
- Hoechst의 1 밀리 그램의 1 mL의 증류수에 용 해 하 여 준비 Hoechst 재고 솔루션
- . 30 µ L aliquots를 확인 하 고 계속 그들은 어둠 속에서-20 ° C에서 사용까지. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 1 g/L PVA와 보충의 5 mL에 Hoechst 재고 솔루션의 25 µ L을 추가 하 여 얼룩 솔루션을 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 유지.
- 준비 글리세롤의 6.25 mL와 Hoechst 재고 솔루션의 6.25 µ L의 PBS 6.25 mL를 혼합 하 여 설치 미디어. 잘 혼합 하 고 사용까지 4 ° C에서 어둠 속에서 유지.
- Oocyte 수집 및 체 외에서 수정에 대 한 매체 준비.
- 0.9 %NaCl 증 류 물에 gentamycin의 0.5 mL를 추가 하 여 생리 식 염 수를 준비.
- 는 TCM-199의 10 ml 10 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF) 및 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS)를 추가 하 여 재고 성숙 매체를 준비 합니다. 38.5 ° c, 5% CO 2, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기 분위기에서 두 미디어 유지.
참고: 여기, 3 우물 – 분리 IVF 동종 IVF, 적합 한 제어, 잘만 포함 한 잘 성숙 parthenogenetic 컨트롤로 COCs – 사용 되었다.
- . 5% CO 2, 그리고 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 최대 습도 공기에서 분위기 아래 38.5 ° C에서 유지.
참고: 동종 IVF에 대 한 소 정액 동종 소 IVF에 대 한 표준 프로토콜을 따라 병렬로 처리 해야 합니다.
- 적극적으로 좁은 구멍 파스퇴르 피 펫을 통해 oocytes의 10 배를 pipetting으로 느슨하게 연결 된 정 충을 제거.
- 15 분 동안 Hoechst 얼룩 솔루션의 50 µ L에 oocytes 50 µ L 30 분 5 분에 대 한 PBS에 oocytes 전송 세척에 대 한 0.5%도에서 20 oocytes를 해결 하 고 5 분에 대 한 PBS에 oocytes를 세척
- 는 슬라이드 당 10 oocytes의 속도로 설치 매체의 2 µ L 방울을 개별적으로 oocytes를 전송. 부드럽게는 coverslip로 커버 하 고 매니큐어와 함께 인감.
- Epifluorescent 광학과 40 x 확대 361 nm 여기 필터 단계 대조 현미경을 사용 하 여 소 oocytes에 연결 하는 정 충의 수를 계산 하.
- 전송 10 추정 zygotes 튜브 포함 2 mL PBS와 2 분 동안 부드럽게 소용돌이 적 운 세포를 제거 하. 워시 두 번 PBS, 수정, 및 얼룩, 앞에서 설명한 (단계 2.23.2.)
- Hoechst와 얼룩에 의해 pronuclear 형성 및 polyspermy 모두 동종 및 분리 IVF 그룹에서 단계-대비/epifluorescent 현미경 평가.
- 샘플 당 10 무작위로 선택한 추정 하이브리드 zygotes pronuclear 형성 평가. 공초점 레이저 현미경 488 nm 아르곤 레이저 여기에서 검색과 515에서 530 nm 탐지에서 pronuclear 형성 확인.
- 광학 추정 zygotes 순차적으로 섹션 (2mm) 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 하 고. 3D 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 시각화.
- 공동 보육의 24 h 후 씻고 50 추정 zygotes 4 회 PBS에 문화 매체에 두 번.
3. PCR
- 재료 및 시 약
참고: PCR 프로토콜을 수행 하는 데 사용 하는 장비, 재료, 시 약 재료의 테이블에 자세히 나와 있습니다 및 PCR 튜브 랙 및 micropipettes (P2, P20, P200, P1000) 집합이 포함 1.5 mL microcentrifuge 튜브, PCR 튜브 및 cap, 열 cycler는 자외선 조명 기, agarose 젤, 고 버퍼 (Tris Borate EDTA (TBE)).- 부드럽게 녹여 얼음에 모든 시 약. 실험을 통해 얼음에 그들을 유지 합니다. Deoxynucleotides를 사용 하 여 (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP), 돌고래 18 S ribosomal 단백질 (DQ404537.1);에 대 한 참조 유전자 코딩에 뇌관을 대상 R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG 및 f 2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA 중 합 효소, DNA 중 합 효소, DNA 템플릿, 메 마른 물 및 염화 마그네슘 (MgCl 2 5.0 m m의 최종 농도에) 5 X 버퍼.
- Agarose 젤과 샘플 준비입니다.
- 준비 돌고래와 소 정자 DNA 샘플.
- Thaw 37 ° C에서 물 욕조에 각 종족의 언된 빨 대 50 미 세척 솔루션 3 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 250 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 제거 합니다. 30 µ L의 STES 세포의 용 해 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 8; 20 m m NaCl; 그리고 1 mM 0.1 %SDS), 추가 2 µ L의 성분 K (20 mg/mL), 및 dithiothreitol (DTT);의 5 µ L 최종 농도: 150 mM. 초순의 55 ° C. 추가 200 µ L에서 하룻밤 유지 합니다. 5 분에 대 한 250 x g에서 원심 분리기는 상쾌한을 유지. 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 측정.
- 초순 PCR 조건 수 확인으로 돌고래 정 충 (즉, 40, 4, 및 0.4 ng/mL)에서 DNA의 직렬 희석을 수행 적은 양의 돌고래 DNA 검출.
- 초순 PCR 조건 소 DNA의 작은 금액을 감지 할 수 있다 확인 하와 소 정자 DNA (즉, 4000, 400, 40, 및 4 ng/mL)의 직렬 희석 수행.
- 는 돌고래와 소 배아를 준비합니다. 배아를 얼음에 녹여 100 µ g/mL 가수분해 K의 8 µ L을 추가 하 고 밤새 55 ° c.에 유지 반응을 중지 하려면 96 ° c 5 분에 대 한 샘플 배치
- 2 %agarose 젤 TBE 버퍼를 준비 하 고 추가 하는 표준 기술을 사용 하 여 핵 산 얼룩의 20 µ L.
- 준비 돌고래와 소 정자 DNA 샘플.
- PCR 준비.
- 레이블 PCR tube(s): 돌고래 직렬 희석 (40, 4, 및 0.4 ng/mL), 소 직렬 희석 (4000, 400, 40, 및 4 ng/mL), 동종 소 냉동 배아, 2 셀 추정 heterologous 배아, 그리고 부정적인 제어.
- 반응 당 25 µ L의 최종 볼륨을 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 마스터 섞어를 준비합니다.
- 5 X DNA 중 합 효소 flexi 버퍼, (10mm) 1.5 dNTPs의 0.5 µ L의 추가 5 µ L
- µ L MgCl 2 (25 m m), 앞으로 역 뇌관 (10 µ M), DNA 템플렛 (정자)의 1.5 µ L 또는 DNA 템플렛 (냉동 배아)의 8 µ L의 0.5 µ L의 0.07 µ L Taq 중 합 효소, 및 살 균 증류수 25 µ L 최종 볼륨까지. 잘 믹스.
- 열 cycler에 튜브를 놓습니다. 다음 프로그램을 선택: 3 분;에 대 한 94 ° C 15 94 ° C의 40 주기 s, 59 ° C 25에 대 한 s, 20 72 ° C s; 그리고 프로그램 시작 5 분을 위한 72 ° C.
- 2 %agarose 젤의 우물에 혼합물의 4 ° C와 부하 15 µ L에서 각 PCR 제품에 버퍼를 로드의 4 ° C. 추가 2.5 µ L에서 튜브를 저장 합니다. DNA 사다리 마커를 사용 하 여 PCR 파편의 정확한 크기 추정.
- DNA 마이그레이션 수 있도록 15 분에 대 한 수행 법. 밴드는 자외선 조명 기를 사용 하 여 시각.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
모든 결과, 표 및 그림 (1 및 2) 여기에 제시 된 권한3으로 재현 했다.
돌핀 정 충 중지 및 재개 후 높은 운동 성을
냉동-해 동 돌고래 ejaculates 84.5 ± 5.3 총 운동 및 69.1 ± 5.1 진보적인 운동 정 충의 백분율 (% ± SD) 보여주었다. 운동 성 측면에서이 숫자는 높은-품질 cryopreserved 정 충의 대표.
돌핀 정 충 관통 zona 그대로 소 oocytes 그리고 생산 하이브리드 배아의 할 수 있다
그림 1A 와 표 1 돌고래 공동 보육의 2.5 h 후 소 ZP에 연결 된 정 충을 보여줍니다. 돌핀 정 충 소 정 충 (그림 1B 및 표 1) 보다 높은 비율에 붙어 있었다. 실제로, 형광 현미경 검사 법 돌고래 정 충 zona 그대로 소 정 충 (그림 1C), pronuclear 형성 및 분열 (1E 그림 및 표 1) 침투 수 있습니다 보여줍니다. 이 confocal 현미경 검사 법 (그림 1D 및 그림 1 층)에 의해 확인 되었다. 아니 polyspermy 공동 보육 (표 1)의 12 h 후 분리 IVF 그룹에서 oocytes에서 관찰 되었다. 분리 IVF에서 pronuclear 형성 24 h에서 높은 비율 18 h의 공동 화 (표 1)에서 발생 한 동종 그룹 보다 장시간에 도달. 부 화 후 48 h에 분열 속도 분리 동종 IVF (표 1) 보다 낮은 했다. 8.0%의 자발적인 parthenogenetic 활성화 속도에서 48 h (표 1) 소 성숙된 unfertilized oocytes에서 관찰 되었다.
PCR 결과 ribosomal 18 S 인코딩하는 돌고래 참조 유전자의 존재를 평가 하 여 하이브리드 배아 (그림 3)에서 돌고래 유전 물질의 존재를 확인 하는 마지막으로, 단백질 (그림 2).
그림 1: 소 zona pellucida (ZP)에 연결 된 돌고래 정 충. 연결 된 돌고래 (A) 하 고 구역 그대로 소 oocytes 가진 공동 외피의 2.5 h 후 소 (B) 정 충. Gametes는 Hoechst 물 그리고 단계 대조 현미경 (40 X 확대) 시각. 소 oocyte (C 와 D)와 소 oocyte 세포질 (E)에서 decondensing 돌고래 정자 머리의 periviteline 공간에서 돌고래 정 충. 이미지 되었다 confocal 현미경 캡처하고 추정 접합 자 (Hoechst 얼룩; 40 배 확대)의 적도 면에 해당 합니다. 2 개의 pronuclei (F)의 분리 IVF zona 그대로 소 oocytes (Hoechst 얼룩; 40 X 확대;와 돌고래 정 충의 공동 보육의 구성 된 24 h 후 위상 대비 현미경 관찰 눈금 막대 = 25 µ m). 그림 참조3 동의에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표적인 전기 이동 법 (2 %agarose 젤 ethidium 평범한 사람 얼룩이) 18 S 돌핀 유전자에 대 한 PCR 증폭 결과 보여주는. 레인 1 30 쇼 추정 돌고래/소 하이브리드 배아; s 1과 s 2 레인 기능 4 ng/mL 및 0.4 ng/mL 돌고래 정자 DNA, 각각; 그리고 레인 C1 C5 기능 2 셀 소 배아 및 H2O (물) (빈 제어). 화살표 나타냅니다 증폭된 18 S에 해당 하는 190-bp 밴드 rDNA. 그림 참조3 동의에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 하이브리드 배아의 대표 이미지. 인큐베이션 (Hoechst 얼룩; 40 배 확대)의 48 h 2 셀 하이브리드 배아 (A)의 대표 이미지. 부 화, 사단, stereomicroscope (B)에서 시각의 다른 단계에서의 48 h에는 흠 없는 하이브리드 배아 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 첨부 파일, polyspermy, pronuclear, 형성과 분열 소 oocytes와 소 또는 돌고래 정 충, 부 일치와 분리 공동 화를 각각 다음의 요금. 변수는 ANOVA (Kruskal-월리스와 맨-휘트니 테스트)으로 분석 되었다. 값 12 복제;의 평균 ± SEM (범위)로 표현 됩니다. n = oocytes 또는 추정 zygotes 검사의 총 수. 테이블 참조3 동의에서 재현 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
많은 다른 포유류 종에 대 한 동결-해 동 정자를 사용 하 여 다양 한 장점이 있다. 이 귀중 한 유전 물질, 전세계 유통에 대 한 가능성, 오염, 낮은 위험 그리고 수십 년 동안 남성 gametes를 보존 하는 기능을 전송 하는 기능을 포함 합니다. Cryopreserved의 사용이이 종 부록 II의 인용, 전송 및 다른 수 중 공원 사이 동물의 교류를 제한 하는 보호 때문에 bottlenose 돌고래에 대 한 필수적입니다. 돌고래 수송 물류 문제 및 위험 위험을 생성 하는 활동 이다. 그러나, 그들을 수송에서 자제 족 동물의 포로 인구를 도입의 위험 같은 결과 또한 있다. 하나의 솔루션은 정자의 cryopreservation입니다. 일부 저자 매우 돌고래 정자5,7,,89와 cryopreserved는 결과 격려. 또한, 2005 년, cryopreserved 정자를 사용 하 여 인공 수정으로 잉태 돌고래 송아지의 첫 탄생 보고10했다. 몇 년 후,이 이루어졌다 섹스 정렬 정 충11를 사용 하 여.
돌핀 정자는 되었습니다 cryopreserved 일반적인 방법에는 프로그래밍 가능한 냉장고5, 같은 정교한 방법에서 서로 다른 기술을 사용 하 여 드라이 아이스12 또는 액체 질소 증기2,9와 같은 13. 드라이 아이스 나 액체 질소 증기를 사용 하 여의 주요 장점은 가능성, 고도로 전문화 된 장비를 사용 하지 않고, 정자 추출은 동일한 위치에 cryopreserve. 정자 냉동 액체 질소 증기에 폴리스 티 렌에 빨 대에13, 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 방법입니다. 실제로,이 방법론은 돌고래에 사용 되었습니다 때 정자의 운동 성 65% 이었다. 그러나, 그것은 얼마나 어려운는 표준화 된 방법을 설정 하는 고려 하는 것이 중요: 기술은 온도, 습도, 폴리스 티 렌 크기, 등 등과 같은 외부 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 더 학문은 액체 질소 증기 방법으로 냉동 정자를 사용 하 여 성공을 개량 하기 위하여 절차를 표준화 하 고 최적화 하는 데 필요한.
냉동 프로토콜을 최적화 하기 위해 그것은 정 충의 기능 평가 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 개발 하는 것이 중요입니다. 시험관 수정에 대 한 잠재적인 정자를 테스트 하는 좋은 수단 이다. 이상적으로, IVF, 돌고래 oocytes를 사용 해야 하지만 여성에서 oocytes를 얻는 데 필요한 어렵고 힘 드는 절차는 중요 한 제약 조건을 나타냅니다. 따라서, 분리 IVF를 사용의 가능성 수정 효율성을 테스트 하는 돌고래에 게 새로운 의미를 엽니다. 다른 종에서 oocytes 분리 돌고래 IVF에 대 한 사용할 수 있습니다. 결과 표시 소 oocytes 돌고래 정 충 사이 분리 IVF를 수행할 수 있습니다. 냉동 및 해 동 돌고래 정 충 zona 그대로 소 oocyte 침투 하 고 하이브리드 배아를 생성 수 있습니다.
제시의 수집에 대 한 프로토콜, 동결 해 동, 소 oocytes와 분리 IVF를 수행 성공적으로 입증 되었습니다 및 조합 cryopreservation의 최적화 및 평가 위한 초기 단계를 나타냅니다. 돌핀 정자입니다. 그것은 여전히 많은 미지수가이 절차에서 중요 하다. 그러나, cryopreserve 돌고래 정액 수 액세스할 수 하 고 실험실에 보관 될 수 있습니다. 이 과학적 연구를 촉진 하 고 생리, 구성과 정 충의 행동의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
분리 IVF에 의해 정자의 평가 동결 프로토콜의 최적화를 쉽게 할 수 있지만 그것은 또한 사용할 수 있습니다 나중에 테스트 하 고 남성 불 임 효율성에 대 한 선택. 한 중요 한 고려 사항은 진짜 수정 번호와 분리 IVF 값 사이의 관계 이다. 또한, 그리고이 두 phylogenetically 먼 종, 소과 돌고래, 사이 분리 IVF의 참신 때문에 새로운 생물학 가설을 만들 수 있습니다. 이러한 프로토콜 돌고래 및 다른 해양 포유 동물의 재생산에 대 한 연구를 위한 새로운 공간을 엽니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
그의 작품은 경제와 경쟁력 (AGL2015-70140-R은 D. Rizos), AGL2015-66145R A. 구 티에 레즈-아덴 및 J. F. 페 레 스-구 티에 레즈와 세네카 재단의 무르시아 (그랜트 20040/세균/16 F. 가르시아 바스 케 스에 게) 스페인 정부에 의해 투자 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FERT-TALP medium | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 | |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H | |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polymerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | ||
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | ||
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | ||
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | ||
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software | |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Microcentrifuge tubes | VWR | ||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
