Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה עבור אוסף spermatozoa דולפין, הקפאה קריוגנית וביצועים heterologous IVF באמצעות oocytes שור.
Abstract
השימוש של דולפין cryopreserved spermatozoa מקל על חילופי חומר גנטי בין פארקים ימיים והופך spermatozoa נגיש למעבדות ללימודים לקדם את ההבנה שלנו של יונקים ימיים רבייה. Heterologous להפריה חוץ גופית, תחליף הומולוגי להפריה חוץ גופית, יכול לספק אמצעי כדי לבדוק הזרע פוריות אפשריות; ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם; כדי למנוע את השימוש oocytes דולפין בעל ערך, אשר קשה להשיג. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה כדי לאסוף cryopreserve spermatozoa דולפין. איסוף זרע מתבצע על ידי גירוי ידני על דולפינים מיומן. הקפאה קריוגנית מושגת באמצעות הרחבה מבוסס חלמון ביצה של טריס גליצרול. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול זה מתאר heterologous חוץ-גופית בשיטת דולפין spermatozoa, oocytes שור ומוודא כי מהות היברידית וכתוצאה מכך העובר באמצעות PCR. הפריה heterologous מעלה שאלות על הפריה והוא יכול לשמש ככלי ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם. בנוסף, ההצלחה של הפריה חוץ גופית heterologous מדגימה את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי לבדוק הזרע דולפין הורס את ביצועיו, שווה בדיקה נוספת.
Introduction
בסיוע טכנולוגיות פריון הן מפותחות חיות בר, כולל יונקים ימיים. העדר רגיש שיטות להערכת ההצלחה המפרה זרע תורם להתפתחות איטית של טכנולוגיות פריון במינים כמו דולפין. זה לא היה עד לאחרונה כי הפרמטרים הבסיסיים החלוצי של דולפינן (והוולדות truncatus) היו שדווחה1,2. עם זאת, משתנים כגון תנועתיות, מורפולוגיה, למרות בשימוש נרחב, לתת מידע מוגבל על יעילות הרבייה. הסימן הכי טוב של איכות הזרע הוא הערכת פוטנציאל המפרה.
לאחרונה, הקבוצה שלנו להשתמש בשיטה כדי להעריך דולפין הזרע להפרות את הפוטנציאל על-ידי הערכת היווצרות pronuclear זכר ו/או היברידית היווצרות העובר לאחר IVF heterologous באמצעות zona oocytes שור שלם3. השימוש של דולפין-שור heterologous IVF יש יתרונות חשובים מעל הומולוגי להפריה חוץ גופית, כמו זה מתגבר על הקושי בהשגת דולפין oocytes ואסטמה ומקילה על השימוש נבדק היטב במבחנה oocyte שור ההבשלה במערכות. כדי למנוע ירידה לפרטים מינים, heterologous ההפריה מבוצעת בדרך כלל בהעדר מסוג ZP. למרות שהיא מתירה על ההערכה ליכולת של spermatozoa acrosome הגיב להתמזג עם קרום vitelline, זה מחליש את ההערכה של תכונות אחרות הקשורות הפריה. ההליך המתואר משתמשת zona oocytes ללא פגע, מאפשר הערכת הפרמטרים הבאים: איגוד zona הזרע מצורף, חדירה, polyspermy, היווצרות pronuclear ואני היברידית העובר המחשוף.
כאן, אנו מציגים מספר פרוטוקולים עבור איסוף זרע, זרע בסיסית ניתוח, spermatozoa קפוא, כמו גם הערכת הפונקציונליות זרע דולפין על-ידי הערכת זכר pronuclear ו/או היברידית העובר היווצרות לאחר heterologous IVF באמצעות zona ללא פגע oocytes שור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקה משפט: כל ההליכים ניסיוני היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של y אינסטיטוטו נאסיונאל דה Investigación Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). כל הניסויים בוצעו בהתאם לקו המנחה על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, כפי שאומצה על ידי אגודת המחקר של רבייה, וכדי חוק רווחת בעלי חיים לטיפול של יונקים ימיים.
1. איסוף זרע דולפין של הקפאה קריוגנית
- הכנת
- ןשד להפוך בינוני (הפארין ו hypotaurine-חינם). להכין בינוני ןשד-TALP בתוספת 25 מ מ ביקרבונט 22 מ"מ סודיום לקטט, פירובט נתרן 1 מ מ, 6-מ"ג/מ"ל חומצה שומן חינם BSA, הפארין 10 מ"ג/מ"ל (pH 7.4).
הערה: להכין בינוני ביום של השימוש ולשמור אותו ב- 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ולאחר באוויר עם הלחות המקסימלית כבר לפחות שעתיים לפני השימוש. - טריס להכין ביצה חלמון מבוססי מאגר. להמיס 30.28 g/L טריס, חומצה ציטרית 16.75 g/L, פרוקטוז 12.5 g/L ו- 0.5 g/L סטרפטומיצין במים הנדסה גנטית (pH 7.3, osmolality = 310 mOsm/kg). להוסיף חלמון ביצה 20% (v/v).
- ןשד להפוך בינוני (הפארין ו hypotaurine-חינם). להכין בינוני ןשד-TALP בתוספת 25 מ מ ביקרבונט 22 מ"מ סודיום לקטט, פירובט נתרן 1 מ מ, 6-מ"ג/מ"ל חומצה שומן חינם BSA, הפארין 10 מ"ג/מ"ל (pH 7.4).
- רכבת דולפין זכר קצר גידול מוכח לשכב על recumbence הגבי ליד שפת הבריכה לאיסוף זרע מרצון.
הערה: דולפין זכר בקיצור מעל 6 חודשים על ידי חיזוקים חיוביים, כפי שתואר לעיל 4. - לבצע stimulations מישוש שונות על-ידי הקשת בעדינות על האזור הגולגולת של החריץ איברי המין של הדולפין שמעודדים ההבלטה מרצון של הפין מן החריץ באברי המין.
- לאחר השגת זקפה מלאה, לכוון קצה הפין לתוך מיכל סטרילי כדי להשיג השפיכה.
- לשמור את דגימת הזרע ב 37 ° C עד הניתוח. חזור על שלבים 1.3 ו 1.4 עבור אוספי לפלוט רצופים, באמצעות כוס פרופילן חדשה בכל פעם.
- מיד לאחר אוסף, לקבוע האחסון באמצעות גליל זכוכית בוגר חימם בעבר 37 ° C. הערך הצבע, ה-pH של osmolarity (שימוש של מיקרו-osmometer) של השפיכה.
- כדי להעריך את הריכוז של spermatozoa ב השפיכה, להוסיף 10 µL של ההשעיה הזרע צינור גלאים המכילה 90 µL של מים מזוקקים. לקבוע ריכוז הזרע באמצעות זרע ספירת תא.
הערה: במהלך האבחון, נשאיר את שאר השפיכה-37 מעלות צלזיוס. - להעריך את הפרמטרים תנועתיות.
- לקחת 10 µL זרע מדגם ומניחים אותו בתוך תא זרע מראש ומחוממת.
- הערכת תנועתיות באמצעות מערכת ניתוח המחשב בסיוע זרע, לאמת בעבר עבור דולפינן, להעריך באופן אובייקטיבי את תנועתיות הזרע 2.
הערה: אם יש צורך, לדלל את דגימת זרע בינונית ןשד (הפארין ו hypotaurine-חינם) עבור הפריט החזותי נאותה של תנועתיות הזרע. במהלך האבחון, לשמור על המדגם ב 37 מעלות צלזיוס על הבמה מיקרוסקופ מחוממת.
- לקחת 20 µL זרע מדגם והערכה של המורפולוגיה הכדאיות ואת זרע כפי שתואר לעיל 5.
- להעביר את דגימת זרע שפופרת צנטרפוגה. Centrifuge את דגימת הזרע ב g x 250 למשך 5 דקות. אחרי קביעת ריכוז הזרע באמצעות חדר הספירה, להתאים את ריכוז הזרע 400 x 10 6 spermatozoa/mL.
הערה: אם יש צורך, לדלל בגדר מ שופך מרוכז עם פלזמה הזרע מבודד מאמצעי אחסון מסוג עודף של השפיכה אותו על ידי צנטריפוגה (250 x g, 10 דקות).- במשך 5 דקות, לאט שתדללו הזרע מדגם 1:1 (v/v) עם טריס ביצה חלמון מבוססי מאגר המכיל 1.5% גליצרול. מקם את הצינור המכיל את השעיית הזרע ב 5 ° C עבור 1 h 30 דקות
- בצע לדילול השני של ההשעיה זרע עם טריס ביצה מאגר מבוסס-חלמון המכיל גליצרול להשגת ריכוז גליצרול הסופי של 3%, ריכוז סופי של 200 x 10 6 זרע/מ ל.... לשמור על ההשעיה הזרע ב 5 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
- לטעון את המתלים זרע לתוך 0.25 mL קשיות. Heat-seal את הקשיות. המקום קשיות במעמד 4.5 ס מ מעל חנקן נוזלי במשך 10 דקות טיבלו את הקשיות החנקן הנוזלי ולאחסן עד הערכה.
2. Heterologous חוץ גופית ב דישון באמצעות Zona שלם שור Oocytes
- הכנת
- הכן ההכתמה פתרון והמדיום הרכבה.
- Hoechst להכין פתרון מניות על ידי המסת 1 מ ג של Hoechst ב 1 מ"ל של מים מזוקקים. להפוך 30 µL aliquots ולשמור אותם בחושך ב-20 ° C עד השימוש. להכין פתרון צביעת על-ידי הוספת 25 µL של פתרון מניות Hoechst מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) בתוספת 1 g/L PVA. מערבבים היטב ולשמור באפלה ב 4 ° C עד שימוש. בינוני הרכבה
- להכין על ידי ערבוב mL 6.25 ל- PBS עם mL 6.25 של גליצרול ו- 6.25 µL של פתרון מניות Hoechst. מערבבים היטב ולשמור באפלה ב 4 ° C עד שימוש.
- להתכונן המדיום oocyte אוסף ואת במבחנה הפריה.
- להכין תמיסת מלח על-ידי הוספת 0.5 מ של gentamycin 0.9% NaCl מזוקקים למים.
- להכין את המדיום ההבשלה מניות על-ידי הוספת 10 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו- 10% עגל עוברית סרום (FCS) 10 מ"ל של TCM-199. לשמור על שני מדיה ב- 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ולאחר באוויר עם הלחות המקסימלית כבר לפחות שעתיים לפני השימוש.
- הכן ההכתמה פתרון והמדיום הרכבה.
- לאסוף את השחלות בבית המטבחיים בתמיסת ב 33-35 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם למעבדה תוך 4 שעות מהאוסף.
- פעם במעבדה, לשטוף את השחלות שלוש פעמים כדי להסיר את הלכלוך ודם באמצעות תמיסת בעבר התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. לשמור על השחלות בתמיסת ב 37 מעלות צלזיוס במהלך התהליך.
- וביופסיה זקיקים 2 עד 8 מ מ עם 18 גרם מחט ומזרק 10-mL. לאסוף את הנוזל הזקיקים aspirated צינורות 50 מ ל.
- לאפשר את הנוזלים זקיקים המכילים את oocytes לעמוד למשך כ 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עד שהגופה תאים. הסר את תגובת שיקוע של הצינור עם פיפטה פסטר והשהה בגדר מחדש ב- PBS.
- לשחזר את מתחמי קומולוס-oocyte (COCs) במנות 90 מ מ מתחת stereomicroscope.
- לרחוץ את COCs שלוש פעמים ב- PBS ופעם ב בינוניים.
- להעביר COCs מורפולוגית נורמלי. ובכן 4 מנות, שכל אחד מהם טוב מכיל 500 מ"ל של בינוניים, בקבוצות של COCs 50 לכל טוב.
הערה: כאן, שלוש בארות – טוב heterologous IVF, פקד אחד טוב בשביל IVF הומולוגיים של אחד טוב המכיל רק התבגר COCs כפקד parthenogenetic – שימשו. - דגירה של COCs במשך 24 שעות ביממה ב- 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ו באוויר עם הלחות המקסימלית.
- להכין את המדיום ואת המילוי ההדרגתי צפיפות.
- כדי להכין הפריה בינוני (ןשד), תוספת ןשד-TALP בינוני עם ביקרבונט 25 מ מ, 22 מ"מ סודיום לקטט, פירובט נתרן 1 מ מ, 6 מ"ג/מ"ל חומצה שומן חינם BSA 10 מ"ג/מ"ל הפארין. שתשמור על 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ולאחר באוויר עם הלחות המקסימלית כבר לפחות שעתיים לפני השימוש.
- להכין את המילוי ההדרגתי צפיפות על-ידי הוספת 1 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור 15-mL, mL 3 לרחוץ את פתרון צינור 15-mL. לשמור אותם ב- 38.5 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 ח'
- לשטוף במבחנה התבגר oocytes פעמיים במדיום ןשד.
- להעביר את oocytes מנות 4-. ובכן, זה טוב המכיל 50 COCs ב 250 מ של ןשד. לשמור על כל המנות 4-ובכן 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ולאחר באוויר עם לחות מקסימלית תוך הכנת הזרע להפריה.
- להפשיר קש קפוא המכיל דולפין spermatozoa באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C 50 ס
הערה: שור את הזרע להפריה חוץ גופית הומולוגי שיש לעבד במקביל, בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי עבור IVF שור הומולוגיים. - µL 10 לקחת את הזרע לטעום ולמקם אותו מראש ומחוממת זרע ספירת קאמרית. הערכת תנועתיות באמצעות מערכת ניתוח המחשב בסיוע זרע, לאמת בעבר עבור המין, להעריך באופן אובייקטיבי על תנועתיות הזרע. במהלך תקופה זו, לתחזק את דגימת זרע ב- 38.5 מעלות צלזיוס
- להוסיף את דגימת זרע צפיפות הצינורית הדרגתי (שלב 2.10.2). צנטריפוגה 10 דקות ב 250 ג x
- הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של פסטר. להוסיף 3 מ"ל של הפתרון כביסה הצינור המכיל בגדר. מחדש להשעות את צניפה בעדינות ערבוב.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 250 x ג להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה פסטר לאמצעי זרע של 300 µL.
- 5 להוסיף µL של ההשעיה הזרע כדי microcentrifuge המכיל µL 95 של מים מזוקקים. לשמור על ההשעיה זרע ב- 38.5 ° C. מלא תא ספירת קאמרית עם µL 10 מתוך 1:20 לדילול הזרע ולמדוד הריכוז. לחשב את כמות בינונית ןשד עליך להוסיף 100 µL את הזרע כדי להשיג 2 x 10 6 spermatozoa/mL.
- להוסיף אמצעי האחסון מחושב ןשד, הזרע צינור 15-mL ומערבבים בעדינות בעזרת פיפטה של פסטר.
- 250 להוסיף µL של ההשעיה זרע-ןשד כדי כל טוב של המנה 4-ובכן המכיל המדיום ןשד עם oocytes התבגר בריכוז הסופי של עונה 1 פרק 10 6 spermatozoa/mL.
- שיתוף דגירה של גמטות עבור 18 h ב- 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ולאחר באוויר עם הלחות המקסימלית.
- להכין את המדיום תרבות המבוססת על הנוזל oviductal סינטטי בתוספת 5% FCS. להכין µL 25 של תרבות נוזל oviductal סינתטי טיפות במנות 35 מ מ, מכוסה 3 מ של שמן מינרלי. שתשמור על 38.5 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 ולאחר באוויר עם הלחות המקסימלית כבר לפחות שעתיים לפני השימוש.
- -2.5 h פוסט משותף דגירה, להסיר 20 oocytes מתוך קערה; לתחזק את oocytes הנותרים בחממה תחת באותם התנאים.
- להסיר את spermatozoa מצורף באופן רופף על-ידי נמרצות pipetting מחצית oocytes באמצעות פיפטה פסטר צר נשא 10 פעמים.
- לתקן oocytes 20 ב- 50 µL של 0.5% גלוטראלדהיד במשך 30 דקות לשטוף oocytes ב- PBS עבור 5 דק. להעביר את oocytes כדי 50-µL של פתרון מכתימים Hoechst למשך 15 דקות ולשטוף את oocytes ב- PBS עבור 5 דק.
- להעביר את oocytes בנפרד µL 2, טיפות הרכבה בינונית בקצב של 10 oocytes לכל שקופית. לכסות עם coverslip ובעדינות לאטום עם לק.
- לספור את מספר spermatozoa המצורפת את oocytes שור באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות מצוידים פלורסנטי אופטיקה, עירור 361 ננומטר מסנן בהגדלה 40 x.
- לאחר 12 שעות של דגירה שיתוף, להסיר 10 מופרות הרב, שעורר הכלים 4-ובכן; לשמר את הנותר מופרות הרב, שעורר בחממה תחת באותם התנאים.
- העברת 10 מופרות הרב, שעורר כדי צנטריפוגה 15-mL צינור המכילה 2 מ"ל של PBS ו מערבולת בעדינות למשך 2 דקות כדי להסיר תאים קומולוס. לשטוף פעמיים ב- PBS, תיקון ו הכתם, כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.23.2.)
- לאחר 18, 20, 22, 24 שעות ביממה של דגירה שיתוף, להסיר 10 הרב, שעורר מופרות. ובכן 4 מנות, מערבולת, לתקן ולאחר תכתים אותם תיאר כאמור (שלב 2.23.2). לשמור על שאר מופרות הרב, שעורר בחממה תחת באותם התנאים.
- להעריך היווצרות pronuclear polyspermy תחת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות/פלורסנטי בקבוצות שניהם הומולוגית ו heterologous IVF על ידי צביעת עם Hoechst.
- להעריך pronuclear-צורה 10 מופרות היברידית הרב, שעורר נבחר באופן אקראי עבור כל דגימה. לאשר את היווצרות pronuclear תחת סריקה מיקרוסקופ-ארגון 488 ננומטר לייזר עירור וזיהוי 515 כדי 530 ננומטר לייזר קונפוקלי.
- אופטית סעיף מופרות הרב, שעורר ברצף (2 מ מ) לאסוף תמונות בעזרת תוכנה הדמיה. המחש באמצעות חבילת תוכנה לניתוח 3D.
- לאחר 24 שעות של דגירה שיתוף, לשטוף מופרות הרב, שעורר 50 ארבע פעמים ב- PBS פעמיים במדיום תרבות.
- להעביר אותם בקבוצות של 25 microdroplets של תרבות בינוני שהוכנו בעבר, equilibrated.
- תחזוקה-38.5 ° C תחת אווירה של 5% O 2 / 5% CO 2 ו באוויר עם הלחות המקסימלית.
- לאחר 26 ו- h 28 של דגירה שיתוף, הסר מופרות הרב, שעורר 10 הכלים, מערבולת, תיקון, ולאחר תכתים אותם, כפי שצוין בעבר תיאר (שלב 2.23.2).
- לאחר 48 שעות של תרבות, לבחון את המחשוף תחת stereomicroscope.
- להסיר את pellucida zona (מסוג ZP) על-ידי העברת העוברים פתרון פרוטאז 5 מ"ג/מ"ל.
- לרחוץ באופן אינדיבידואלי לכל העובר שלוש פעמים ב- PBS. Snap-להקפיא אותם בחנקן נוזלי 0.2 מ"ל microcentrifuge צינורות. לאחסן אותם ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח.
3. PCR
- חומרים, ריאגנטים
הערה: ריאגנטים, חומרים וציוד המשמש לביצוע בפרוטוקול ה-PCR מפורטים בטבלה של החומרים וכוללים מתלה צינור PCR, קבוצת micropipettes (P2, P20, P200, P1000), 1.5 מ ל microcentrifuge צינורות, המבחנות כמוסות, של הצנטרפוגה תרמי, המאייר UV, agarose ג'ל, ו מאגר (טריס בוראט EDTA (TBE)).- בעדינות להפשיר כל ריאגנטים על קרח. לשמור אותם על קרח לאורך כל הניסוי. השתמש deoxynucleotides (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP ו- dGTP), יעד תחל ב הפניה ג'ין קידוד דולפין 18 S ribosomal החלבון (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG ו- F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), ה-DNA פולימראז, מאגר 5 X עבור ה-DNA פולימראז, תבנית ה-DNA, במים סטריליים וכן מגנזיום כלוריד (MgCl 2-ריכוז סופי של 5.0 מ"מ). הכנת ג'ל, ולטעום
- Agarose.
דוגמאות
- זרע דולפין, שור הכן הדנ א.
- הפשרה קש קפוא של כל מין באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C 50 ס להוסיף 3 מ"ל של כביסה פתרון. צנטריפוגה ב 250 x g עבור 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע. להוסיף µL 30 מאגר פירוק STES (50 מ מ טריס-HCl, pH 8; 20 מ מ NaCl; ומרחביות 0.1% 1 מ מ), 2 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל), ו- 5 µL של dithiothreitol (DTT); ריכוז סופי: 150 מ מ. לשמור על לילה במלון 55 ° ג להוסיף 200 µL של מים הנדסה גנטית. צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דק. לשמור את תגובת שיקוע. למדוד את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים.
- לבצע דילולים טורי של ה-DNA של דולפין spermatozoa (קרי: 40, 4 ו- 0.4 ng/mL) עם מים הנדסה גנטית כדי לבדוק את התנאים PCR מסוגלת איתור כמות קטנה של דולפין דנ א.
- ביצוע דילולים טורי של שור זרע DNA (קרי, 4,000, 400, 40 ו- 4 ng/mL) עם מים הנדסה גנטית כדי לבדוק את התנאים PCR מסוגלת לאתר כמות קטנה של DNA שור.
- להכין את העוברים דולפין ושור. הפשרת העוברים על קרח. להוסיף 8 µL של µg/mL 100 proteinase K ולשמור לילה-55 מעלות צלזיוס. כדי להפסיק את התגובה, למקם את הדגימות ב 96 ° C עבור 5 דק
- להכין 2% agarose ג'ל TBE מאגר ולהוסיף 20 µL של חומצות גרעין כתם בטכניקות רגיל.
- זרע דולפין, שור הכן הדנ א.
- הכנה PCR.
- צינור תווית ה-PCR: דולפין דילולים טורי (40, 4 ו- 0.4 ng/mL), שור דילולים טורי (4,000 400, 40, 4 ng/mL), עובר הומולוגיים שני תאים שור, שני תאים עוברי heterologous הרב, שעורר ושליטה שלילי.
- להכין את תערובת הבסיס בצינור microcentrifuge 1.5-mL סטרילי כדי נפח סופי של 25 µL לכל תגובה.
µL
- µL להוסיף 5 5 X DNA פולימראז flexi מאגר, 0.5 µL של dNTPs (10 מ"מ) 1.5 של MgCl 2 (25 מ מ), 0.5 µL של פריימר ואחורה (10 מיקרומטר), µL 1.5 של תבנית ה-DNA (זרע) או 8 µL של תבנית ה-DNA (שני-תא עוברי) , מים עד נפח סופי 25 µL מזוקקים 0.07 µL של אנזימים וסטרילי. מערבבים היטב.
- הגברה פרוטוקול
- למקם את הצינורות הצנטרפוגה תרמי. בחר את התוכנית הבאה: 94 ° C למשך 3 דקות; 40 מחזורי 94 ° C 15 s, 59 ° C עבור 25 s, 72 ° C עבור 20 s; ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להפעיל את התוכנית.
- חנות הצינורות-4 ° C. להוסיף 2.5 µL של טעינת מאגר לכל מוצר ה-PCR-µL 15 4 ° C ו עומס של התערובת לתוך הבארות של הג'ל 2% agarose. השתמש בסמן סולם הדנ א על הערכת גודל מדויק של ה-PCR קטעים.
- בצע אלקטרופורזה למשך 15 דקות לאפשר העברת הדנ א. דמיינו להקות באמצעות של המאייר UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כל תוצאות, טבלאות או איורים (1 ו 2) המובאת כאן שוחזר עם הרשאה3.
דולפין spermatozoa יש תנועתיות גבוה לאחר הקפאה והפשרה
שופך הדולפין קפוא-הקרת הראה באחוזים (% ± SD) של 84.5 ± 5.3 הכוללת תאי ואין 69.1 ± 5.1 spermatozoa תאי מתקדמת. במונחים של תנועתיות, המספרים האלה הם נציג של spermatozoa cryopreserved באיכות גבוהה.
דולפין spermatozoa מסוגלים חודר zona oocytes שור שלם ולא לעשיית עוברי היברידית
איור 1A ו לטבלה 1 הצג דולפין spermatozoa מצורף מסוג ZP שור לאחר 2.5 h של דגירה משותף. דולפין spermatozoa היו קשורים אחוז גבוה יותר מאשר spermatozoa שור (איור 1B , טבלה 1). אכן, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מראה כי דולפין spermatozoa מסוגלים לחדור zona שלם פרה spermatozoa (איור 1C), שמוביל היווצרות pronuclear, המחשוף (איור 1E ולא טבלה 1). זה אושר ע י מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1D ו- 1F איור). Polyspermy לא נצפתה ב oocytes מקבוצת IVF heterologous לאחר 12 שעות של שיתוף דגירה (טבלה 1). Pronuclear-צורה IVF heterologous להגיע באחוז הגבוה ביותר ב- 24 שעות, זמן רב יותר מאשר בקבוצה הומולוגיים, אשר התרחשה ב 18 h של שיתוף דגירה (טבלה 1). הקצב המחשוף 48 שעות לאחר דגירה היה נמוך ב- heterologous IVF הומולוגיים (טבלה 1). שיעור הפעלה parthenogenetic ספונטנית של 8.0% נצפתה ב שור oocytes מופרית התבגר ב 48 שעות (טבלה 1).
לבסוף, התוצאות PCR אישרו הנוכחות של דולפין חומר גנטי של העוברים היברידית (איור 3) המעריכה את הנוכחות של דולפין הפניה גן מקודד עבור ribosomal 18 S חלבון (איור 2).
איור 1: דולפין spermatozoa המצורפת pellucida zona שור (מסוג ZP). דולפין המצורפת (A), spermatozoa (B) שור לאחר 2.5 h של דגירה שיתוף עם zona oocytes שור שלם. גמטות היו מוכתמים Hoechst, דמיינו במיקרוסקופ ניגוד שלב (40 X הגדלה). Spermatozoa דולפין במרחב periviteline של שור oocyte (C ו- D) וראש decondensing דולפין זרע בציטופלסמה oocyte שור (E). תמונות נלכדו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי ומתייחסים אליהם קו המשווה של הזיגוטה הרב, שעורר (Hoechst מכתימה; 40 X הגדלה). שני pronuclei (F) נצפתה במיקרוסקופ ניגוד שלב לאחר 24 שעות של heterologous IVF המורכב הדגירה שיתוף של דולפין spermatozoa עם zona oocytes שור שלם (Hoechst מכתימה; 40 X הגדלה; סרגל קנה מידה = מיקרומטר 25). הדמות שוחזר הפניה3 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג אלקטרופורזה (2% agarose ג'ל אתידיום ברומיד צבעונית) מציג את התוצאות הגברה PCR עבור הגן דולפין S 18. מסלולים 1 ל- 30 להראות דולפין הרב, שעורר/שור היברידית העוברים; מסלולים S1 ו- S2 כוללים 4 ננוגרם למ"ל ו 0.4 ננוגרם למ"ל דולפין זרע ה-DNA, בהתאמה; מסלולים C1 ל- C5 כוללים שני תאים שור עוברי ו- H2O (מים) (הפקד ריק). החץ מצביע על הלהקה 190-bp המקביל לכביש 18 מוגבר S rDNA. הדמות שוחזר הפניה3 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: להחליפן בתמונות של העוברים היברידית. תמונה ייצוגית של העובר שני תאים היברידית (A)-48 שעות של דגירה (Hoechst מכתימה; 40 X הגדלה). היברידית נקייה מדם עוברי-48 שעות של דגירה, בשלבים שונים של החטיבה, דמיינו תחת stereomicroscope (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: המחירים של הקובץ המצורף, polyspermy, היווצרות pronuclear המחשוף בעקבות הדגירה שיתוף הומולוגית ו heterologous עם oocytes שור ולא שור או דולפין spermatozoa, בהתאמה. משתני נותחו עם ANOVA (מבחן Kruskal- ואליס מאן-ויטני). הערכים מבוטא זאת אומרת ± SEM (טווח) של משכפל 12; n = המספר הכולל של oocytes או הרב, שעורר מופרות בחן. הטבלה שוחזר הפניה3 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור מינים רבים יונקים שונים, ישנם יתרונות מגוונים לשימוש זרע קפוא-הקרת. אלה כוללים את היכולת להעביר חומר גנטי בעל ערך, את הפוטנציאל להפצה ברחבי העולם, הסיכון נמוך של זיהום, את היכולת לשמר את זכר גמטות במשך עשרות שנים. השימוש cryopreserved הזרע חיוני דולפינן, כי מין זה מוגן תחת נספח ב- CITES, אשר מגביל את התחבורה ואת חילופי בעלי חיים בין פארקים ימיים שונים. דולפינים תחבורה היא פעילות היוצרת בעיות לוגיסטיות והסיכונים מסוכן. עם זאת, הימנעות המסיעה אותם יש גם השלכות, כגון הסיכון של החדרת וקרבת הדם אוכלוסיה בשבי של בעלי חיים. פתרון אחד הוא הקפאה קריוגנית של זרע. יש מחברים יש cryopreserved דולפין זרע5,7,8,9, עם מאוד מעודדות. יתר על כן, בשנת 2005, הלידה הראשונה של עגל דולפין יזום על ידי הזרעה מלאכותית באמצעות זרע cryopreserved היה דווח על10. כמה שנים מאוחר יותר, נעשה שימוש spermatozoa ממוין סקס11.
דולפין זרע יש כבר cryopreserved באמצעות טכניקות שונות, החל שיטות מתוחכמות, כמו מקפיא לתכנות5, שיטות נפוצות, כגון חנקן12 או נוזל קרח יבש ואדים2,9, 13. היתרון העיקרי של שימוש קרח יבש או חנקן נוזלי ואדים הוא האפשרות לקבל cryopreserve באותו מיקום שבו מופק הזרע, ללא השימוש של ציוד מאוד מיוחדים. זרע קפוא קשים על פוליסטירן בחנקן נוזלי האדים היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה13. בפועל, כאשר מתודולוגיה זו שימש על דולפינים, תנועתיות הזרע היה 65%. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כמה זה קשה להקים שיטה סטנדרטית: הטכניקה עלול להיות מושפע מגורמים חיצוניים, כגון טמפרטורה, לחות, גודל פוליסטירן, וכו '. לפיכך, בהמשך לימודי נחוצים למטב, לתקנן את ההליך על מנת לשפר את ההצלחה של שימוש זרע קפוא עם השיטה אדי חנקן נוזלי.
כדי למטב את פרוטוקול קופא, חשוב לפתח שיטה אמינה להערכה תפקודית של spermatozoa. הפריה חוץ גופית הוא אמצעי טוב של בדיקת הזרע פוטנציאל הפריה. באופן אידיאלי, דולפין oocytes ישמשו לצורך הפריה חוץ גופית, אך ההליכים מפרך וקשה הנצרך oocytes מן הנקבות לייצג אילוץ חשוב. לכן, האפשרות של שימוש heterologous IVF פותח אמצעי חדש כדי לבחון יעילות הפריה הדולפין. דולפין heterologous IVF יכול לשמש oocytes מפני זנים אחרים. התוצאות מציגות IVF heterologous בין oocytes שור דולפין spermatozoa יכול להתבצע. Spermatozoa דולפין מוקפאים ומופשרים יכול לחדור oocyte שור שלם zona וצור העובר היברידית.
השילוב הציג של פרוטוקולים עבור איסוף, מפשיר ההקפאה ולאחר ביצוע IVF heterologous עם oocytes שור הוכחו בהצלחה והוא מייצג צעד ראשוני עבור אופטימיזציה של הקפאה קריוגנית והערכה של דולפין זרע. חשוב לציין כי ידועים עדיין בהליכים אלה. עם זאת, היכולת cryopreserve דולפין זרע שהופך אותה לנגישה ומאפשר שהיא תישמר במעבדות. זה יקל על מחקרים מדעיים, יכול להוביל הבנה טובה יותר של פיזיולוגיה, קומפוזיציה, אופן הפעולה של spermatozoa.
ההערכה של זרע על ידי heterologous IVF יכולה להקל על אופטימיזציה של הפרוטוקולים ההקפאה, אך זה עשוי לשמש גם בעתיד כדי לבחון ולבחור זכרים ליעילות פוריות. שיקול חשוב אחד הוא הקשר בין הפריה אמיתיים מספרים וערכים IVF heterologous. בנוסף, ולאור החידוש של IVF heterologous בין אלה שני מינים רחוקים phylogenetically, שור, דולפין, השערות ביולוגי חדש יכול להיות בנוי. בסך הכל, פרוטוקולים אלה לפתוח מרחב חדש לחקר הרבייה של הדולפין ויונקים ימיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודתו מומן על ידי משרד ספרדית של הכלכלה ואת התחרותיות (AGL2015-70140-R ל ד Rizos), AGL2015-66145R א גוטיירז-אדן, ג'יי פ פרז-גוטיירז. סנקה קרן מורסיה (גרנט 20040/נבט/16 ל פ גארסיה-ואסקז)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FERT-TALP medium | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 | |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H | |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polymerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | ||
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | ||
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | ||
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | ||
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software | |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Microcentrifuge tubes | VWR | ||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
