Summary
Actuellement aucune sorte d’allotransplantation composite vascularisée dépend de long-terme-immunosuppression, difficile à supporter pour des indications non critiques de la vie. Nous présentons un nouveau porcine tibial VCA modèle qui peut être utilisé pour étudier les os VCA et démontrer l’utilisation de l’angiogenèse chirurgicale pour maintenir la viabilité des os sans avoir besoin de modulation immunitaire à long terme.
Abstract
La perte osseuse segmentaire résultant d’un traumatisme, tumeur maligne de l’infection et anomalie congénitale demeure un défi majeur de reconstructive. Les options thérapeutiques actuelles ont un risque important d’échec et de morbidité importante.
Utilisation d’os vascularisé composite allotransplantation (VCA) offrirait les deux un match serré de l’OS réséqué taille et forme de guérison et transformant le potentiel de l’OS vivant. À l’heure actuelle, immunosuppression (IS) de la drogue continue est nécessaire. Toxicité pour les organes, les infections opportunistes et les risques de néoplasme sont préoccupantes pour traiter ces indications non létales.
Nous avons démontré précédemment qu’OS et des articulations viabilité VCA peut être maintenue chez les rats et les lapins sans avoir besoin de long-terme-immunosuppression par l’implantation de destinataire vaisseaux dérivées dans le VCA. Il génère une circulation neoangiogenic autogène, avec un débit mesurable et osseuse active remodelage, exigeant seulement 2 semaines d’IS. Comme petits animaux diffère d’un homme sensiblement dans l’anatomie, la physiologie osseuse et immunologie, nous avons développé un modèle VCA OS porcine pour évaluer cette technique avant de procéder à une application clinique. Porcs miniatures sont actuellement largement utilisés pour la recherche de l’allotransplantation, compte tenue de leurs similitudes immunologiques, anatomiques, physiologiques et taille à l’homme. Nous décrivons ici un nouvel OS tibial orthotopique porcine modèle VCA pour tester le rôle de l’autogène angiogenèse chirurgicale pour maintenir la viabilité VCA.
Les modèle reconstruit des défauts osseux tibial segmentaire utilisant-même taille et forme des segments OS tibial allogéniques, transplantés dans un major porcine leucocyte antigen (SLA) incompatible dans porcs miniatures du Yucatan. Réparation de navire en éléments nutritifs et implantation de destinataires navires autogènes dérivées dans le canal médullaire des segments d’os tibial allogénique est pratiquée en association avec simultanée IS à court terme. Cela permet une circulation autogène de neoangiogenic à développer des tissus implantés, maintenir le flux à travers les vaisseaux nutritifs allogéniques pendant une courte période. Une fois établie, la nouvelle circulation autogène maintient OS viabilité après la cessation de la pharmacothérapie et thrombose ultérieures navire en éléments nutritifs.
Introduction
Gros défauts osseux segmentaires résultent d’un traumatisme, une infection ou chirurgie membre d’épargne après une tumeur maligne. Options actuelles de reconstructives comme greffe vascularisée osseuse autogène, transport osseux, remplacement prothétique et cryoconservés allogreffes nécrotiques, utilisé seul ou en combinaison, sont associées à une morbidité importante et présentent des taux élevés de les complications1,2,3.
La présence d’un réseau microvasculaire est essentielle pour la formation et l’homéostasie des os, soutenant ostéogénique, chondrogéniques et des cellules souches mésenchymateuses requis pour la réparation d’OS4.
La greffe de vie osseuse allogénique, une forme d’allotransplantation de tissu composite vascularisée (OS VCA), jouée avec microchirurgicale anastomose de son pédicule en nutriments, peut représenter une alternative reconstructive future. Comme OS allogénique cryoconservés, stabilité immédiate est assurée par correspondant étroitement à morphologie d’anomalie osseuse. Comme greffon vascularisé autologue, il fournit la guérison améliorée et le remodelage de la vie tissu osseux. L’obstacle à toute procédure d’allogreffe reste de long-terme-immunosuppression (IS). Le problème est plus aigu dans les tissus musculo-squelettiques, qui ont besoin de doses de médicaments 2 - 3 fois plus élevés que les transplantations de5. Risques concomitants dont la toxicité pour les organes, malignité, une infection ou développement de graft - versus - host disease sont difficiles à justifier ces non-vie-critique-applications6. Cependant, les épisodes de rejet aigu et chronique restent un problème majeur avec l’actuel à long terme IS7. Effort continu à étroitement correspondent des antigènes d’histocompatibilité, induire une tolérance propres donateurs et/ou améliorer l’immunothérapie de drogue n’ont pas encore réussi systématiquement en autorisant la clinique sans drogue tissu survie8,9.
Nous avons déjà démontré les moyens de maintenir les os viabilité VCA et renforcer les os, remodelage chez les petits modèles animaux par la promotion d’une nouvelle circulation autogène au sein de l’OS greffé. Pour cela l’utilisation additionnelle d’angiogenèse chirurgicale du tissu autologue implanté10,11,12. Segments de l’allogreffe osseuse sont transplantés microchirurgicalement avec anastomose du pédicule segment osseux en éléments nutritifs. En outre, hôte dérivé des navires sont implantés dans le canal médullaire du segment osseux vascularisé allogéniques. Au cours de ce processus de 2 semaines, la perméabilité du vaisseau en nutriments allogénique est maintenue avec immunosuppression de drogue. Après IS-retrait, le pédicule en nutriments finira par thrombose13. Le nouveau lit capillaire, basé sur les vaisseaux dérivés hôte fournit une circulation suffisante pour maintenir la viabilité des tissus. OS de guérison et de remodelage sont renforcées depuis l’ostéogenèse et angiogenèse est couplés10,11,12. Aucune nouvelle immunothérapie n’est nécessaire et viabilité de l’OS est maintenue à long terme malgré un hôte immunologiquement compétente et l’absence de tolérance envers un donneur spécifique.
Traduction de cette nouvelle méthode d’allogreffe osseuse dans la pratique clinique devrait mieux être précédée d’entrevit de guérison, mécanique propriétés et immunologie dans un modèle animal grand. Le modèle porcin est idéal pour ces VCA recherche14,15,16. Porcs miniatures sont comparables en taille et en anatomie de l’homme, ce qui permet la reconstruction du squelette à l’aide des techniques et des implants chirurgicaux essentiellement identiques. Immunologie de porc est bien définie, y compris les porcs leucocyte antigen (SLA) haplotypes et les groupes sanguins, nécessaires pour la chirurgie de la transplantation. Études de lignée de cellules sont possibles avec greffe de correspondent pas le sexe, ainsi que des analyses détaillées des réponses immunitaires17,18,19,20,21.
Nous décrivons ici un modèle d’allotransplantation VCA osseuse dans les porcs miniatures du Yucatan, adaptés pour l’étude de la perte osseuse segmentaire et la reconstruction. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l’interaction de l’angiogenèse chirurgicale et IS à court terme sur OS survie VCA et fonction, y compris la lignée ostéocytaires, os du débit sanguin, la guérison et le remodelage des capacités, d’alloresponsiveness et de biomécanique aussi bien en ce qui concerne tester les autres stratégies novatrices de modulateurs immunitaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L’étude a été approuvée par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à Rochester de clinique de Mayo. Porcs miniatures du Yucatan servaient les donateurs et les bénéficiaires au cours de cette intervention chirurgicale de VCA. Appariement du donneur et du receveur s’inspirait d’ADN de séquence porcine leucocytes antigène (SLA) haplotyping afin d’assurer une incohérence majeure dans la SLA 22,23. Les animaux étaient appariés selon l’âge et le poids et de groupe sanguin identique. Deux équipes chirurgicales simultanément récolté un segment de l’OS tibial porcin avec son navire en éléments nutritifs du donneur et préparé le destinataire reçoive le segment de l’OS tibial allogéniques orthopically-placé. Simultanément avec microvasculaire réparation du navire en nutriments osseuse, un bundle artério-dérivé de destinataire a été placé dans le segment tibial d’angiogenèse autogène.
1. une préparation
- Rapide des porcs miniatures du Yucatan le jour avant l’intervention et pesez-les pour l’administration de drogue contrôlée.
- Animaux calmes avec Xylazine (2 mg/kg) et la combinaison de tiletamine HCL et zolazepam HCL (5 mg/kg), administrés par voie sous-cutanée.
- Placer un cathéter périphérique dans une veine de l’oreille de drogues par voie intraveineuse et de livraison saline et d’administrer la buprénorphine (0,18 mg/kg) et des antibiotiques prophylactiques (1 g cefazoline par voie intraveineuse et 5 mg/kg ceftiofur intramusculaire).
- Raser le membre postérieur droit et le gauche cou qui servira de site de récolte pour le segment de l’OS tibial vascularisé et de l’emplacement pour la pose du cathéter veineux central, respectivement.
- Vérifier les signes vitaux et le niveau de sédation en testant la relaxation des muscles de la bouche.
- Intuber l’animal avec une sonde endotrachéale Fluxsol en décubitus sternal24.
- Transférer les porcs miniatures à la table d’opération et se connecter à un respirateur pour l’entretien de l’anesthésie par l’administration d’isoflurane (1-3 %).
- Confirmer la profondeur anesthésique en testant les réflexes de lumière et cornéens palpébrales, pupillaires.
- Surveiller la saturation en oxygène par une sonde de transmission oxymètre de pouls attachée à l’oreille. Utiliser une sonde de pression artérielle brassard et de la température pour la surveillance des signes vitaux peropératoires.
- Placez les porcs miniatures du Yucatan en position couchée sur un tapis chauffant. En outre, utiliser une couverture de chauffage à air pulsé au cours de l’opération pour éviter l’hypothermie.
- La pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
2. la récolte d’un Segment de l’OS Tibial vascularisé
- Laver la jambe droite de chaque porc miniature avec solution de povidone-iode. Sécher la peau avec une serviette stérile et drapé de l’extrémité de façon stérile. Enveloppent et isoler la branche avec un drapé d’incision adhésives imprégnés d’iode pour minimiser le risque de contamination.
- Effectuer une incision avec un bistouri cristallinienne dans le membre postérieur, en commençant à l’articulation du genou, qui s’étend dans la partie distale sur la crête antérieure du tibia à l’articulation tibiotalar.
- Disséquer la peau et du tissu sous-cutané avec des ciseaux et rétracter les muscles du compartiment antérieur du tibia latéralement.
NOTE : Sortie de l’origine de muscle antérieur de tibialis facilite l’exposition. La membrane interosseuse est maintenant exposée. - Identifier l’artère tibiale crâniale et veines (pour être utilisé plus tard comme le bundle artério-veineux pour l’angiogenèse chirurgicale).
Remarque : L’artère tibiale crâniale et la veine se trouvent sur la surface antérieure de la membrane interosseuse. - Pour améliorer le champ de vision du dispositif, libérer une partie du muscle tibial antérieur de son insertion et enlever une partie de la crête tibiale en utilisant une scie oscillante.
- Protéger les vaisseaux tibiaux crâniennes, inciser le début de la membrane interosseuse au niveau de la tubérosité tibiale avec un ciseau.
- Visualiser les vaisseaux tibiales caudales, en cours d’exécution dans la partie distale sous la membrane.
NOTE : Ils branche des vaisseaux tibiaux crânienne et donnent lieu à pédicule en éléments nutritifs de la diaphyse tibiale juste distal de la tubérosité. Il est maintenant possible de visualiser le foramen en éléments nutritifs et les navires entrant dans le tibia sur sa face latérale postérieure juste distale de la tubérosité tibiale. - Baliser le pédicule en nutriments avec un microclamp. Ne retirez pas le pédicule vasculaire.
- Identifier une branche de muscle dans le compartiment tibial antérieur près du foramen en nutriments ; Ceci peut être utilisé pour l’anastomose au navire en nutriments allogreffe osseuse vascularisée. Marquez la branche de muscle avec un microclamp.
-
Récolte d’un segment d’os tibial 3,5 cm y compris le pédicule vasculaire.
- Utilisez un gabarit de découpe pour garantir une résection osseuse précise et reproductible. Gigue de position et fixer la découpe sur la surface médiale du tibia pour inclure le foramen en éléments nutritifs et les vaisseaux.
- Guidé par le gabarit, effectuer des coupes parallèles OS avec une scie oscillante à supprimer un segment tibiale de 3,5 cm. Utilisez le même positionnement et le gabarit pour les donneurs et des receveuses à maximiser la taille et forme de correspondance.
- Utilisez un gabarit de découpe pour garantir une résection osseuse précise et reproductible. Gigue de position et fixer la découpe sur la surface médiale du tibia pour inclure le foramen en éléments nutritifs et les vaisseaux.
- Une fois que les deux découpes ont été faites avec la scie oscillante, faire pivoter le segment de l’OS tibial pour visualiser le pédicule en nutriments sur la surface postérieure. Diviser le pédicule en éléments nutritifs à l’origine de l’artère tibiale crâniale avec des ciseaux. Disséquer et sans le segment tibial avec des ciseaux, laissant une fine manchette du périoste et le muscle sur sa surface.
- Rétracter le segment de l’OS tibial et élevez le segment de l’OS tibial avec son pédicule vasculaire avec une pince forte, laissant l’artère tibiale crâniale en place.
NOTE : Le segment osseux vascularisé est maintenant prêt pour le transfert microvasculaire et un défaut d’os tibial de 3,5 cm a été créé dans chaque porcs miniatures de Yucatan. - Ligaturer les vaisseaux crâniens tibiales à la cheville avec polyglactin résorbable 3-0 points de suture, libérant d’un manchon de tissu périvasculaire pour créer un bundle (AV) artério-veineux. Laissez le sutures au moins 5 cm de long pour faciliter l’implantation dans le segment de l’OS tibial.
3. orthotopique OS Tibial VCA Reconstruction en combinaison avec l’angiogenèse chirurgicale
-
Échanger les segments d’os tibial récolté avec ses pédicules nutriments entre les deux animaux s’en servir comme OS OCV.
- Pour permettre le passage du crânienne tibial faisceau artério-veineux (AV) dans le segment de l’OS tibial, enlever le V en forme de segment du site proximal de jonction à l’aide de la scie oscillante.
- Percer un trou de 0,5 cm de diamètre dans la partie distale de la site du défect osseux tibial et dans le canal médullaire du segment osseux tibial et introduire le faisceau AV bénéficiaire qui a été ligaturé distalement, dans le canal intramédullaire pour promouvoir ultérieures autogène approvisionnement de sang neuf.
-
Placer l’OS tibial vascularisé segment orthotopically dans le défaut du destinataire.
- S’anastomosent le pédicule en éléments nutritifs du segment osseux tibial à la branche de muscle disposé du compartiment tibial antérieur d’une manière fin bout en utilisant la technique de suture interrompu simple et de sutures 9-025.
- Confirmer la perméabilité de l’anastomose microvasculaire utilisant le traite de test26.
-
Atteindre ostéosynthèse à l’aide d’un 9 trous 3,5 mm plaque de verrouillage.
- Placer la plaque de 9 trous sur le tibia anteromedially. Fixer la plaque avec trois vis bicorticales au-dessus et en dessous le segment de l’OS tibial. En outre, placer les vis de monocorticales dans le segment de l’OS tibial pour fixation interne. Pour confirmer utilisation correcte du positionnement de l’OS VCA et plaque, antéro-postérieure et latérales radiographies.
- Effectuer des fascias et couches de la peau à l’aide de la fermeture interrompu des sutures résorbables 3-0 et 2-0. Enfin sceller la plaie avec un pansement transparent occlusif.
4. Placement de cathéter veineux central dans la veine jugulaire externe veine
-
Pour l’administration de médicaments post-opératoires et immunosuppresseurs (IS) niveau pharmacovigilance, placer une voie veineuse dans la veine jugulaire externe, en utilisant une technique ouverte. Effectuer le placement à l’issue de la procédure d’allotransplantation sous anesthésie (voir point 1).
- Effectuer une incision de la face antérolatérale du cou avec un scalpel. Disséquer les tissus sous-cutanés avec des ciseaux et exposer la veine jugulaire gauche.
- Placer un cathéter de Hickman dans la veine jugulaire par un petit trou dans la veine jugulaire externe et le fixer avec des sutures non résorbables. Extérioriser le cathéter dans le dos en creusant un tunnel sous la peau.
- Fixer le cathéter en place pour la peau et fermer le cou en couches à l’aide d’interrompu sutures résorbables 3-0 et 2-0.
- Placer des pansements occlusifs sur l’incision. Utilisez un bandage résille pour maintenir les pansements et le cathéter en place.
5. postopératoire traitement et suivi
- Immédiatement après l’opération, traiter les porcs miniatures du Yucatan avec une injection intramusculaire de carprofen (4 mg/kg) pour l’analgésie postopératoire. Administrer la buprénorphine (0,18 mg/kg) pour traiter la douleur de forte intensité selon les besoins.
- Laisser le cochon récupérer pendant 60 min puis retourner le cochon à un pan de l’unité de soins intensifs spéciaux et contrôler étroitement jusqu'à la guérison complète.
- Déplacez les porcs miniatures du Yucatan à la normale en cage et fournissent un accès à l’eau et de nourriture ad libitum.
- Administrer le tacrolimus (0,8 à 1,5 mg/kg/jour) et le mycophénolate mofétil (MMF) (50-70 mg/kg/jour) par voie orale et succinate sodique de méthylprednisolone par voie intraveineuse (en commençant par 500 mg/jour) pendant deux semaines.
- Ajuster les doses quotidiennes de médicaments immunosuppresseurs selon les niveaux sanguins de creux, qui vise à 5.0-30,0 ng/mLde tacrolimus et de 1,0 à 3,5 µg/mL pour le MMF, respectivement. Réduire la dose de méthylprednisolone graduellement jusqu'à atteindre la dose d’entretien de 50 mg par jour.
- Administrer la gentamicine d’antibiotiques prophylactiques (3 mg/kg par voie intraveineuse) et ceftiofur (5 mg/kg par voie intramusculaire) pendant deux semaines.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La technique décrite a été effectuée avec succès en quatre SLA majeur dépareillés Yucatan miniature peste porcine et segmentaires défauts tibiales reconstruits à l’aide de la même taille tibial VCA. Réparation de navire nutriments simultanée de l’allogreffe osseuse et implantation d’un bundle AV de l’animal receveur dans le canal médullaire de l’allogreffe permis circulation osseuse immédiate tant le développement d’une nouvelle offre de sang autologue sur temps (Figure 1). À 16 semaines une circulation de neoangiogenic avait été créée au sein de l’OCV tout tibiales, visualisées par Micro-calculé tomographique (micro-) angiographie après injection d’un polymère angiographique radio-opaque (125 ml) dans les vaisseaux fémoraux et décalcification des le VCA tibial (Figure 2).
Figure 1 : OS tibial orthotopique procédure VCA. Schéma montrant l’intervention chirurgicale. (A) procédure de donateurs : récolte d’un segment de l’OS tibial avec son pédicule en éléments nutritifs. (B) échange des segments osseux tibial entre grand SLA incompatibles des porcs. (C) procédure de destinataire : implantation bundle artério-veineuse : vaisseaux tibiaux crânienne est soigneusement insérée dans le canal médullaire. (D) anastomose microvasculaires du pédicule des éléments nutritifs à la branche de muscle de l’ostéosynthèse tibial antérieur de compartiment et plaque de la diaphyse tibiale. Utilisée avec la permission de la Fondation Mayo pour l’éducation médicale et la recherche. Tous droits réservés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : 3D micro-CT angiographique image représentative d’un segment VCA tibial décalcifiée. La circulation neongiogenic (flèche jaune) est représentée après la perfusion d’une solution de silicon radio-opaque. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Porcs miniatures ne montrés aucun signe de détresse ou d’automutilation. Toutes les plaies cicatrisées sans infection et animaux ambulated normalement, finalement en mesure de supporter tout le poids sur le flanc droit opéré dès le premier jour postopératoire sur. À l’extrémité de l’étude à la 16ème semaine tous les porcs miniatures de Yucatan avaient gagné plus de 150 % de leur poids corporel initial (pretransplant : 56,0 ± 6,1 % versus de 16 semaines après la transplantation : 84.5 ± 6,0).
Deux semaines de l’immunosuppression, composé du tacrolimus, mycophénolate mofétil (MMF) et la méthylprednisolone succinate servaient à maintenir le flux sanguin dans le pédicule en éléments nutritifs jusqu'à ce qu’un nouvel approvisionnement de sang autologue avait été créé au sein de l’allogreffe allogreffe osseuse. Au cours de la semaine 2 immunosuppression sang périodique échantillons ont été prélevés du cathéter Jugulaire pour évaluer les niveaux de sang de drogue. Doses ont été ajustés afin de maintenir des niveaux sanguins creux de 5 à 30 ng/ml pour le tacrolimus et de 1 à 3,5 µg/ml pour le MMF (tableau 1). Aucun médicament n’associés complications se sont produites et visant les concentrations minimales de tacrolimus et mycophénolate mofétil pourrait être obtenu (Figure 3 et Figure 4).
| Immunosuppresseur | Dose initiale | Concentrations minimales | Dose d’entretien |
| Tacrolimus | 0,8 à 1,5 mg/kg/jour | 5 à 30 ng/ml | |
| Mycophénolate mofétil | 50-70 mg/kg/jour | 1-3 µg/ml | |
| Succinate sodique de méthylprednisolone | 500 mg | 50 mg |
Tableau 1 : protocole d’immunosuppression terme à court. Représenté est le protocole immunosuppresseur pour les 2 premières semaines après la transplantation avec la dose initiale de Tacrolimus, mycophénolate mofétil et Prednisolone. En outre visant taux de Tacrolimus et mycophénolate mofétil et la dose d’entretien de la Prednisolone est indiqués.
Figure 3 : Taux sanguins de Tacrolimus. La médiane et l’écart interquartile des niveaux atteints de dépression de Tacrolimus pendant la premières 2 semaines après la transplantation sont représentés. Barres d’erreur indiquent l’écart interquartile. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Taux sanguin de mycophénolate mofétil. La médiane et l’écart interquartile des taux sanguins de mycophénolate mofétil pendant la période d’immunosupression à court terme de 2 semaines sont indiqués. Barres d’erreur indiquent l’écart interquartile. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Malgré la cessation de l’immunosuppression après deux semaines, une évaluation radiologique périodique à des moments différents (2, 4, 6, 10 et 16 semaines) du membre postérieur droit opéré avec les rayons x ont révélé osseuse progressive de guérison au cours de l’étude période de 16 semaines de classés par catégorie deux observateurs indépendants et aveuglés (Figure 5)27,28. Analyse micro-CT au 16ème semaines a été utilisé pour quantifier le volume et la densité de cals, mais aussi combler la formation osseuse au jonctions VCA hôte/OS et OS VCA allogreffes apparence27. Maintien de la fixation interne sans perte de réduction ou de perdre, promue par la nouvelle offre de sang autologue, pourrait être démontrée28. Union osseuse a été atteint dans tous les tibias (Figure 6).
Figure 5 : Osseuse guérison progression pendant 16 semaines. Pour définir l’OS guérison progression un modèle de régression non linéaire a été utilisée. La valeur R2 a été utilisé pour définir l’ajustement du modèle aux données. À l’aide d’un système de notation, basée sur la radiographie antéro-postérieure et latérale, l’ostéo-intégration de l’OS que VCA dans l’anomalie osseuse segmentaire a été marqué avec une valeur maximale de 25 points en des temps différents points au cours de la période d’étude (2, 4, 6, 10 et 16 semaines) par deux des observateurs indépendants et aveuglés30,31. Le modèle de régression non linéaire représente la médiane et l’écart interquartile pour l’OS guérison des valeurs au cours de la période d’étude (R2 = 0.931) montrant un OS continu la progression se rapprochant de la valeur de 25 à 16 semaines de guérison. Barres d’erreur indiquent l’écart interquartile. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Reconstruction tridimensionnelle de la diaphyse tibiale porcine après évaluation tomographique calculée micro. Représentant en trois dimensions calculées image du tibia reconstitué avec fixation plaque interne à 2 x la taille réelle. À 16 semaines toutes l’union après que l’OS tibial OCV avec angiogenèse chirurgicale est indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
L’analyse histologique sur l’hématoxyline-éosine enrobement teinté de sections, à l’aide d’une échelle décrite précédemment classement rejet (aucun, légère, modérée ou sévère) a révélé aucun signe de rejet sévère, auquel cas légères et modérées des signes de rejet pourraient être démontré dans trois cochons (Figure 7)29.
Figure 7 : Une image représentative d’une horizontale de l’hématoxyline-éosine teinté de section d’un VCA tibial. Silicon radio-opaque est des bateaux remplis de solution affichée brun (astérisque). Légère infiltration endostéale et réaction (flèche épaisse) est vu avec plus des deux tiers des lacunes remplis d’ostéocytes (petite flèche) conformément à l’OS viable. Grossissement de 10 X. Echelle = 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La greffe vascularisée osseuse allogénique (OS VCA) peut représenter une option future reconstructive pour les gros défauts osseux segmentaires. Toutefois, la nécessité de long-terme-immunosuppression (NP) et ses effets secondaires importants requis pour OS survie VCA sont difficiles à justifier ces non-vie-critique-applications6.
Bien que les souches consanguines du rat de laboratoire ont été largement utilisés dans la recherche d’allotransplantation pour tester différentes approches pour éviter de long-terme-immunosuppression, modèles porcins peuvent fournir des avantages significatifs8,9 . Le cochon mini Yucatan est idéal pour l’étude du processus complexe d’os rejet VCA. Physiologiquement, le nouveau taux de formation osseuse est comparable à l’homme (porcs 1,2 à 1,5 µm par jour ; les humains 1,0-1,5 µm par jour respectivement)32. Des similitudes anatomiques permettent l’utilisation de reconstruction osseuse d’orthotopique utilisant des techniques et des implants chirurgicaux essentiellement identiques. Peut-être plus important encore, l’alloresponse porcine bien défini-rendues possibles par les progrès réalisés dans la détection de cytokines porcines et le développement des anti-porcine cluster de différenciation anticorps-fait cela et autre VCA études plus rigoureuses33.
Comme dans n’importe quelle application clinique similaire, la méthode de reconstruction de défaut OS tibial porcine utilisant OS que VCA est techniquement difficile, nécessitant deux équipe approche avec suffisamment d’expertise chirurgicale en chirurgie microvasculaire et OS de reconstruction afin de obtenir des résultats reproductibles. Strict maintien de conditions peropératoires stériles et antibioprophylaxie périopératoire sont obligatoires pour diminuer le risque de complications infectieuses.
Dans des études précédentes à l’aide des rats et des lapins à court terme est maintenu viabilité des greffons osseux vascularisé dans les 2 premières semaines par perfusion de l’OS VCA dans son vaisseau en nutriments allogénique. Une fois que destinataire retrait immunosuppression dérivé navires dans le canal médullaire fourni néovascularisation permettant la guérison VCA osseuse à long terme et la viabilité de11,10,12. Au point de terminaison étude, allogreffe substantielle chimérisme pourrait être détecté34,35,,36. Nous avons progressé et appliqué notre méthode bien établie rat et le lapin sur le modèle porcin. Ce modèle n’est possible de tester un nouveau moyen pour maintenir la viabilité des tissus sans IS à long terme dans la recherche sur les VCA, à l’aide chirurgicale angiogenèse implanté navires autogène combiné avec IS à court terme, commutation efficacement la circulation de l’os de allogéniques aux navires autogènes.
Un avantage majeur de ce modèle sur les autres OS porcine existant contenant des modèles VCA est sa conception de l’orthotopic permettant une évaluation fonctionnelle du roulement de poids et l’évaluation des propriétés mécaniques, les données qui sont particulièrement rares14, 37. le mécanisme complex d’os locales et systémiques rejet VCA soit contrôlable facilement à travers l’évaluation radiologique et histologique du segment osseux tibial allotransplanted ainsi que des analyses biologiques moléculaires du sang périphérique. Finalement, la faible morbidité de la procédure VCA chirurgical permet osseuse à long terme la survie VCA et analyse.
Fixation interne stable, OS tibial allogéniques segment apposition et branche alignement sont cruciales pour permettre la marche des cochons sur le premier jour postopératoire et nécessitent une planification préopératoire minutieuse. La méthode que nous avons sélectionné à l’aide d’un gabarit de coupe conçu spécial pour résection osseuse précise et reproductible, combinée avec ostéosynthèse plaque est suffisamment stable pour permettre une fixation rigide dans greffons, même dans ceux avec l’inadéquation de la taille minimale.
Une des limites de la technique présentée est qu’elle ne permet pas d’évaluation des éléments de différents tissus comme la peau et des muscles en plus de la composante osseuse vascularisée. Alors qu’un lambeau composite comprenant des composants de différents tissus est possible, ce modèle a été conçu pour étudier l’allogreffe osseuse exclusive que l’immunogénicité des différents composants tissulaires VCA varie de38.
En conclusion, cet article fournit des informations permettant d’établir un modèle animal grand reproductible avec génétique définie pour OS recherche VCA. Ce modèle peut servir de base pour futures études portant sur l’influence de l’angiogenèse chirurgicale sur OS du débit sanguin et le remodelage osseux et pourrait éliminer la nécessité de l’immunosuppression à long terme. En outre, il peut être utilisé pour délimiter le processus complexe d’os rejet VCA et tester d’autres stratégies novatrices de modulateurs immunitaires. Définis SLA-haplotypes et la quantification des gènes SRY chez les porcs sexe-incompatibles peuvent permettre de détermination de l’étendue de chimérisme des allogreffes et du sang périphérique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Division des médias Support Services, Mayo Clinic : Rochester, MN pour la production vidéo, ainsi que Georgios Kotsougianis pour le montage de la vidéo. L’excellente oeuvre a été réalisée par Jim Postier, Rochester, MN. En outre, les auteurs tiennent à remercier la Fondation allemande de recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft) pour la fourniture de soutien salarial pour Dr Dimitra Kotsougiani (subvention DFG : KO 4903/1-1). Ce travail a été soutenu par un don généreux de Tarek E. Obaid. Ce travail a été effectué dans le laboratoire de recherche microvasculaire, Département d’orthopédie chirurgie Mayo Clinic : Rochester, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
