Summary
В настоящее время какой-либо васкуляризированной композитный аллотрансплантация зависит от долгосрочной-перспективе-иммуносупрессия, сложно поддерживать для жизни критических указаний. Мы представляем новую свинину большеберцовых VCA модель, которая может использоваться для изучения кости VCA и демонстрируют использование хирургических ангиогенеза для поддержания жизнеспособности кости без необходимости долгосрочной иммунной модуляции.
Abstract
Сегментные костной потери в результате травмы, инфекции злокачественности и Врожденная аномалия остается серьезной проблемой реконструктивной. Текущий терапевтических варианты имеют значительный риск неудачи и существенной заболеваемости.
Использование костей васкуляризированной композитный аллотрансплантация (VCA) будет предлагать как близкое соответствие резекции кости размер и форму и исцеления и Ремоделирование потенциал жизни кости. В настоящее время требуется пожизненный наркотиков иммуносупрессией (IS). Органа токсичности, оппортунистических инфекций и новообразований риски представляют интерес для лечения таких нелетального указаний.
Ранее мы показали, что жизнеспособность VCA костей и суставов могут поддерживаться у крыс и кроликов без необходимости долгосрочной перспективе иммуносупрессии имплантации получателя производного судов в пределах VCA. Она генерирует Автогенная, neoangiogenic обращения с измерению потока и активные кости Ремоделирование, требующих есть только 2 недели. Как мелких животных отличаются от человека существенно в анатомии, физиологии кости и иммунологии, мы разработали модель VCA свиные кости Оценить эту технику до клинического применения. Миниатюрные свиньи в настоящее время широко используются для аллотрансплантация исследований, учитывая их иммунологические, анатомические, физиологические и размер сходства к человеку. Здесь мы опишем новый большеберцовой кости свиные ортотопическая VCA модель для проверки роли автогенный хирургических ангиогенеза для поддержания жизнеспособности VCA.
Модели реконструирует сегментарный большеберцовой кости дефектов с помощью совпадают размер и форму аллогенной большеберцовой кости сегментов, пересаженные через основные свиной лейкоцитарного антигена (SLA) несоответствие в Юкатан миниатюрные свиньи. Ремонт питательных судна и имплантации получателя производного автогенный судов в мозгового канала аллогенной большеберцовой кости сегментов производится в сочетании с одновременным краткосрочных IS. Это позволяет neoangiogenic автогенные циркуляции развивать от имплантированных ткани, поддержание потока через аллогенной питательных судов на короткое время. После того, как установлено, новый автогенный циркуляции поддерживает жизнеспособность кости после прекращения лекарственной терапии и последующих питательных веществ судно тромбоза.
Introduction
Большие сегментарный костных дефектов в результате травмы, инфекции или конечности щадящей хирургии после злокачественности. Текущие параметры реконструктивной как васкуляризированной автогенный костной пластики, кости транспорт, ортопедическая замены и криоконсервированных некротические аллотрансплантантов, используется отдельно или в сочетании, связаны с значительным заболеваемости и имеют высокие показатели осложнения в1,2,3.
Наличие микрососудистой сети имеет важное значение для формирования и гомеостаза кости, поддерживая остеогенные, хондрогенном и мезенхимальных стволовых клеток, необходимых для ремонта костей4.
Трансплантации живых аллогенной кости, форма васкуляризированной композитные ткани аллотрансплантация (кости VCA), выступал с микрохирургической анастомоза питательных ножке, может представляют собой будущего реконструктивной альтернативу. Как аллогенных криоконсервированных кость немедленное стабильность обеспечивается тесно соответствие костного дефекта морфологии. Как автогенной васкуляризированной трансплантата, он обеспечивает расширение исцеления и реконструкции жизни костной ткани. Препятствием в любой процедуре аллотрансплантата остается необходимость долгосрочной перспективе иммуносупрессией (IS). Эта проблема более остро стоит в опорно-тканей, которые требуют 2 - 3 раза больше, чем трансплантации5доз наркотиков. Сопутствующие риски, включая органа токсичности, злокачественности, инфекции или развитие трансплантат – versus – хост болезни трудно оправдать эти находившимися критической приложения6. Однако эпизоды острого и хронического отказа остаются серьезной проблемой с текущей долгосрочной является7. Текущие усилия тесно матч антигены гистосовместимости, побудить доноров конкретных терпимости и/или улучшить наркотиков иммунотерапия не пока еще не удалось регулярно разрешительные клинических ткани без наркотиков выживания8,9.
Ранее мы продемонстрировали средства для поддержания кости VCA жизнеспособность и повысить костного ремоделирования в небольших животных моделях, продвижение новой автогенный циркуляции в трансплантированы кости. Это делается путем дополнительного использования хирургических ангиогенеза имплантированных автогенный ткани10,11,12. Аллогенная кости сегменты пересаживают microsurgically с анастомоза ножке сегмент питательных веществ кости. Кроме того хост производные судов вживляются в мозгового канала аллогенной васкуляризированной кости сегмента. В ходе этого процесса 2 недели проходимость аллогенной питательных судна поддерживается с наркотиками иммунодепрессией. После IS-вывода питательных ножке будет в конечном итоге thrombose13. Новая кровать капилляров, основанный на хост производные судов обеспечивает достаточную циркуляцию для поддержания жизнеспособности тканей. Кости Исцеление и Ремоделирование усиливаются с остеогенез и ангиогенеза, спаренных10,,1112. Без дальнейших иммунотерапия требуется и кости жизнеспособность поддерживается долгосрочный несмотря на иммунологически компетентным хост и отсутствие конкретных доноров терпимости.
Перевод этого романа метода аллотрансплантация кости в клиническую практику лучше всего должно предшествовать дальнейшего изучения исцеления, механических свойств и иммунологии в большой модели на животных. Свинину модель идеально подходит для таких VCA исследований14,,1516. Миниатюрные свиньи сопоставимы по размеру и анатомии человека, позволяя скелетных реконструкции с использованием идентичных хирургических имплантатов и методов. Свиней иммунологии хорошо определены, включая свиной лейкоцитарного антигена (SLA) гаплотипов и типы крови, необходимые для трансплантационной хирургии. Клеток линии исследования возможны с трансплантации секс несоответствие, поскольку подробные анализы иммунных реакций17,18,19,,2021.
Здесь мы описываем модель аллотрансплантация VCA кости в Юкатан миниатюрные свиньи, подходит для изучения сегментарный костной потери и восстановления. Эта модель может использоваться для изучения взаимодействия хирургической ангиогенеза и краткосрочных IS на кости VCA выживания и функции, включая линии остеоциты, кость кровотока, исцеление и реконструкцию мощностей, alloresponsiveness и биомеханики также, как для Проверьте другие инновационные иммунной модулирующее стратегии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Rochester Mayo клинике. Юкатан миниатюрные свиньи выступающей в качестве доноров и получателей помощи во время этой хирургической процедуры VCA. Спаривание доноров и получателей помощи была основана на ДНК последовательность свиной лейкоцитарного антигена (SLA) предимплантационному для обеспечения основных несоответствия в SLA 22,23. Возраст и вес соответствием и одинакового типа крови животных. Два хирургических команд одновременно собирают сегмент свинину большеберцовой кости с его питательных веществ судно от донора и подготовил получателя для получения сегмента orthopically размещены аллогенной большеберцовой кости. Одновременно с микрососудистой ремонт судна питательных веществ костей, получатель производные артериовенозных пучок был помещен в большеберцовых сегмент для автогенной ангиогенеза.
1. Прехирургическая препараты
- Быстро Юкатан миниатюрные свиньи за день до процедуры и взвесить их для контролируемых медикаментов.
- Степенный животных с Ксилазина (2 мг/кг) и комбинация tiletamine HCL и zolazepam HCL (5 мг/кг), подкожно.
- Периферического катетера в ухо Вену для потребителей инъекционных наркотиков и физиологическим доставки и администрировать бупренорфин (0,18 мг/кг) и профилактическое применение антибиотиков (1 g cefazoline внутривенно и 5 мг/кг Цефтиофур внутримышечно).
- Брить право задних конечностей и левой шеи, который будет служить в качестве урожая сайт для сегмента васкуляризированной большеберцовой кости и сайт для размещения центрального венозного катетера, соответственно.
- Проверьте жизненно важные признаки и уровень седации, тестирование релаксация мышц рта.
- Интубировать животное с соответствующего размера эндотрахеальную трубку в грудной recumbency24.
- Перенесите миниатюрные свиньи в операции и подключиться к вентилятор машину для поддержания анестезии, управляющей изофлюрановая (1-3%).
- Подтвердите глубины анестезии, тестирование глазной, зрачковый рефлексы света и роговицы.
- Насыщение кислородом в монитор с Импульсный оксигемометр передачи зонд уха. Используйте кровяного давления манжеты и температуры зонда для мониторинга интраоперационной жизненно важных признаков.
- Место Юкатан миниатюрные свиньи в лежачем положении на потепление площадку. Кроме того используйте одеяло потепления приточно-во время операции для предотвращения переохлаждения.
- Используйте мазь ветеринар на глазах для предотвращения сухости под наркозом.
2. урожай сегмент васкуляризированной большеберцовой кости
- Вымойте правую ногу по каждой миниатюре свиней с повидон йод раствор. Сухой кожи стерильной салфеткой и драпировка конечности в стерильных моды. Конверт и изолировать конечности с пропитанной клеем разрез Пелерина йода для сведения к минимуму риск загрязнения.
- Выполните надрез с anterolaterally скальпель в задних конечностей, начало в коленном суставе, расширяя дистально вдоль хребта передней голени в tibiotalar суставе.
- Рассечения кожи и подкожной клетчатки с ножницами и отозвать передний отсек мышцы от большеберцовой кости латерально.
Примечание: Релиз происхождения мышц передней tibialis облегчает экспозиции. В настоящее время подвергается межкостной мембраны. - Идентифицировать черепа большеберцовых артерии и Вены (которые затем будут использоваться как артериовенозные комплекта для хирургического ангиогенеза).
Примечание: Черепной большеберцовых артерии и Вены лежат на поверхности передней межкостной мембраны. - Для улучшения оперативного поля зрения, освободить часть от большеберцовой мышцы передней от его вставки и удаления части хребта большеберцовой кости с помощью осциллирующих пила.
- Защиты черепной большеберцовых судов, надрезать межкостной мембраны начала на уровне голени бугорок с ножницами.
- Визуализируйте хвостового большеберцовых судов, дистально работает под мембрану.
Примечание: Они филиала из черепной большеберцовых судов и порождают питательных ножке диафиза большеберцовой только дистальнее бугорка. Это теперь можно визуализировать питательные отверстия и суда, заходящие голени на его задней боковой поверхности просто дистальной части большеберцовой бугорка. - Тег питательных ножке с microclamp. Не отсоединяйте сосудистой ножке.
- Определить мышцы ветвь в отсеке передней большеберцовой кости вблизи питательные отверстия; Это может использоваться для анастомоза с васкуляризированной кости аллотрансплантата питательных веществ судном. Марк мышечные ветви с microclamp.
-
Урожай 3,5 см большеберцовой кости сегмента, включая сосудистой ножке.
- Используйте джиг резки для обеспечения точного и воспроизводимого кости резекции. Положение и исправить резки джиг на медиальной поверхности голени включить питательные отверстия и судов.
- Руководствуясь джиг, выполняют параллельно кости отрубы с осциллируя пила удалить сегмент большеберцовых 3,5 см. Используйте те же позиционирования и джиг для доноров и получателей животных максимизировать размер и форма матч.
- Используйте джиг резки для обеспечения точного и воспроизводимого кости резекции. Положение и исправить резки джиг на медиальной поверхности голени включить питательные отверстия и судов.
- После того, как оба сокращений были сделаны с Осциллирующий станок, вращение большеберцовой кости сегмент для визуализации питательных ножке на задней поверхности. Разделите питательных ножке на ее происхождение из черепной большеберцовых артерии с ножницами. Вскрыть и свободной большеберцовых сегмент с ножницами, оставляя тонкий манжеты надкостницы и мышцы на его поверхности.
- Отказаться от своего сегмента большеберцовой кости и поднять сегмента большеберцовой кости с его сосудистой ножке с острым зажим, оставляя черепные артерии большеберцовой кости в месте.
Примечание: Сегмент васкуляризированной кости теперь готова к микрососудистой передачи и дефектом большеберцовой кости 3,5 см была создана в каждом Юкатан миниатюрные свиной. - Перевязать черепной большеберцовых судов на голеностоп с рассасывающиеся полиглактин швов 3-0, освобождая их с манжетой периваскулярной ткани для создания комплекта артериовенозных (AV). Отпуск швы по крайней мере 5 см в длину для облегчения имплантации в сегменте большеберцовой кости.
3. ортотопическая большеберцовой кости VCA реконструкции в сочетании с хирургическим ангиогенеза
-
Обмен сегментов заготовленной большеберцовой кости с его питательных ножек между двух животных, чтобы использовать их как кость VCAs.
- Чтобы разрешить прохождение комплекта черепной большеберцовых артериовенозных (AV) в сегменте большеберцовой кости, удалите V-образные сегмент от проксимальных Джанкшен сайта с помощью осциллирующих пила.
- Просверлите отверстие диаметром 0,5 см в дистальной части сайта дефект большеберцовой кости и в мозгового канала сегмента большеберцовой кости и ввести получателя AV bundle, который был лигируют дистально, в intramedullary канала для поощрения последующих самоизмельчения Новая кровоснабжение.
-
Место orthotopically сегмент васкуляризированной большеберцовой кости в получателя дефект.
- Анастомозируют питательных ножке большеберцовой кости сегмента в филиал подготовленные мышцы голени передний отсек в конце до конца манере с использованием метода простой Прерванный шовные и 9-0 швы25.
- Подтвердите проходимость микрососудистых анастомозов, используя доения тест26.
-
Достижения остеосинтез с использованием 9-отверстие 3,5 мм стопорная пластина.
- Место 9-луночное плиты на anteromedially голени. Пластина с тремя винтами bicortical выше и ниже сегмента большеберцовой кости. Кроме того место unicortical винты в сегменте большеберцовой кости для внутренней фиксации. Для подтверждения правильного позиционирования кости VCA и плита, использовать переднезаднем и боковых рентгенограммах.
- Выполните фасциальных и слоистых кожи с помощью закрытия прерван 3-0 и 2-0 рассасывающиеся швы. Наконец, уплотнение раны с окклюзионной прозрачный Туалетная.
4. Центральный венозный катетер размещение в шейных вен внешний
-
Для послеоперационных медикаментов и иммуносупрессивные (IS) наркотиков мониторинга уровня поместите венозный катетер в внешней яремной открытым методом. Выполните размещение по завершении процедуры аллотрансплантация под наркозом (см. раздел 1).
- Выполните надрез переднебоковой в шею с помощью скальпеля. Вскрыть подкожной клетчатки с ножницами и разоблачить левой яремной вены.
- Поместите Хикман катетер в яремную Вену через небольшое отверстие в внешней яремной вены и закрепите его с не рассасывающиеся швы. Неубранной катетер в спину путем туннелирования подкожно.
- Безопасные катетер на месте на коже и закрыть шеи в слои с помощью прервана 3-0 и 2-0 рассасывающиеся швы.
- Место разреза окклюзионной повязки. Использование ажурные повязку держать бинты и катетер на месте.
5. послеоперационное лечение и последующие действия
- Сразу же после операции лечить свиной миниатюрные Юкатан с внутримышечной инъекции carprofen (4 мг/кг) для послеоперационного обезболивания. Администрировать бупренорфин (0,18 мг/кг) для лечения боли, высокой интенсивности, при необходимости.
- Разрешить свинья восстановить 60 мин и затем вернуть свинья Пан специальное отделение интенсивной терапии и контроля за тесно до полного выздоровления.
- Переместите Юкатан миниатюрные свиньи к нормальной клетки и обеспечивают ad libitum доступ к воде и пище.
- Администрировать такролимуса (0,8-1,5 мг/кг/сут) и Микофенолата мофетил (ММФ) (50-70 мг/кг/день) устно и метилпреднизолон сукцинат натрия внутривенно (начиная с 500 мг/день) за две недели.
- Отрегулируйте ежедневной дозы приёма иммуносупрессивных препаратов по данным корыта крови, направленных для 5.0-30,0 нг/млжелезо и 1,0-3,5 мкг/мл для MMF, соответственно. Снижение дозы метилпреднизолона постепенно до достижения поддерживающей дозы 50 мг в день.
- Администрировать профилактическое применение антибиотиков гентамицина (3 мг/кг внутривенно) и Цефтиофур (5 мг/кг внутримышечно) за две недели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описывается методика была успешно проведена в четырех ОАС основных несоответствие Юкатан миниатюрные свиньи и сегментные большеберцовых дефектов, реконструкции, используя размер соответствует большеберцовых VCA. Одновременная питательных веществ судно ремонт аллотрансплантата кости и имплантации AV пачки от получателя животных в пределах аллотрансплантата мозгового канала разрешено немедленное кости циркуляции и развития новой газовой кровоснабжение над время (рис. 1). В 16 недель neoangiogenic тираж был создан в рамках всех большеберцовых VCAs, визуализированное Микро Компьютерная томография ангиография (микро CT) после инъекции контрастного вещества ангиографические полимера (125 мл) в бедренных сосудов и декальцинации из большеберцовых VCA (рис. 2).
Рисунок 1 : Ортотопическая большеберцовой кости процедура VCA. Диаграмма, показывающая хирургической процедуры. (A) процедура доноров: урожай сегмента большеберцовой кости с его питательных ножке. (B) обмен большеберцовой кости сегментов между основными ОАС несоответствие свиней. (C) процедура получатель: артериовенозных расслоение имплантации: черепной большеберцовых сосуды тщательно вставляются в мозгового канала. (D) микрососудистых анастомозов питательных ножке мышц ветви передней большеберцовой отсека и пластины остеосинтеза диафиза большеберцовой кости. Используется с разрешения фонда Майо для медицинского образования и научных исследований. Все права защищены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель 3D микро CT ангиографические изображение decalcified сегмента большеберцовых VCA. Neongiogenic тираж (желтая стрелка) изображен после перфузии раствором контрастного вещества кремния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Миниатюрные свиньи не проявлял никаких признаков бедствия или членовредительства. Все раны без инфекции и животных ambulated как правило, в конечном счете способны нести полный вес на эксплуатируемых правой конечности от первого послеоперационного дня на. В конечной точке исследования на 16-й недели все Юкатан миниатюрные свиньи получили свыше 150% от их первоначального веса тела (pretransplant: 56.0 ± 6,1 по сравнению с 16 недель posttransplant: 84,5 ± 6.0).
Две недели иммуносупрессии, состоящий из такролимус, поддерживать поток крови через питательных ножке, до тех пор, пока в рамках аллогенной был создан новый автогенный кровоснабжение использовались Микофенолата мофетил (ММФ) и метилпреднизолон сукцинат аллотрансплантата костей. В течение недели, 2 иммуносупрессии периодические крови были взяты из югулярной катетер для оценки препарата в крови. Дозы были скорректированы для поддержания уровня крови через 5-30 нг/мл для Такролимус и 1-3,5 мкг/мл для MMF (Таблица 1). Без наркотиков осложнений произошло и направленные через уровни для Такролимус и Микофенолата мофетил может быть достигнуто (рис. 3 и рис. 4).
| Иммунодепрессанты | Начальная доза | Корыто уровни | Поддерживающая доза |
| Такролимус | 0,8-1,5 мг/кг/сутки | 5-30 нг/мл | |
| Микофенолата мофетил | 50-70 мг/кг/день | 1-3 мкг/мл | |
| Метилпреднизолон сукцинат натрия | 500 мг | 50 мг |
Таблица 1: короткий срок иммуносупрессии протокол. Изображен иммуносупрессивные протокол для первых 2 недель пост пересадки с начальная доза для такролимус, Микофенолата мофетил и преднизолон. Указаны дополнительно направлены через уровни для Такролимус и Микофенолата мофетил и поддерживающей дозы преднизолона.
Рисунок 3 : Через уровни в крови для такролимуса. Медиана и межквартильный диапазон уровней достигнутые корыто для Такролимус за первые 2 недели поста трансплантации изображены. Планки погрешностей обозначают межквартильный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Через уровни в крови для Микофенолата мофетил. Медиана и межквартильный диапазон корыта крови Микофенолата мофетил в течение краткосрочного иммуносупрессии 2 недели отображаются. Планки погрешностей обозначают межквартильный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Несмотря на прекращение иммуносупрессии после двух недель, периодические радиологической оценки в разное время точках (2, 4, 6, 10 и 16 недель) эксплуатируемых правой задние конечности с Рентген показал прогрессивного кости Исцеление через исследование периода 16 недель, когда градуированные по два независимых и ослепленный наблюдателей (рис. 5)27,28. Для количественной оценки объема и плотности каллуса, а также преодоление формирования костей на перекрестки VCA хост/кость и кость VCA аллотрансплантата внешний вид27использовался анализ микро-CT в 16-й недели. Обслуживание внутренней фиксации без потери сокращения или утраты, пропагандируемые новой газовой кровоснабжение, может быть продемонстрирована28. Костные союз был достигнут в всех tibias (рис. 6).
Рисунок 5: Кость заживление прогрессии более 16 недель. Использовался для определения кости Исцеление прогрессии модель нелинейной регрессии. Значение R2 был использован для определения соответствия модели данных. С помощью системы скоринга, основанный на переднезаднем и боковых рентгенограммах остеоинтеграции кости, которую VCA в сегментарно кости дефект был забит с максимальным значением 25 очков в разное время очка за период исследования (2, 4, 6, 10 и 16 недель) на два независимые и ослепленный наблюдателей30,31. Нелинейная регрессионная модель изображает медиана и межквартильный диапазон для кости Исцеление значения за период исследования (R2 = 0.931) показаны непрерывной кости Исцеление прогрессии, аппроксимирующей значение 25 в 16 недель. Планки погрешностей обозначают межквартильный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Трехмерная реконструкция после микро компьютерная томография оценки диафиза большеберцовой кости свиные. Представитель трехмерной вычисляется изображение реконструированный голени с креплением внутренние пластины на 2 x фактический размер. В 16 недель завершить союз после того, как показано большеберцовой кости VCAs с хирургической ангиогенеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Гистологический анализ на undecalcified гематоксилином эозином окрашенных разделы, используя ранее описанные шкалу классификации отклонения (нет, легкой, умеренной и тяжелой) показали никаких признаков серьезные отклонения, whereby может быть мягкой и умеренной признаки отказа продемонстрирована в три поросенка (рис. 7)29.
Рисунок 7: Представитель изображения горизонтальных гематоксилином эозином окрашенных раздел большеберцовых VCA. Рентгеноконтрастные кремния, которые заполнены решения судов являются отображается Браун (звездочка). Мягкая endosteal инфильтрации и реакции (толстая стрелка) рассматривается с более двух третей из лакун, наполненный остеоциты (маленькая стрелка) в соответствии с жизнеспособным кости. 10 крат. Шкалы бар = 300 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трансплантации аллогенных васкуляризированной кости (кости VCA) может представлять будущее реконструктивной вариант для больших сегментарный костных дефектов. Однако необходимость долгосрочной перспективе иммуносупрессией (IS) и его значительные побочные эффекты для кости VCA выживания трудно оправдать эти находившимися критической приложения6.
Хотя инбредных штаммов Лаборатория Крыса широко использовались в аллотрансплантация исследования для проверки различных подходов для избежания долгосрочной перспективе иммуносупрессии, свинину модели могут обеспечить значительные преимущества8,9 . Мини-свиньи Юкатан идеально подходит для изучения сложного процесса кости VCA неприятие. Физиологически, скорость формирования новой кости сопоставима с человеком (свиней 1,2-1,5 мкм в день; людей 1,0-1,5 мкм в день соответственно)32. Анатомические сходства позволяют использовать ортотопическая реконструкции кости с использованием идентичных хирургических имплантатов и методов. Возможно самое главное, четко свиные alloresponse-сделал возможной прогресс в свинину цитокина обнаружения и развития анти свинину Кластер дифференцировки антител делает это и другие VCA изучает более строгий33.
Как и любого аналогичного клинического применения, метод реконструкции дефектов свинину большеберцовой кости с помощью кости, который является технически сложным VCA, требующих два команды подход с достаточного опыта хирургического микрососудистой хирургии и кость реконструкции, с тем чтобы воспроизводимые результаты. Строгое соблюдение интраоперационной стерильной и Периоперационная Антибиотикопрофилактика обязательны для уменьшения риска инфекционных осложнений.
В предыдущих исследованиях с использованием крыс и кроликов краткосрочных является сохранить жизнеспособность васкуляризированной кости allotransplants в первые 2 недели через перфузии кости VCA через его аллогенной питательных судна. После иммуносупрессии вывода получателя производного судов в рамках мозгового канала предоставили неоваскуляризации, позволяя долгосрочное исцеление кости VCA и жизнеспособности10,,1112. В конечной точке исследования существенные аллотрансплантата химеризма могут быть обнаружены34,35,36. Мы продвинулись вперед и применяется методика устоявшихся крыс и кроликов на свинину модели. Эта модель является осуществимым для тестирования новых средств для поддержания жизнеспособности тканей без долгосрочных IS в кости VCA исследований, используя хирургические ангиогенеза с имплантированным автогенный судов, в сочетании с краткосрочной IS, эффективно переключения циркуляцию кость от Аллогенная автогенный судов.
Основное преимущество этой модели более других существующих свиные кости, содержащие VCA модели является его дизайн ортотопическая, позволяя функциональной оценки веса подшипника и оценки механических свойств, данные, которые являются особенно редкие14, 37. сложный механизм местных и системных кости VCA отказ может легко контролироваться радиологический и гистологических оценки сегмента allotransplanted большеберцовой кости, а также молекулярный биологический анализ периферической крови. В конечном итоге низкой заболеваемости хирургической кости VCA процедуры позволяет кости долгосрочного выживания VCA и анализ.
Стабильной внутренней фиксации, выравнивание приложение и конечности сегмент надлежащего аллогенной большеберцовой кости имеют решающее значение для позволяют передвигаться свиней на первые сутки и требуют тщательного планирования, прехирургическая. Метод, который мы выбрали с помощью jig специальным дизайном резки для точного и воспроизводимого кости резекции, в сочетании с пластиной остеосинтеза является достаточно стабильным для жесткого связывания в allotransplants, даже в тех, кто с минимальным размер несоответствия.
Одно ограничение представленной техники является, что она не позволяет оценить компонентов различных тканей кожи и мышц помимо васкуляризированной костного компонента. Хотя возможен композитный лоскут, включая компоненты различных тканей, эта модель была разработана для изучения эксклюзивные кости аллотрансплантация иммуногенности различных VCA ткани compontents изменяется38.
В заключение эта статья содержит сведения для создания воспроизводимых крупных животных модели с определенными генетика для кости VCA исследований. Эта модель может служить основой для будущих исследований, изучения влияния хирургической ангиогенез на кости поток крови и костного ремоделирования и может устранить необходимость долгосрочной иммуносупрессии. Кроме того она может использоваться для разграничения сложный процесс кости VCA неприятие и тестирования других новаторских стратегий иммунной модулирующее. Определенного SLA-гаплотипов и количественной оценки SRY-генов в секс несоответствие свиней может разрешить определение степени химеризма аллотрансплантата и периферической крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Отдел средств массовой информации услуг по поддержке, Mayo Клинике Рочестер, MN для видео производства, а также Георгиос Kotsougianis для редактирования видео. Отличные иллюстрации был проведен Jim Postier, Рочестер, Миннесота. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить немецкого фонда научных исследований (Deutsche Forschungsgemeinschaft) для оказания поддержки зарплата доктора Димитра Kotsougiani (DFG Грант: KO 4903/1-1). Эта работа была поддержана щедрый подарок от Tarek E. Обаид. Эта работа была выполнена в микрососудистой научно-исследовательской лаборатории, Департамент из ортопедической хирургии Mayo Клинике Рочестер, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
