Summary
Jede Art von vaskularisierte zusammengesetzte Allotransplantation hängt derzeit long-term-Immunsuppression, schwer, für nicht-Leben-kritische Hinweise zu unterstützen. Wir präsentieren ein neues Porcines tibiale VCA-Modell, das Knochen VCA zu studieren und demonstrieren den Einsatz von chirurgischen Angiogenese weiterhin Knochen Rentabilität ohne die Notwendigkeit der langfristigen immun-Modulation verwendet werden kann.
Abstract
Segmentale Knochenschwund infolge Trauma, Infektion Bösartigkeit und kongenitale Anomalie bleibt eine große rekonstruktive Herausforderung. Aktuelle Therapieoptionen haben erhebliches Risiko des Scheiterns und erhebliche Morbidität.
Verwendung des Knochens durchblutet zusammengesetzte Allotransplantation (VCA) böte sowohl eine enge Übereinstimmung des resezierten Knochen Größe und Form und Heilung und das Potenzial des lebenden Knochens umgestaltet. Derzeit ist die lebenslange Droge Immunsuppression (IS) erforderlich. Orgel-Toxizität, opportunistische Infektion und Neoplasma Risiken sind von Bedeutung für solche nicht-tödliche Indikationen zu behandeln.
Wir haben bereits gezeigt, dass Knochen und Gelenke VCA Lebensfähigkeit bei Ratten und Kaninchen ohne die Notwendigkeit des long-term-Immunsuppression durch Implantation von Empfänger abgeleiteten Schiffen innerhalb der VCA aufrechterhalten werden kann. Es erzeugt eine autogene, Neoangiogenic Verkehr mit messbaren Fluss und aktive Knochen umgestaltet, wonach nur 2 Wochen IS. Wie kleine Tiere von Mann in Anatomie, Physiologie der Knochen und Immunologie erheblich abweichen, entwickelten wir ein VCA porcinen Knochenmodell um diese Technik zu bewerten, bevor klinischer Anwendung durchgeführt wird. Miniatur-Schweine sind derzeit für Allotransplantation Forschung, angesichts ihrer immunologischen, anatomischen, physiologischen und Größe Ähnlichkeiten zum Menschen verbreitet. Hier beschreiben wir einen neue porcinen orthotopen tibiale Knochen VCA-Modell zu testen, die Rolle des autogenen chirurgische Angiogenese, VCA Lebensfähigkeit zu erhalten.
Das Modell rekonstruiert segmentale tibiale Knochendefekte mit Größe und Form angepasst allogene tibiale Knochen-Segmenten, verpflanzt in a-Dur Schweine Leukozyten Antigen (SLA) Missverhältnis in Yucatan Miniatur Schweine. Nährstoff Schiff Reparatur und Implantation des Empfängers abgeleiteten autogene Schiffe in den medullären Kanal der allogenen tibiale Knochen Segmente erfolgt in Kombination mit gleichzeitigen kurzfristige IS. Dies ermöglicht eine Neoangiogenic autogene Zirkulation von implantierten Gewebes, Aufrechterhaltung Strömung durch die allogene Nährstoff Gefäße für kurze Zeit zu entwickeln. Einmal eingerichtet, behält die neue autogene Zirkulation Knochen Lebensfähigkeit nach Beendigung der medikamentösen Therapie und anschließende Nährstoff Schiff Thrombose.
Introduction
Großen segmentalen knöcherner Defekte ergeben sich aus Trauma, Infektion oder Gliedmaßen brusterhaltenden Operation nach Malignität. Aktuelle rekonstruktive Optionen wie vaskularisierte autogene Knochentransplantation, Knochen-Beförderung, prothetische Ersatz und kryokonservierten nekrotische Allografts, alleine verwendet oder in Kombination, sind verbunden mit einer erheblichen Morbidität und haben eine hohe Komplikationen1,2,3.
Das Vorhandensein einer mikrovaskulären Netzwerks ist unerlässlich für die Bildung und Homöostase der Knochen, Unterstützung von knochenbildenden, Chondrogenic und mesenchymalen Stammzellen für Knochen Reparatur4erforderlich.
Die Transplantation von lebenden allogenen Knochen, eine Form der vaskularisierte composite Tissue Allotransplantation (Knochen VCA), ausgeführt mit mikrochirurgischen Anastomose von seiner Nährstoff Knochenschrauben, kann eine zukünftige rekonstruktive Alternative darstellen. Wie kryokonservierten allogenen Knochen erfolgt sofortige Stabilität durch genau passende Knochen defekt Morphologie. Wie Autogenes vaskularisierte Graft, es stellt die verbesserte Heilung und Umgestaltung des Lebens Knochengewebe. Das Hindernis in jedem Allotransplant Verfahren bleibt die Notwendigkeit der long-term-Immunsuppression (IS). Das Problem ist schärfer im Muskel-Skelett-Gewebe, die Droge Dosen 2-bis 3-mal größer als5Organtransplantationen erfordern. Damit einhergehende Risiken einschließlich Orgel Toxizität, malignen Erkrankungen, Infektionen oder Entwicklung von Graft - Versus - Host-Seuche sind schwierig, in dieser Nichtleben kritische Anwendungen6zu rechtfertigen. Episoden einer akuten und chronischen Abstoßung bleiben jedoch ein großes Problem mit aktuellen langfristige IS-7. Ständiges Bestreben eng Histocompatibility Antigene übereinstimmen, Spender-spezifische Toleranz zu induzieren und/oder Verbesserung Droge Immuntherapie nicht noch routinemäßig gelungen, in schönem klinische drogenfreie Gewebe überleben8,9.
Zuvor haben wir bewiesen, dass die Mittel, um Knochen VCA Lebensfähigkeit zu erhalten und zu verbessern Knochen Umgestaltung in kleiner Tiermodelle durch Förderung einer neuen autogene Durchblutung innerhalb von transplantierten Knochen. Dies geschieht durch den zusätzlichen Einsatz von chirurgischen Angiogenese von implantierten autologen Gewebe10,11,12. Allogenen Knochen Segmente werden mikrochirurgisch mit Anastomose der Nährstoff Knochen Segment Pedikels transplantiert. Darüber hinaus werden Host-abgeleitete Schiffe in den medullären Kanal des Segments allogene vaskularisierte Knochen implantiert. 2 Wochen dabei ist Durchgängigkeit des allogenen Nährstoff Schiffes gepflegt mit Medikament Immunsuppression. Nach IS-Abzug der Nährstoff Pedikels wird schließlich hierdurch13. Das neue Kapillare Bett, basierend auf der Host-abgeleitete Schiffe bietet ausreichende Luftzirkulation um Gewebe Lebensfähigkeit zu erhalten. Knochen Heilung und Umbau sind seit Osteogenesis verbessert und Angiogenese sind gekoppelte10,11,12. Keine weitere Immuntherapie ist erforderlich und Knochen Lebensfähigkeit ist langfristig trotz ein immunologisch kompetenten Gastgeber und Abwesenheit von Spender-spezifische Toleranz gepflegt.
Übersetzung dieser neuartigen Methode der Knochen Allotransplantation in die klinische Praxis sollte am besten durch weitere Studien zu Heilung, mechanische Eigenschaften und Immunologie in einem großen Tier Modell vorangestellt werden. Das porcinen Modell ist ideal für solche VCA Forschung14,15,16. Miniatur-Schweine sind vergleichbar in Größe und Anatomie mit Mann, so dass skelettartigen Rekonstruktion mit im Wesentlichen identischen chirurgische Implantate und Techniken. Schweine-Immunologie ist gut definiert, einschließlich Schweine Leukozyten Antigen (SLA) Haplotypen und Blutgruppen, notwendig für Transplantationschirurgie. Zell-Linie Studien sind mit Sex nicht übereinstimmende Transplantation möglich wie detaillierte Analysen der Immunantworten17,18,19,20,21.
Hier beschreiben wir eine Knochenmodell VCA Allotransplantation in Yucatan Miniatur Schweine, geeignet für Studie der segmentalen Knochenverlust und des Wiederaufbaus. Dieses Modell kann verwendet werden, um das Zusammenspiel von chirurgischen Angiogenese zu untersuchen und kurzfristige IS auf Knochen VCA überleben und Funktion, Osteocyte Linie, einschließlich Knochen Durchblutung, Heilung und Umbau Kapazitäten, Alloresponsiveness und Biomechanik sowie als zu andere innovative immun-modulierende-Strategien zu testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Studie wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an Mayo Clinic Rochester genehmigt. Yucatan Miniatur Schweine dienten als Spender und Empfänger während dieses Operationsverfahren VCA. Paarung von Spender und Empfänger beruhte auf DNA-Sequenz Schweine Leukozyten Antigen (SLA) Haplotyping eine große Diskrepanz in den SLAs 22,23sicherzustellen. Die Tiere waren Alter und Gewicht abgestimmt und der identische Blutgruppe. Zwei OP-Teams gleichzeitig geerntet ein porcinen tibiale Knochen Segment mit seinen Nährstoff Schiff aus dem Spender und der Empfänger Segment Orthopically platziert allogene tibiale Knochen erhalten vorbereitet. Gleichzeitig wurde bei mikrovaskuläre Reparatur des Knochens Nährstoff Schiffes, ein Empfänger abgeleitet arterio-Bundle im Segment für autogene Angiogenese Tibia platziert.
(1) präoperativen Vorbereitungen
- Schnell Yucatan Miniatur Schweine am Tag vor dem Eingriff und wiegen sie für kontrollierte Medikamentenabgabe.
- Gesetzter Tiere mit Xylazin (2 mg/kg) und die Kombination von Tiletamin HCL und Zolazepam HCL (5 mg/kg), subkutan verabreicht.
- Platzieren eines peripheren Katheters in eine Vene Ohr für intravenös und Kochsalzlösung Lieferung und Buprenorphin (0,18 mg/kg) und prophylaktische Antibiotika (1 g Cefazoline intravenös und 5 mg/kg Ceftiofur intramuskuläre) verwalten.
- Rasieren Sie die richtigen Megalosauridae und den linken Hals, der als Standort für die vaskularisierte tibiale Knochen Segment und Website für die Platzierung der zentralen Venenkatheter, die Ernte bzw. dienen wird.
- Überprüfen Sie Vitalfunktionen und das Niveau der Sedierung durch die Lockerung der Mundmuskulatur Tests.
- Das Tier mit einer entsprechend großen Endotrachealtubus sternalen liegen24Intubation.
- Übertragen Sie die Miniatur-Schweine auf dem OP-Tisch und ein Ventilator-Maschine für die Wartung der Narkose durch die Gabe von Isofluran (1-3 %) an.
- Bestätigen Sie die Narkose Tiefe palpebrale, Pupillen leicht und Hornhaut Reflexe testen.
- Sauerstoff-Sättigung mit einem Pulsoximeter Übertragung Fühler angeschlossen an das Ohr zu überwachen. Verwenden Sie eine Blutdruck-Manschette und Temperatur-Sonde für die Überwachung der intraoperativen Vitalparameter.
- Legen Sie Yucatan Miniatur Schweine in Rückenlage auf eine wärmende Unterlage. Darüber hinaus verwenden Sie eine wärmende Decke gezwungen-Luft während des Betriebs, um Unterkühlung zu verhindern.
- Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
(2) die Ernte eines Segments vaskularisierte tibiale Knochen
- Waschen Sie das rechte Bein des jeder Miniatur-Schweine mit Povidon-Jod-Lösung. Trocknen Sie die Haut mit einem sterilen Tuch und drapieren der Extremität in einem sterilen Mode. Umhüllen und das Glied mit einer Jod imprägniert Klebstoff Inzisionsfolie zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu isolieren.
- Führen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell Anterolaterally in die Megalosauridae, Beginn um das Kniegelenk, Verlängerung nach distal entlang des vorderen Rückens des Schienbeins Tibiotalar Gelenk.
- Sezieren Sie die Haut und die Unterhaut mit Schere und einfahren Sie die vordere Fach Muskeln aus der Tibia seitlich.
Hinweis: Freisetzung von den m. Tibialis anterior Muskel Ursprung erleichtert Exposition. Die Membrana Membran liegt nun frei. - Identifizieren der kranialen tibiale Arterie und Vene (um später als der arteriovenösen Bundle für die chirurgische Angiogenese verwendet werden).
Hinweis: Der kranialen tibiale Arterie und Vene liegen auf der Vorderfläche der Membrana Membran. - Um das operative Sichtfeld zu verbessern, lösen Sie einen Teil vom Tibia vordere Muskel aus seiner Einfügung und entfernen Sie einen Teil der Tibia Kamm mit einer oszillierenden Säge.
- Einzuschneiden Sie die kranialen tibiale Schiffe zu schützen, Jahresbeginn Membrana Membran auf der Ebene der tibiale Tuberkel mit einer Schere.
- Visualisieren Sie die kaudalen tibiale Schiffe laufen distal unter der Membran.
Hinweis: sie von der kranialen tibiale Gefäße verzweigen und geben Anlass zu der Nährstoff Pedikels der tibiale Diaphyse nur distal der Tuberkel. Es ist nun möglich, den Nährstoff Foramen und Schiffe, die Tibia auf seiner hinteren seitlichen Oberfläche nur distal an der Tibia Tuberkel zu visualisieren. - Tag der Nährstoff Pedikels mit einem Microclamp. Trennen Sie die vaskuläre Pedikels nicht.
- Eine Muskel-Niederlassung in Tibia vordere Fach in der Nähe von Foramen Nährstoff zu identifizieren; Dies kann für die Anastomose vaskularisierte Knochen Allotransplant Nährstoff Gefäß verwendet werden. Markieren Sie den Muskel Zweig mit einem Microclamp.
-
Ernte von einem 3,5 cm tibiale Knochen Segment einschließlich der vaskulären Knochenschrauben.
- Verwenden Sie eine Schnittvorrichtung, um eine präzise und reproduzierbare Knochen Resektion sicherzustellen. Position und befestigen Sie das Schneiden jig auf der medialen Fläche der Tibia, die Nährstoff Foramen und Schiffe aufzunehmen.
- Geleitet von der Spannvorrichtung, führen Sie parallel Knochen schneidet mit einer oszillierenden Säge um eine 3,5 cm tibiale Segment zu entfernen. Verwenden Sie die gleiche Positionierung und Spannvorrichtung für Spender und Empfänger Tiere, um Größe und Form-Match zu maximieren.
- Verwenden Sie eine Schnittvorrichtung, um eine präzise und reproduzierbare Knochen Resektion sicherzustellen. Position und befestigen Sie das Schneiden jig auf der medialen Fläche der Tibia, die Nährstoff Foramen und Schiffe aufzunehmen.
- Sobald beide Schnitten mit der oszillierenden Säge vorgenommen wurden, drehen Sie das tibiale Knochen-Segment um den Nährstoff Pedikels auf der hinteren Oberfläche zu visualisieren. Teilen Sie den Nährstoff Pedikels an seinem Ursprung von der kranialen tibiale Arterie mit einer Schere. Sezieren und frei das tibiale Segment mit der Schere, so dass eine dünne Manschette Periost und Muskel auf seiner Oberfläche.
- Zurückziehen Sie das tibiale Knochen Segment und erhöhen Sie das tibiale Knochen Segment mit seinen Kreislauf Pedikels mit einer scharfen Klemme, verlassen die kraniale tibiale Arterie an Ort.
Hinweis: Die vaskularisierte Knochen Segment ist nun bereit für mikrovaskuläre Transfer und eine 3,5 cm tibiale Knochendefekt geschaffen wurde, in jeder Yucatan-Miniatur-Schweine. - Verbinden Sie den kranialen tibiale Schiffe am Knöchel mit resorbierbaren Polyglactin 3-0 Nahtmaterial, befreien sie mit einer Manschette perivaskuläre Gewebe zu einer arteriovenösen (AV)-Bundle erstellen. Verlassen die Nähte mindestens 5 cm lang, die Implantation in das Segment der tibiale Knochen zu erleichtern.
(3) orthotopen tibiale VCA Knochenaufbau in Kombination mit chirurgischen Angiogenese
-
Tauschen Sie die geernteten tibiale Knochen-Segmente mit seinen Nährstoff Wirbelsäulenversteifung zwischen den beiden Tieren einsetzen wie VCAs Knochen.
- Um Durchgang des kranialen tibiale arteriovenösen (AV) Bundle in das Segment der tibiale Knochen ermöglichen, entfernen der V-förmige Ausschnitt aus der proximalen Junction-Website mit der oszillierenden Säge.
- Bohren Sie ein Loch von 0,5 cm Durchmesser im distalen Teil des Standortes tibiale Knochen defekt und in der medulläre Kanal des Segments tibiale Knochen und stellen die Empfänger AV-Bündel, das nach distal, ligiert worden in den intramedullary Kanal zur weiteren Förderung autogenen New Blut-Versorgungsmaterial.
-
Legen Sie die vaskularisierte tibiale Knochen Segment Orthotopically in den Empfänger defekt.
- Anastomosieren Sie der Nährstoff Pedikels des Segments tibiale Knochen in den vorbereiteten Muskel Zweig der Tibia vordere Fach in einer Ende-zu Ende Art und Weise mit der einfachen unterbrochenen Nahttechnik und 9-0 Nahtmaterial25.
- Bestätigen Sie Durchgängigkeit von der mikrovaskuläre Anastomose mit dem Melken Test26.
-
Mit einem 9-Loch 3,5 mm Platte sperren erreichen Sie Osteosynthese.
- Legen Sie die 9-Loch-Platte auf der Tibia-Anteromedially. Befestigen Sie die Platte mit drei Bicortical Schrauben oben und unten Segment tibiale Knochen. Darüber hinaus setzen Sie Unicortical Schrauben im Segment Osteosynthese der Tibia Knochen. Zur Bestätigung korrekte Positionierung des Knochens VCA und Platte, verwenden Anteroposterior und seitlichen Röntgenaufnahmen.
- Führen Sie Faszien und mehrschichtige Haut Verschluss mit 3: 0 und 2: 0 resorbierbaren Nahtmaterial unterbrochen. Versiegeln Sie schließlich die Wunde mit einer okklusiven transparent Dressing.
4. zentrale Venenkatheter Platzierung in Vena externe Ader
-
Legen Sie für postoperative Medikamentengabe und immunsuppressive (IS) Medikament Niveauüberwachung einen Venenkatheter in die äußere Halsschlagader mit einer offenen Technik. Führen Sie die Platzierung am Ende des Verfahrens Allotransplantation in Narkose (siehe Abschnitt 1).
- Führen Sie einen anterolateralen Schnitt in den Hals mit einem Skalpell. Sezieren Sie das subkutane Gewebe mit einer Schere zu und setzen Sie der linken Halsschlagader aus.
- Legen Sie einen Hickman-Katheter in die Halsschlagader durch ein kleines Loch in die äußere Halsschlagader und sichern Sie es mit nicht resorbierbaren Fäden. Exteriorize Sie den Katheter in den Rücken von Tunneln subkutan.
- Sichern Sie den Katheter an Stelle der Haut und nahe der Hals in Schichten mit 3: 0 und 2: 0 resorbierbare Fäden unterbrochen.
- Platzieren Sie okklusive Verbände über den Schnitt. Verwenden Sie einen Fischnetz-Verband um die Bandagen und Katheter in Position zu halten.
5. postoperative Behandlung und Follow-Up
- Unmittelbar nach der Operation behandeln Sie die Yucatan Miniatur Schweine mit einer intramuskulären Injektion von Carprofen (4 mg/kg) für postoperative Analgesie. Buprenorphin (0,18 mg/kg) zur Behandlung von Schmerzen von hoher Intensität, je nach Bedarf zu verwalten.
- Das Schwein für 60 min. zu erholen und dann wieder das Schwein zu einem speziellen Intensivstation Pfanne und Monitor eng bis zur vollständigen Genesung zu ermöglichen.
- Verschieben Sie die Yucatan Miniatur Schweine zu einem normalen Käfig und ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung.
- Verwalten von Tacrolimus (0,8-1,5 mg/kg/Tag) und Mycophenolate Mofetil (MMF) (50-70 mg/kg/Tag) mündlich und Methylprednisolon Natrium Succinat intravenös (ab 500 mg/Tag) für zwei Wochen.
- Stellen Sie Tagesdosen von Immunsuppressiva nach Blut Talspiegel, mit dem Ziel für 5,0-30,0 ng/mLfür Tacrolimus und 1,0 bis 3,5 µg/mL für MMF, beziehungsweise. Reduzieren Sie die Dosis von Methylprednisolon allmählich, bis die Erhaltungsdosis von 50 mg pro Tag erreicht ist.
- Prophylaktische Antibiotika Gentamicin zu verwalten (3 mg/kg intravenös) und Ceftiofur (5 mg/kg intramuskulär) für zwei Wochen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die beschriebene Technik wurde in vier SLA großen nicht übereinstimmende Yucatan Miniatur Schweine und segmentale tibiale Defekte rekonstruiert mit Größe angepasst tibiale VCA erfolgreich durchgeführt. Gleichzeitige Nährstoff Schiff Reparatur von den Knochen Allotransplant und Implantation von einem AV-Bündel vom Empfänger Tier innerhalb der Allotransplant medulläre Kanal erlaubt sofortige Knochen Zirkulation und Entwicklung einer neuen autogene Blutversorgung über Zeit (Abbildung 1). 16 Wochen hatte eine Neoangiogenic Zirkulation innerhalb alle tibiale VCAs, visualisiert durch Mikro-berechnet computertomographischen (Mikro-CT) Angiographie nach Injektion eines röntgendichten angiographischen Polymers (125 ml) in den femoralen Gefäße und Entkalkung des etabliert Das tibiale VCA (Abbildung 2).
Abbildung 1 : Orthotopen tibiale Knochen VCA Verfahren. Das Diagramm zeigt den chirurgischen Eingriff. (A) Spender Verfahren: Ernte eine tibiale Knochen Segment mit seinen Nährstoff Knochenschrauben. (B) Austausch der tibiale Knochen Segmente zwischen großen SLA übereinstimmende Schweine. (C) Empfänger Verfahren: arteriovenöse Bundle Implantation: cranial tibiale Schiffe werden sorgfältig in den medullären Kanal eingefügt. (D) mikrovaskuläre Anastomose der Nährstoff Knochenschrauben in den Muskel Zweig von der vorderen tibiale Fach und Platte Osteosynthese der Tibia Diaphyse. Verwendet mit Erlaubnis von Mayo Grundlage für medizinische Ausbildung und Forschung. Alle Rechte vorbehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Mikro-CT angiographischen 3D-Bild eines entkalkt tibiale VCA-Segments. Die Neongiogenic Zirkulation (gelber Pfeil) ist nach der Perfusion mit einer röntgendichten Silizium-Lösung dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Miniatur-Schweine zeigte keine Anzeichen von Stress oder Selbstverstümmelung. Alle Wunden verheilt ohne Infektion und Tiere normalerweise ambulated, letztlich in der Lage, tragen volle Gewicht auf die operierten rechten Extremität ab dem ersten postoperativen Tag auf. Bei Studienendpunkt 16th Wochen alle Yucatan Miniatur Schweine mehr als 150 % des ursprünglichen Körpergewichts gewonnen hatte (Pretransplant: 56,0 ± 6.1 im Vergleich zu 16 Wochen Posttransplant: 84,5 ± 6,0).
Zwei Wochen der Immunsuppression, bestehend aus Tacrolimus, dienten Mycophenolate Mofetil (MMF) und Methylprednisolon Succinat Blutfluss durch den Nährstoff Pedikels beizubehalten, bis eine neue autogene Blutversorgung innerhalb der allogenen gegründet worden war Knochen Allotransplant. Während der 2-wöchigen waren Immunsuppression regelmäßige Blutproben der Vena Katheter entnommen, um die Blutspiegel des Medikaments zu beurteilen. Dosen wurden angepasst, um beizubehalten Trog Blutspiegel von 5-30 ng/ml für Tacrolimus und 1 bis 3,5 µg/ml für MMF (Tabelle 1). Keine Droge in Verbindung stehenden Komplikationen aufgetreten und Tacrolimus Talspiegel strebte und Mycophenolate Mofetil könnte erreicht werden (Abbildung 3 und Abbildung 4).
| Immunsuppressivum | Anfangsdosis | Talspiegel | Erhaltungsdosis |
| Tacrolimus | 0,8-1,5 mg/kg/Tag | 5-30 ng/ml | |
| MYCOPHENOLATE Mofetil | 50-70 mg/kg/Tag | 1 bis 3 µg/ml | |
| Methylprednisolon Natrium Succinat | 500 mg | 50 mg |
Tabelle 1: kurze Begriff Immunsuppression Protokoll. Dargestellt ist der immunsuppressiven Protokolls für die ersten 2 Wochen Post-Transplantation mit der Anfangsdosis für Tacrolimus, Mycophenolate Mofetil und Prednisolon. Zusätzlich zur Talspiegel für Tacrolimus und Mycophenolate Mofetil und die Erhaltungsdosis von Prednisolon werden angezeigt.
Abbildung 3 : Trog Blutspiegel für Tacrolimus. Der Median und Interquartilbereich erzielten Talspiegel für Tacrolimus über die ersten 2 Wochen Post-Transplantation werden dargestellt. Fehlerbalken kennzeichnen den Interquartilbereich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Trog Blutspiegel für Mycophenolate Mofetil. Der Median und Interquartilbereich Trog Blutspiegel von Mycophenolate Mofetil im kurzfristigen Immunosupression Zeitraum von 2 Wochen werden angezeigt. Fehlerbalken kennzeichnen den Interquartilbereich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Trotz Beendigung der Immunsuppression nach zwei Wochen, regelmäßige radiologische Bewertung zu verschiedenen Zeitpunkten (2, 4, 6, 10 und 16 Wochen) der operierten rechten Hind Extremität mit Röntgenstrahlen progressive Knochenheilung über die Studie offenbart Zeitraumes von 16 Wochen bei durch benotet zwei unabhängige und verblendete Beobachter (Abbildung 5)27,28. Mikro-CT-Analyse 16th Wochen wurde verwendet, um Volumen und Dichte von Kallus, sowie die Knochenbildung am Host/Knochen VCA Kreuzungen und Knochen VCA Allotransplant aussehen27Überbrückung zu quantifizieren. Wartung der Osteosynthese ohne Verlust der Reduktion oder Verlust, gefördert durch das neue autogene Blut-Versorgungsmaterial, nachgewiesene28sein könnte. Knöchernen Union erreichte alle Tibien (Abbildung 6).
Abbildung 5: Knochen Heilung Fortschreiten über 16 Wochen. Um die Knochenheilung Fortschreiten eines nicht-linearen Regressionsmodells zu definieren verwendet wurde. Der Wert R2 wurde verwendet, um die Passform des Modells an die Daten zu definieren. Verwenden ein scoring-System, basierend auf Anteroposterior und seitlichen Röntgenaufnahmen der Osseointegration des Knochens, die VCA in der segmentaler Knochendefekt geschossen wurde mit einem maximalen Wert von 25 Punkten zu anderen Zeitpunkt über die Studiendauer (2, 4, 6, 10 und 16 Wochen) durch zwei Punkte unabhängige und verblendete Beobachter30,31. Das nicht-lineare Regressionsmodell schildert die Median und Interquartilbereich für die Knochenheilung Werte über die Studiendauer (R2 = 0.931) zeigen eine kontinuierliche Knochenheilung Fortschreiten Annäherung an den Wert von 25 auf 16 Wochen. Fehlerbalken kennzeichnen den Interquartilbereich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Dreidimensionale Rekonstruktion von porcinen tibiale Diaphyse nach Mikro berechnet tomographische Prüfung. Vertreter, dreidimensional berechnet Bild der rekonstruierten Tibia mit internen Plattenosteosynthese mit 2 x tatsächliche Größe. 16 Wochen komplett Union nach tibiale Knochen VCAs mit chirurgischen Angiogenese angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Histologische Analyse auf Hämatoxylin-Eosin undecalcified gebeizt Abschnitte, mit Hilfe einer zuvor beschriebenen Skala Verschneidung Ablehnung (keine, leichte, mittlere und schwere) ergab keine Anzeichen für eine starke Ablehnung, wobei mildere und gemäßigte Zeichen der Ablehnung sein könnte in drei Schweinchen (Abbildung 7)29demonstriert.
Abbildung 7: Repräsentatives Bild von einem horizontalen Hämatoxylin-Eosin befleckt Abschnitt von Tibia VCA. Röntgendichten Silizium Lösung gefüllten Gefäße sind angezeigt Braun (Sternchen). Milde endosteal Infiltration und Reaktion (dicker Pfeil) ist mit mehr als zwei Drittel der Leerstellen gefüllt mit Osteozyten (kleiner Pfeil) im Einklang mit lebensfähigen Knochen gesehen. 10 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 300 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Transplantation von vaskularisierte allogenen Knochen (Knochen VCA) kann eine rekonstruktive Zukunftsoption für große segmentale knöcherner Defekte darstellen. Die Notwendigkeit des long-term-Immunsuppression (IS) und seine bedeutende Nebenwirkungen für Knochen VCA überleben erforderlich sind jedoch schwierig, diese Nichtleben kritische Anwendungen6zu rechtfertigen.
Obwohl Inzucht Stämme von der Laborratte ausgiebig in der Allotransplantation Forschung verwendet wurden, um verschiedene Ansätze zur Vermeidung von long-term-Immunsuppression zu testen, können Schweine Modelle bieten erhebliche Vorteile8,9 . Die Yucatan-Mini-Schwein ist ideal für Studie über den komplexen Prozess der Knochen VCA Ablehnung. Physiologisch, die neuen Knochen-Bildungsrate ist vergleichbar mit Mensch (Schweine 1,2 – 1,5 µm pro Tag; Menschen 1,0-1,5 µm pro Tag bzw.)32. Anatomische Ähnlichkeiten erlauben den Einsatz der orthotopen Knochenaufbau mit im Wesentlichen identischen chirurgische Implantate und Techniken. Vielleicht am wichtigsten ist, die klar definierte porcinen Alloresponse-möglich gemacht durch Fortschritte in porcinen Zytokin-Erkennung und Entwicklung von Anti-Schweinen Cluster der Differenzierung Antikörper-macht dies und andere VCA Studien strengere33.
Wie in jeder ähnliche klinische Anwendung der Methode der porcinen tibiale defekt Knochenaufbau mit Knochen, die VCA technisch anspruchsvoll ist, erfordert zwei team-Ansatz mit ausreichend chirurgischem Know-how in der mikrovaskuläre Chirurgie und Knochen Wiederaufbau zur reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Strikte Einhaltung der intraoperative Sterilität und Perioperative Antibiotikaprophylaxe sind obligatorisch, um das Risiko von infektiösen Komplikationen verringern.
In früheren Studien mit Ratten und Kaninchen beibehalten kurzfristige IS Lebensfähigkeit der vaskularisierte Knochen Allotransplants in den ersten 2 Wochen durch Durchblutung des Knochens VCA durch seine allogene Nährstoff Gefäß. Nach Immunsuppression Rückzug Empfänger Schiffe innerhalb abgeleitet vorgesehen die medulläre Kanal Neovaskularisation ermöglicht langfristige Knochenheilung VCA und Lebensfähigkeit10,11,12. Am Studienendpunkt könnte erhebliche Allotransplant Chimärismus erkannten34,35,36. Wir haben nach vorne bewegt und unsere Ratten und Kaninchen gut etablierte Methode auf dem porcinen Modell angewandt. Dieses Modell ist möglich, ein neues Mittel zur Aufrechterhaltung der Gewebe Rentabilität ohne langfristige IS im Knochen VCA Forschung mit chirurgischen Angiogenese von implantierten autogene Schiffe kombiniert mit kurzfristigen ist, effektiv schalten die Knochen Zirkulation von testen allogene autogene Schiffen.
Ein wesentlicher Vorteil dieses Modells gegenüber anderen vorhandenen Schweine Knochen mit VCA-Modellen ist bauartbedingt orthotopen ermöglicht funktionale Bewertung der Belastung und Beurteilung der mechanischen Eigenschaften, Daten, die vor allem spärlich14, 37. die komplexen Mechanismen der lokalen und systemischen Knochen VCA Ablehnung durch radiologische und histologische Auswertung des Segments allotransplanted Tibia Knochen sowie molekulare biologische Analyse des peripheren Blutes leicht überwacht werden kann. Letztlich ermöglicht die niedrige Morbidität des chirurgischen Knochen VCA Verfahrens langfristige Knochen VCA überleben und Analyse.
Stabile Osteosynthese, richtige allogene tibiale Knochen Segment Leib und Apposition Ausrichtung sind entscheidend für die Mobilisation der Schweine am ersten postoperativen Tag ermöglichen und erfordern eine sorgfältige präoperativen Planung. Die Methode, die wir ausgewählt haben, mit einer speziellen gestalteten Schnittvorrichtung für präzise und reproduzierbare Knochen Resektion kombiniert mit Platte Osteosynthese ist ausreichend stabil für die Genehmigung der starren Fixierung im Allotransplants, auch bei Patienten mit minimaler Größe Fehlanpassungen.
Eine Einschränkung der vorgestellten Technik ist, dass es keine Bewertung der verschiedenen Gewebe Komponenten wie Haut und Muskel neben der vaskularisierte Knochen-Komponente zulässt. Eine zusammengesetzte Klappe einschließlich verschiedene Gewebeanteile ist, zwar möglich wurde dieses Modell entwickelt um exklusive Knochen Allotransplantation zu studieren, da die Immunogenität von verschiedenen VCA Gewebe Hochleistungsflüssigkeitschromatographie38variiert.
Abschließend enthält dieser Artikel Informationen zum Aufbau einer reproduzierbaren große Tiermodell mit definierten Genetik für Knochen VCA-Forschung. Dieses Modell kann als Grundlage für zukünftige Studien untersuchen den Einfluss der chirurgischen Angiogenese auf Knochen Blutfluss und Knochenaufbau dienen und vielleicht beseitigen die Notwendigkeit der langfristigen Immunsuppression. Des weiteren kann verwendet werden, um den komplexen Prozess der Knochen VCA Ablehnung abzugrenzen und andere innovative immun-modulierende-Strategien zu testen. Definierte SLA-Haplotypen und Quantifizierung der SRY-Gene in Sex nicht übereinstimmende Schweine können Bestimmung des Ausmaßes der Chimärismus Allotransplant und peripherem Blut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Division of Media Support Services, Mayo Clinic Rochester, MN für die Videoproduktion sowie Georgios Kotsougianis für die Bearbeitung des Videos. Das hervorragende Bildmaterial wurde von Jim Postier, Rochester, MN durchgeführt. Darüber hinaus die Autoren möchte die DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) danken für die Lohn-Unterstützung für Dr. Dimitra Kotsougiani (DFG-Stipendium: KO 4903/1-1). Diese Arbeit wurde durch ein großzügiges Geschenk von Tarek E. Obaid unterstützt. Diese Arbeit wurde in die mikrovaskuläre Research Laboratory, Abteilung der orthopädischen Chirurgie Mayo Clinic Rochester, MN durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
