Summary
Momenteel is de enige vorm van gevacuoliseerd samengestelde allotransplantation afhankelijk van lange-termijn-immuunsuppressie, moeilijk te ondersteunen voor niet-leven-kritieke indicaties. We presenteren een nieuwe varkens tibiale VCA model dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van bot VCA en voorbeelden van het gebruik van chirurgische angiogenese om bot levensvatbaarheid zonder de behoefte van langdurig immuun-modulatie.
Abstract
Regiogebonden botverlies als gevolg van trauma, infectie malignancy en aangeboren afwijking blijft een belangrijke reconstructieve uitdaging. Huidige therapeutische opties hebben aanzienlijke risico van mislukking en substantiële morbiditeit.
Gebruik van bot gevacuoliseerd composiet allotransplantation (VCA) zou bieden beide een nauwe wedstrijd van gereseceerd bot grootte en vorm en de genezing en het remodelleren van potentieel van levende bot. Op dit moment is levenslang drug immunosuppressiva (IS) vereist. Orgaantoxiciteit, opportunistische infectie en gezwellen risico's zijn van belang voor de behandeling van dergelijke niet-dodelijke aanduidingen.
Wij hebben eerder aangetoond dat bot en gezamenlijke VCA levensvatbaarheid kan worden gehandhaafd bij ratten en konijnen zonder de behoefte aan lange-termijn-immuunsuppressie door implantatie van geadresseerden afgeleide schepen binnen de VCA. Het genereert een autogene, neoangiogenic omloop met meetbare stroom en actieve bot remodelleren, waarvoor slechts 2 weken van IS. Als kleine dieren van man aanzienlijk in bot fysiologie, anatomie en immunologie verschillen, hebben we een varkens bot VCA model voor het evalueren van deze techniek voordat klinische toepassing wordt uitgevoerd. Miniatuur varkens worden momenteel veel gebruikt voor allotransplantation onderzoek, hun immunologische, anatomische, fysiologische en grootte overeenkomsten aan de mens gegeven. Hier beschrijven we een nieuw varkens orthotopic Tibia Bot VCA model voor het testen van de rol van autogene chirurgische angiogenese om VCA levensvatbaarheid.
De model reconstrueert regiogebonden tibiale bot gebreken met behulp van grootte en vorm-zoekwoorden allogene tibiale bot segmenten, getransplanteerd over een grote varkens leukocyte antigen (SLA) komen niet overeen in Yucatan miniatuur varkens. Nutriënten vaartuig reparatie en implantatie van geadresseerden afgeleide autogene vaartuigen in de Wallenberg kanaal van allogene tibiale bot segmenten wordt uitgevoerd in combinatie met gelijktijdige op korte termijn IS. Hierdoor kan een autogene oplage van neoangiogenic te ontwikkelen van de geïmplanteerde weefsels, behoud van de stroom door de allogene nutriënten vaartuigen voor een korte tijd. Zodra vastgesteld, onderhoudt de nieuwe autogene circulatie bot levensvatbaarheid na stopzetting van de behandeling met medicijnen en latere nutriënten vaartuig trombose.
Introduction
Grote regiogebonden werden gebreken resultaat uit trauma, infectie of ledemaat-sparend chirurgie na maligniteit. Huidige reconstructieve opties zoals gevacuoliseerd autogene bottransplantaat bot, prothetische vervanging, en vervoer cryopreserved necrotische allografts, alleen gebruikt of in combinatie, worden geassocieerd met significante morbiditeit en hebben hoge tarieven van complicaties1,2,3.
De aanwezigheid van een microvasculaire netwerk is essentieel voor de vorming en homeostase van bot, ter ondersteuning van osteogenic, chondrogenic en mesenchymale stamcellen voor bot reparatie4vereist.
De transplantatie van levende allogene bot, een vorm van gevacuoliseerd samengestelde weefsel allotransplantation (bot VCA), uitgevoerd met microchirurgische wapendrager van de nutriënten stam, kan vertegenwoordigen een toekomstige reconstructieve alternatief. Als cryopreserved allogene bot, wordt onmiddellijke stabiliteit geleverd door nauw bijpassende bot defect morfologie. Zoals autogene gevacuoliseerd transplantaat, het biedt het verbeterde genezing en verbouwing van levend weefsel van bot. Het obstakel in elke allotransplant-procedure blijft de noodzaak voor lange-termijn-immunosuppressiva (IS). Het probleem is meer acuut in spier-en weefsels, waarvoor drug doses 2 - 3 maal hoger liggen dan5orgaantransplantaties. Daarmee gepaard gaande risico's, met inbegrip van orgaantoxiciteit, maligniteit, infectie of ontwikkeling van graft - versus - host-ziekte zijn moeilijk te rechtvaardigen in deze nonlife-kritische-applications6. Episodes van acute en chronische afwijzing blijft echter een groot probleem met de huidige op lange termijn IS7. Voortdurende inspanning om nauw overeenkomt met histocompatibility antigenen, induceren van donor-specifieke tolerantie en/of verbeteren van de drug immunotherapie hebben niet nog regelmatig in geslaagd het toelaat van klinische drugsvrije weefsel overleving8,9.
Wij hebben eerder aangetoond te bot VCA levensvatbaarheid te handhaven en verbeteren van bot remodelleren in kleine dierlijke modellen door bevordering van een nieuwe autogene verkeer binnen getransplanteerde bot. Dit wordt gedaan door het extra gebruik van chirurgische angiogenese van geïmplanteerde autogene weefsel10,11,12. Allogene bot segmenten worden getransplanteerd microsurgically met wapendrager van de nutriënten bot segment stam. Daarnaast zijn gastheer afkomstige vaartuigen het Wallenberg kanaal van het segment allogene gevacuoliseerd bot ingeplant. Tijdens deze 2-weekse wordt bij allogene nutriënten vessel gehandhaafd met drug immunosuppressie. Uiteindelijk na IS-terugtrekking zal de nutriënten stam thrombose13. Het nieuwe capillaire bed, gebaseerd op de host afkomstige vaartuigen biedt voldoende luchtcirculatie om de levensvatbaarheid van het weefsel. Bot genezing en remodeling zijn verbeterd sinds osteogenesis en angiogenese zijn gekoppelde10,11,12. Geen verdere immunotherapie is vereist en bot levensvatbaarheid op lange termijn ondanks een via het immuunsysteem veroorzaakte bevoegde host en de afwezigheid van donor-specifieke tolerantie wordt gehandhaafd.
Vertaling van deze nieuwe methode van bot allotransplantation in de klinische praktijk moet best worden voorafgegaan door verdere studie van genezing, mechanische eigenschappen en immunologie in een grote diermodel. De varkens model is ideaal voor dergelijke VCA onderzoek14,15,16. Miniatuur varkens zijn vergelijkbaar in grootte en anatomie aan de mens, waardoor skelet wederopbouw in wezen identiek chirurgische implantaten en technieken gebruiken. Varkens immunologie is goed gedefinieerd, met inbegrip van varkens leukocyte antigen (SLA) haplotypes en bloedgroepen, nodig voor de chirurgie van de haartransplantatie. Cel lineage studies zijn mogelijk met seks-mismatched transplantatie, evenals gedetailleerde analyses van de immuunrespons17,18,19,20,21.
Hier beschrijven we een bot VCA allotransplantation model in de Yucatan miniatuur varkens, geschikt voor de studie van gesegmenteerde botverlies en wederopbouw. Dit model kan worden gebruikt voor het onderzoeken van het samenspel van chirurgische angiogenese en op korte termijn IS op bot VCA overleven en functie, inclusief Osteocyt bloedlijn, bone doorbloeding, genezing en remodeling capaciteiten, alloresponsiveness en biomechanica zo goed als te testen andere innovatieve immuun f strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) in Mayo Clinic Rochester. Yucatan miniatuur varkens werden zowel donors als ontvangers bijeenkomen tijdens deze chirurgische procedure van VCA. Koppeling van donor en ontvanger was gebaseerd op de DNA sequentie varkens leukocyte antigen (SLA) haplotyping om een grote wanverhouding in de SLA's 22,23. Er werden dieren leeftijd en gewicht-zoekwoorden en van dezelfde bloedgroep. Twee chirurgische teams gelijktijdig geoogst van een segment van de varkens tibiale bot met haar voedingsstoffen schip van de donor en bereid de geadresseerde ontvangt de orthopically geplaatste allogene tibiale bot-segment. Gelijktijdig met de microvasculaire reparatie nutriënten vessel bot, werd een ontvanger afkomstige Arterioveneuze bundel geplaatst binnen het tibiale segment voor Autogeen angiogenese.
1. prechirurgische preparaten
- Snel Yucatan miniatuur varkens de dag vóór de ingreep en wegen voor gecontroleerde drug administration.
- Bezadigd dieren met Xylazine (2 mg/kg) en de combinatie van tiletamine HCL en zolazepam HCL (5 mg/kg), subcutaan toegediend.
- Plaats een perifere katheter in de ader van een oor voor intraveneuze drugs- en zoute levering en beheren van buprenorfine (0,18 mg/kg) en profylactische antibiotica (1 g cefazoline intraveneuze en 5 mg/kg ceftiofur intramusculair).
- Scheren het juiste stuk en de linker nek die als oogstgebied voor de gevacuoliseerd Tibia Bot segment en de site voor de plaatsing van de Centraal veneuze katheter, respectievelijk dienen zal.
- Vital signs en het niveau van sedatie controleren door het testen van de ontspanning van de spieren van de mond.
- Intubate van het dier met een gepaste afmetingen endotracheale buis in sternale lighouding24.
- Breng de miniatuur varkens naar de operatie tafel en verbinden met een ventilator machine voor onderhoud van anesthesie door het toedienen van Isofluraan (1-3%).
- Bevestig de verdoving diepte door testen ooglidreflex, bestaat licht en hoornvlies reflexen.
- Monitor zuurstof verzadiging met een pulse oximeter transmissie sonde gekoppeld aan het oor. Een bloeddruk manchet en temperatuur sonde gebruikt om intraoperatieve vitale teken te controleren.
- Plaats Yucatan miniatuur varkens in een liggende positie op een opwarming pad. Daarnaast gebruiken een opwarming van de aarde deken van gedwongen-lucht tijdens de operatie te voorkomen hypothermie.
- Dierenarts zalf op ogen gebruiken om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
2. de oogst van een Segment gevacuoliseerd Tibia Bot
- Wassen het rechterbeen van elke miniatuur varkens met Povidon-jodium oplossing. Droog de huid met een steriele handdoek en draperen de extremiteit in een steriele mode. Omhullen en isoleren van de ledemaat met een gordijn geïmpregneerd zelfklevende incisie jodium om te minimaliseren van het risico van besmetting.
- Een sneetje met een anterolaterally scalpel in het stuk, beginnend bij het kniegewricht, uitbreiding van distally langs de anterior ridge van het scheenbeen aan de gezamenlijke tibiotalar uitvoeren.
- Ontleden van de huid en het onderhuidse weefsel met een schaar en intrekken van de spieren van het anterior compartiment van het onderbeen zijwaarts.
Opmerking: Release van de tibialis anterior spier oorsprong vergemakkelijkt blootstelling. Het interosseous membraan wordt nu blootgesteld. - Identificeer de craniale tibiale slagader en ader (om te worden later gebruikt als de Arterioveneuze bundel voor de chirurgische angiogenese).
Opmerking: De craniale tibiale slagader en ader liggen op het voorste oppervlak van het interosseous membraan. - Ter verbetering van de operatieve gezichtsveld, een deel van de tibiale anterior spier vanaf de invoegpositie vrij en een deel van de tibiale ridge verwijderen met behulp van een oscillerende zaag.
- Bescherming van de craniale tibiale schepen, incise het begin van de interosseous membraan op het niveau van de tibiale tuberculum met een schaar.
- Visualiseer de caudal tibiale schepen, distally uitvoeren van onder het membraan.
Opmerking: Ze tak van de craniale tibiale vaartuigen en aanleiding geven tot de nutriënten stam van de tibiale diaphysis gewoon distale aan het tuberculum. Het is nu mogelijk om te visualiseren de nutriënten foramen en vaartuigen naar de tibiale tuberculum het onderbeen op haar achterste laterale oppervlak net distale in te voeren. - Label de nutriënten stam met een microclamp. Niet loskoppelen van de vasculaire stam.
- Identificeren van een tak van de spier in de tibiale anterior compartiment in de buurt van de nutriënten foramen; Dit kan gebruikt worden voor de anastomose aan het gevacuoliseerd bot allotransplant nutriënten vaartuig. Mark de tak van de spier met een microclamp.
-
De oogst van een 3,5 cm tibiale bot segment met inbegrip van de vasculaire stam.
- Gebruik een mal snijden om een nauwkeurige en reproduceerbare bot resectie. Positie en bevestig het stekje jig op het mediale oppervlak van het onderbeen met de voedende foramen en vaartuigen.
- Geleid door de mal, het uitvoeren van parallelle bot bezuinigingen met een oscillerende zaag te verwijderen van een tibiale segment van 3,5 cm. Gebruik dezelfde positionering en mal voor zowel de donor als de ontvanger dieren om te maximaliseren grootte - en shape-match.
- Gebruik een mal snijden om een nauwkeurige en reproduceerbare bot resectie. Positie en bevestig het stekje jig op het mediale oppervlak van het onderbeen met de voedende foramen en vaartuigen.
- Zodra beide bezuinigingen hebben geboekt met de oscillerende zaag, draaien de tibiale bot segment om te visualiseren van de nutriënten stam op het achterste oppervlak. Verdeel de nutriënten stam op de oorsprong van de craniale tibiale slagader met een schaar. Ontleden en de tibiale segment gratis met een schaar, een dunne manchet van beenvlies en spier verlaten op het oppervlak.
- Intrekken van de tibia bot segment en verheffen de tibiale bot-segment met de vasculaire stam met een scherpe klem, het verlaten van de craniale tibiale slagader in plaats.
Opmerking: Het gevacuoliseerd bot-segment is nu klaar voor microvasculaire overdracht en een 3,5 cm tibiale bot defect is gemaakt in elke Yucatan miniatuur varkens. - Het afbinden van de craniale tibiale schepen op de enkel met absorbeerbare polyglactin 3-0 hechtingen, hen te bevrijden met een manchet van gerelateerde weefsel te Maak een Arterioveneuze (AV) bundel. Laat de hechtingen minstens 5 cm lang om te verlichten de innesteling in het segment van de tibia bot.
3. Orthotopic tibiale VCA botreconstructie in combinatie met chirurgische angiogenese
-
De segmenten van de geoogste tibiale bot met de voedende pedicles tussen de twee dieren te gebruiken zoals bone VCAs uit te wisselen.
- Verwijder de V vormige segment van de proximale junction-site met behulp van de oscillerende zaag om doorgang van de craniale tibiale Arterioveneuze (AV) bundel in het segment van de tibia bot toe te.
- Boor een gat van 0,5 cm diameter in het distale deel van de tibia bot defect site en in de Wallenberg kanaal van de tibia bot-segment en de ontvanger AV-bundel, die heeft zijn afgebonden distally, ingevoerd door het intramedullary kanaal om latere autogene New bloedtoevoer.
-
Plaats de gevacuoliseerd Tibia Bot segment orthotopically in de ontvanger defect.
- Anastomose de nutriënten uitloper van het segment van de tibia bot aan de bereid spier-tak van de tibiale anterior compartiment wijze een einde-aan einde met behulp van de eenvoudige onderbroken hechtdraad techniek en 9-0 hechtingen25.
- Bij van de microvasculaire wapendrager met behulp van het melken test26te bevestigen.
-
Bereiken osteosynthese met behulp van een 9-holes 3.5 mm Borgplaat.
- Plaats de plaat van de 9-holes op de tibia-anteromedially. Herstellen van de plaat met de drie schroeven van de bicortical boven en onder het segment tibiale bot. Bovendien plaats unicortical schroeven in het segment van de tibia bot voor inwendige fixatie. Controleer juiste positionering van het bot VCA en plaat, gebruik anteroposterior en laterale röntgenfoto's.
- Uitvoeren fasciaal en gebruik van de sluiting van de gelaagde huid onderbroken 3-0 en 2-0 absorbeerbare draadjes. Ten slotte zegel de wond met een transparante occlusief verband.
4. Centraal veneuze katheter plaatsing in Jugular externe ader
-
Voor postoperatieve drug administration en immunosuppressieve (IS) drug niveau controle, plaatst u een veneuze katheter in de externe halsslagader met behulp van een open techniek. De plaatsing bij de afsluiting van de procedure van de allotransplantation onder anesthesie (zie punt 1) uitvoeren.
- In de nek met een scalpel een incisie anterolateral uitvoeren Het subcutane weefsel met een schaar te ontleden en bloot de linker halsslagader.
- Plaats een Hickman katheter in de halsslagader via een klein gaatje in de externe halsslagader en veilig met niet-absorbeerbare draadjes. Exteriorize de katheter in de rug door middel van tunneling subcutaan.
- Beveilig de katheter op zijn plaats op de huid en sluiten de nek in lagen met 3-0 en 2-0 absorbeerbare draadjes onderbroken.
- Occlusieve pleisters op de incisie plaatst. Gebruik een visnet bandage om de verbanden en de katheter op zijn plaats houden.
5. postoperatieve behandeling en follow-up
- Onmiddellijk na de operatie, de Yucatan miniatuur varkens met een intramusculaire injectie van carprofen (4 mg/kg) voor postoperatieve analgesie te behandelen. Beheren van buprenorfine (0,18 mg/kg) voor de behandeling van pijn van hoge intensiteit zo nodig.
- Laat het varken gedurende 60 minuten herstellen en daarna opnieuw het varken in een speciale intensive care afdeling pan en monitor nauw tot volledig herstel.
- Verplaats de Yucatan miniatuur varkens naar een normaal cage en ad libitum toegang tot water en voedsel.
- Beheren van tacrolimus (0.8-1.5 mg/kg/dag) en mycofenolaat mofetil (MMF) (50-70 mg/kg/dag) oraal en methylprednisolon natrium succinaat intraveneus (beginnend met 500 mg/dag) gedurende twee weken.
- Aanpassen van de dagelijkse doses van immunosuppressieve drugs volgens trog bloedspiegels, streven naar 5.0-30,0 ng/mLvoor tacrolimus en 1.0-3.5 µg/mL voor MMF, respectievelijk. Verlaag de dosis van methylprednisolon geleidelijk totdat de onderhoudsdosis van 50 mg per dag is bereikt.
- Beheren van profylactische antibiotica gentamicine (3 mg/kg intraveneus) en ceftiofur (5 mg/kg intramuscularly) voor twee weken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven techniek werd met succes uitgevoerd in vier SLA belangrijke niet-overeenkomende Yucatan miniatuur varkens en regiogebonden tibiale gebreken gereconstrueerd met behulp van grootte-matched tibiale VCA. Gelijktijdige nutriënten vaartuig reparatie van de allotransplant bot en implantatie van een bundel van de AV van de ontvangende dier binnen het allotransplant Wallenberg kanaal toegestaan zowel de onmiddellijke bot omloop en de ontwikkeling van een nieuwe autogene bloedtoevoer over tijd (Figuur 1). Op 16 weken had binnen alle tibiale VCAs, gevisualiseerd door Micro-berekend tomografische (micro-CT) angiografie na injectie van een radiopaak angiographic polymeer (125 ml), in de femorale vaartuigen en ontkalking van een oplage van neoangiogenic gebracht de tibiale VCA (Figuur 2).
Figuur 1 : Orthotopic Tibia Bot VCA procedure. Diagram met de chirurgische ingreep. (A) Donor procedure: oogst van een segment van de tibia bot met haar voedingsstoffen stam. (B) uitwisseling van de segmenten van de tibia bot tussen grote SLA onjuiste varkens. (C) ontvanger procedure: Arterioveneuze bundel implantatie: Cranio tibiale vaartuigen zorgvuldig in het Wallenberg kanaal worden ingevoegd. (D) microvasculaire wapendrager van de nutriënten stam tot de tak van de spier van de voorste tibiale compartiment en plaat osteosynthese van de tibiale diaphysis. Gebruikt met toestemming van Mayo Stichting voor medisch onderwijs en onderzoek. Alle rechten voorbehouden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief 3D micro-CT angiographic beeld van een ontkalkte tibiale VCA segment. De omloop neongiogenic (gele pijl) is afgebeeld na perfusie met een radiopaak silicium-oplossing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Miniatuur varkens geen symptomen van angst of zelfverminking vertoonde. Alle wonden genezen zonder infectie en dieren ambulated normaal, uiteindelijk kunnen dragen van volle gewicht op de bediende juiste ledemaat vanaf de eerste postoperatieve dag op. Aan het eindpunt van de studie op 16th weken alle Yucatan miniatuur varkens kreeg meer dan 150% van hun originele lichaamsgewicht (pretransplant: 56.0 ± 6.1 versus 16 weken posttransplant: 84.5 ± 6.0).
Twee weken bij immuunsuppressie, bestaande uit tacrolimus, werden mycofenolaat mofetil (MMF) en methylprednisolon succinaat gebruikt om de bloedstroom door de nutriënten stam handhaven totdat een nieuwe autogene bloedtoevoer was vastgesteld binnen de allogene bot allotransplant. Tijdens de 2 weken werden bij immuunsuppressie periodieke bloedmonsters genomen uit de jugular katheter te beoordelen van bloedspiegels van de drug. Doses werden aangepast om te handhaven via bloedspiegels van 5-30 ng/ml voor tacrolimus en 1-3.5 µg/ml voor MMF (tabel 1). Geen drugs gerelateerde complicaties opgetreden en gericht trog niveaus voor tacrolimus en mycofenolaat mofetil kan worden bereikt (Figuur 3 en Figuur 4).
| Immuunsuppressivum | Startdosering | Trog niveaus | Onderhoudsdosis |
| Tacrolimus | 0,8 tot 1,5 mg/kg/dag | 5-30 ng/ml | |
| Mycofenolaat Mofetil | 50-70 mg/kg/dag | 1-3 µg Mo/ml | |
| Methylprednisolon natrium succinaat | 500 mg | 50 mg |
Tabel 1: korte termijn immunosuppressiva protocol. Afgebeeld is het immunosuppressieve protocol voor de eerste 2 weken post-transplantatie de begindosis voor Tacrolimus, mycofenolaat mofetil en prednisolon. Bovendien gericht trog niveaus voor Tacrolimus en mycofenolaat mofetil en de onderhoudsdosis van prednisolon worden weergegeven.
Figuur 3 : Bloedspiegels van de trog voor Tacrolimus. De mediaan en de interkwartielafstand van de niveaus van de bereikte trog voor Tacrolimus over de eerste 2 weken post-transplantatie zijn afgebeeld. Foutbalken geven de interkwartielafstand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Bloedspiegels van de trog voor mycofenolaat mofetil. De mediaan en de interkwartielafstand van trog bloedspiegels van mycofenolaat mofetil over de korte termijn immunosupression periode van 2 weken worden weergegeven. Foutbalken geven de interkwartielafstand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Ondanks staking bij immuunsuppressie na twee weken, periodieke radiologische evaluatie op verschillende tijdstippen (2, 4, 6, 10 en 16 weken) van de bediende juiste hind-limb met x-stralen geopenbaard progressieve bot genezing gedurende de studie periode van 16 weken wanneer gesorteerd twee onafhankelijke en geblindeerde waarnemers (Figuur 5)27,28. Micro-CT analyse op 16th weken werd gebruikt voor het kwantificeren van zowel de volume en de dichtheid van eelt, evenals het overbruggen van biomineralisatie op de host/been VCA kruispunten en bot VCA allotransplant uiterlijk27. Onderhoud van interne fixatie zonder verlies van verlaging of verlies, bevorderd door de nieuwe autogene bloedvoorziening, kon worden aangetoond dat28. Ossaal Unie werd bereikt in alle zijn verbeend (Figuur 6).
Figuur 5: Bone helende progressie meer dan 16 weken. Als u wilt definiëren het bot genezing progressie een niet-lineaire regressiemodel werd gebruikt. De waarde R2 werd gebruikt voor het definiëren van de fit van het model voor de gegevens. Met behulp van een noterend systeem, gebaseerd op anteroposterior en zijwaartse röntgenfoto's de Osseointegratie van het bot dat VCA in het segmentale bot gebrek werd gescoord met een maximum van 25 punten op ander moment op de onderzoeksperiode (2, 4, 6, 10 en 16 weken) door twee wijst onafhankelijke en geblindeerde waarnemers30,31. De niet-lineaire regressiemodel beeldt de mediaan en de interkwartielafstand voor het bot genezing waarden gedurende de onderzoeksperiode (R2 = 0.931) met een continu bone genezing van progressie tot onderlinge aanpassing van de waarde van 25 bij 16 weken. Foutbalken geven de interkwartielafstand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Drie-dimensionale reconstructie van de varkens tibiale diaphysis na micro-berekend tomografische evaluatie. Vertegenwoordiger driedimensionale berekend beeld van de gereconstrueerde tibia met interne plaat fixatie ten 2 x ware grootte. Op 16 weken Unie te voltooien nadat tibiale bone VCAs met chirurgische angiogenese wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Histologisch onderzoek op Haematoxyline-eosine undecalcified gekleurd secties, met behulp van een eerder beschreven schaal sortering van verwerping (geen, mild, matig en ernstig) bleek geen tekenen van ernstige afwijzing, waarbij lichte en matige symptomen van afwijzing kunnen worden aangetoond in drie varkens (Figuur 7)29.
Figuur 7: Representatief beeld van een horizontale Haematoxyline-eosine gekleurd sectie uit een tibiale VCA. Radiopaak silicon oplossing gevulde schepen zijn weergegeven brown (sterretje). Milde endosteale infiltratie en reactie (dikke pijl) wordt met meer dan tweederde van de lacunes die gevuld met osteocytes (pijltje) overeenkomstig levensvatbare bot gezien. 10 X vergroting. Schaal bar = 300 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De transplantatie van gevacuoliseerd allogene bot (bot VCA) kan een toekomstige reconstructieve optie voor grote regiogebonden werden gebreken vertegenwoordigen. De lange-termijn-immunosuppressiva (IS) en moeten zijn belangrijke bijwerkingen vereist voor bot VCA overleven zijn echter moeilijk te rechtvaardigen in deze nonlife-kritische-applications6.
Hoewel ingeteelde stammen van de rat laboratorium uitgebreid in allotransplantation onderzoek gebruikt hebben voor het testen van verschillende benaderingen voor het vermijden van lange-termijn-immuunsuppressie, kunnen varkens modellen bieden aanzienlijke voordelen8,9 . Het Yucatan mini varken is ideaal voor de studie van het complexe proces van bot VCA afwijzing. Fysiologisch, het nieuwe bot vorming tarief is vergelijkbaar voor de mens (varkens 1,2-1,5 µm per dag; mensen 1.0-1.5 µm per dag respectievelijk)32. Anatomische overeenkomsten inschakelen het gebruik van orthotopic botreconstructie in wezen identiek chirurgische implantaten en technieken gebruiken. Wellicht belangrijker nog, de welomschreven varkens alloresponse-mogelijk gemaakt door de vooruitgang in varkens cytokine opsporing en ontwikkeling van anti-varkens cluster van differentiatie antilichamen-maakt dit en andere VCA bestudeert strengere33.
Net als in een vergelijkbare klinische toepassing, de methode van varkens tibiale defect botreconstructie met bot die VCA technisch veeleisende is, vereisen een twee team aanpak met voldoende chirurgische expertise in microvasculaire chirurgie en wederopbouw ter been reproduceerbare resultaten bereiken. Strikte handhaving van steriele intraoperatieve omstandigheden en perioperatieve antibiotische profylaxe zijn verplicht in te verminderen het risico van infectieuze complicaties.
In vorige studies met ratten en konijnen gehandhaafd op korte termijn IS levensvatbaarheid van gevacuoliseerd bot allotransplants in de eerste 2 weken door perfusie van het bot VCA via haar allogene nutriënten schip. Nadat bij immuunsuppressie terugtrekking ontvanger afgeleid schepen binnen verstrekt het Wallenberg kanaal neovascularization waardoor op lange termijn bot VCA genezing en levensvatbaarheid10,11,12. Aan het eindpunt van de studie kunnen aanzienlijke allotransplant chimerism gedetecteerde34,35,,36. We hebben vooruitgang geboekt en onze rat en het konijn goed vastgelegde methode toegepast op het varkens model. Dit model is haalbaar voor het testen van een nieuw middel om weefsel levensvatbaarheid zonder op lange termijn IS in bot VCA onderzoek, met behulp van chirurgische angiogenese van geïmplanteerde autogene vaartuigen gecombineerd met op korte termijn IS, effectief schakelen het bot verkeer van allogene autogene schepen.
Een grote voordeel van dit model ten opzichte van andere bestaande varkens bot met VCA modellen is het ontwerp van de orthotopic waardoor functionele evaluatie van gewicht lager en de beoordeling van de mechanische eigenschappen, gegevens die vooral sparse14, 37. het complex mechanisme van lokale en systemische bot VCA afwijzing kan gemakkelijk worden gecontroleerd door middel van radiologische en histologische evaluatie van het allotransplanted-tibiale bot-segment alsmede moleculaire biologische analyse van het perifere bloed. Uiteindelijk kan de lage morbiditeit van de chirurgische bot VCA procedure op lange termijn bot VCA overleven en analyse.
Stabiele interne fixatie, juiste allogene tibiale bot segment lijf en apposition uitlijning zijn cruciaal voor het toestaan van ambulation van de varkens op de eerste postoperatieve dag en vereisen zorgvuldige prechirurgische planning. De methode die we hebben geselecteerd met behulp van een speciaal ontworpen snijden mal voor nauwkeurige en reproduceerbare bot resectie gecombineerd met plaat osteosynthese is stabiel genoeg voor het toelaten van stijve fixatie in allotransplants, zelfs in die met minimale grootte incongruenties.
Een beperking van de gepresenteerde techniek is dat het niet dat beoordeling van verschillende weefsel onderdelen als huid en spier naast de gevacuoliseerd bot-component toestaat. Terwijl een samengestelde flap met inbegrip van verschillende weefsel componenten mogelijk is, is dit model ontworpen om exclusieve bot allotransplantation bestuderen aangezien de immunogeniciteit van verschillende VCA weefsel compontents38 verschilt.
Kortom, bevat dit artikel informatie voor de vaststelling van een reproduceerbare grote diermodel met gedefinieerde genetica voor bot VCA onderzoek. Dit model kan dienen als basis voor toekomstige studies, onderzoek naar de invloed van chirurgische angiogenese op bot doorbloeding en bot remodeling en kan elimineren de noodzaak voor lange termijn immunosuppressiva. Bovendien kan het worden gebruikt te bakenen het complexe proces van bot VCA afwijzing en andere innovatieve immuun f strategieën te testen. Gedefinieerde SLA-haplotypes en kwantificering van het SRY-genen bij varkens geslacht-mismatched mogelijk is bepaling van de omvang van de chimerism van het allotransplant en het perifere bloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de divisie van Media Support Services, Mayo Clinic Rochester, MN voor videoproductie en Georgios Kotsougianis voor het bewerken van de video. De uitstekende illustratie werd uitgevoerd door Jim Postier, Rochester, MN. Bovendien, de auteurs bedank de Duitse research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft) voor salaris ondersteuning voor Dr. Dimitra Kotsougiani (DFG subsidie: KO 4903/1-1). Dit werk werd gesteund door een gulle gift van Tarek E. Obaid. Dit werk werd uitgevoerd in het microvasculaire onderzoekslaboratorium, departement van orthopedische chirurgie Mayo Clinic Rochester, MN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine | VetTek, Bluesprings, MO | N/A | 2mg/kg |
| Telazol | Pfizer Inc., NY, NY | 2103 | 5mg/kg |
| Buprenorphine | Zoo Pharm, Windsor, CO | N/A | 0.18mg/kg |
| Cefazoline | Hospira, Lake Forest, IL | RL-4539 | 1g |
| Ethilon sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | BV 130-5 | 9-0 |
| Locking plate | DePuy Synthes Vet, West Chester, PA | VP4041.09 | 9-hole 3.5mm locking plate |
| Vicryl sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | J808T | 2-0, 3-0 |
| Tegaderm | 3M Health Care, St. Paul, MN | 16006 | 15x10cm |
| Hickman catheter | Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT | 600560 | 9.6 French |
| Carprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | 1760R-60-06-759 | 4mg/kg |
| Tacrolimus | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 973975 | (0.8-1.5mg/kg/day) |
| Mycophenolate Mofetil | Sandoz Inc., Princeton, NJ | 772212 | (50-70mg/kg/day) |
| Methylprednisolone sodium succinate | Pfizer Inc., NY, NY | 2375-03-0 | 500 mg |
| Gentamicin | Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS | 1405-41-0 | 3mg/kg |
| Dermabond Prineo | Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico | 6510-01-6140050 | |
| Isoflurane 99.9% 250 ml | Abbott Animal Health | 05260-5 | |
| Lactated Ringer's 1L | Baxter Corporation | JB1064 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Ceftiofur | Pfizer Canada Inc. | 11103 | 5mg/kg |
| Microfil | Flow Tech Inc, Carver, MA | MV-122 | 125 ml |
| Decalcifying Solution | Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK | 8340-1 |
References
- Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
- Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
- Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
- Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
- Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
- Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
- Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
- Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
- Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
- Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
- Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
- Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
- Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
- van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
- Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
- Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
- Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
- Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
- Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
- Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
- Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
- Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
- Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
- Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
- Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
- Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
- Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
- Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
- Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
- Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).
