Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kirurgisk angiogenese i svin Tibial Allotransplantation: en ny stor dyr bein Stangeriaceae sammensatte Allotransplantation modell

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55238
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Microvascular Research Laboratory, Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic

Summary

Nå er alle slags Stangeriaceae sammensatte allotransplantation avhenger av lang-sikt-immunsuppresjon, vanskelig å støtte for ikke-liv-kritiske indikasjoner. Vi presenterer en ny svin tibial VCA-modell som kan brukes til å studere bein VCA og demonstrere bruk av kirurgiske angiogenese å opprettholde bein levedyktighet uten behovet av langsiktig immun-modulering.

Abstract

Segmentinformasjon bentap skyldes traumer, infeksjon kreft og medfødte anomali forblir en rekonstruktiv hovedutfordring. Gjeldende behandlingsalternativer har betydelig risiko for svikt og betydelig sykelighet.

Bruk av bein Stangeriaceae kompositt allotransplantation (VCA) ville tilby både et nært treff resected bein størrelse og form healing og remodeling potensialet i levende bein. I dag er livslang narkotika immunsuppresjon (IS) nødvendig. Orgel-toksisitet, opportunistiske infeksjoner og neoplasm risiko er av bekymring å behandle slike ikke-dødelige indikasjoner.

Vi har tidligere vist at bein og felles VCA levedyktighet kan opprettholdes i rotter og kaniner uten behov for lang-sikt-immunsuppresjon av implantasjon av mottakeren avledede fartøy innen VCA. Det genererer en gjestfrihet, neoangiogenic sirkulasjon målbare flyt og aktive bein remodeling, krever bare 2 uker med er. Som liten dyrene avviker mann vesentlig i anatomi, bein fysiologi og immunologi, har vi utviklet en svin bein VCA modell for å vurdere denne teknikken før klinisk anvendelse er gjennomført. Miniatyr svin er nå mye brukt for allotransplantation forskning, gitt deres immunologic, anatomisk, fysiologiske og størrelse likheter til mann. Her beskriver vi en ny svin orthotopic tibial bein VCA modell å teste rollen gjestfrihet kirurgisk angiogenese å opprettholde VCA levedyktighet.

Modell rekonstruerer Segmentinformasjon tibial bein defekter bruke størrelse - og figur-matchet allogene tibial bein segmenter, transplantert over en stor svin leukocytter antigen (SLA) feil i Yucatan miniatyr svin. Næringsstoffer fartøyet reparasjon og implantering av mottakeren avledede gjestfrihet fartøy i medullær kanalen allogene tibial bein segmenter utføres i kombinasjon med samtidige kortsiktige er. Dette tillater en neoangiogenic gjestfrihet sirkulasjon å utvikle fra implantert vevet, opprettholde flyten gjennom allogene næringsstoffer skipene i kort tid. Når etablert, vedlikeholder nye gjestfrihet sirkulasjon bein levedyktighet etter opphør av medikamentell behandling og påfølgende næringsstoffer fartøyet trombose.

Introduction

Store Segmentinformasjon osseous feil resultat traumer, infeksjon eller lem-sparing kirurgi etter kreft. Gjeldende rekonstruktiv alternativer som Stangeriaceae gjestfrihet Bentransplantering, bein transport, protese erstatning, og cryopreserved nekrose allografts, brukes alene eller i kombinasjon, er knyttet til betydelige sykelighet og har høy komplikasjoner1,2,3.

Tilstedeværelsen av en mikrovaskulær nettverk er viktig for dannelsen og homeostase av bein, støtter osteogenic, chondrogenic og mesenchymal stamceller nødvendig for bein reparasjon4.

Transplantasjon av levende allogene bein, en form for Stangeriaceae sammensatte vev allotransplantation (bein VCA), utført med Mikrokirurgiske anastomose av sin nærings pedicle, kan representere en fremtidig rekonstruktiv alternativ. Som cryopreserved allogene bein, er umiddelbar stabilitet levert av stemmer godt overens bein defekt morfologi. Som gjestfrihet Stangeriaceae pode, gir forbedret healing og ombygging av levende bein vev. Hinder i noen allotransplant prosedyre er fortsatt behov for lang-sikt-immunsuppresjon (IS). Problemet er mer akutt muskel vev, som krever narkotika doser 2 - 3 ganger større enn organ transplants5. Samtidig risikoen inkludert orgel-toksisitet, kreft, infeksjon eller utvikling av graft - versus - host sykdom er vanskelig å rettferdiggjøre i disse nonlife kritiske applikasjoner6. Episoder av akutte og kroniske avvisning beholdes imidlertid et stort problem med gjeldende langsiktige er7. Kontinuerlige arbeid tett kamp histocompatibility antigener, indusere donor-spesifikke toleranse og/eller forbedre narkotika immunterapi har ikke ennå rutinemessig klart tillater klinisk medikamentfri vev overlevelse8,9.

Vi har tidligere vist midler til å opprettholde bein VCA levedyktighet og styrke bein remodeling i små dyr modeller av fremme en ny gjestfrihet sirkulasjon i transplantert bein. Dette gjøres ved ytterligere bruk av kirurgiske angiogenese implantert gjestfrihet vev10,11,12. Allogene bein segmenter transplanteres microsurgically med anastomose av næringsstoffer bein segmentet pedicle. I tillegg er vert-avledet fartøy implantert inn medullær kanalen av allogene Stangeriaceae bein segmentet. Underveis 2 ukers opprettholdes patency av allogene næringsstoffer fartøyet med narkotika immunsuppresjon. Etter er-uttak, den næringsstoffer pedicle vil til slutt thrombose13. Nye kapillær sengen, basert på verten-avledet skipene gir tilstrekkelig sirkulasjon for å opprettholde vev levedyktighet. Bein healing og remodeling er forbedret siden osteogenesis angiogenese er kombinert10,11,12. Ingen ytterligere immunterapi kreves og bein levedyktighet opprettholdes langsiktige tross en immunologisk kompetent vert og fravær av donor-spesifikke toleranse.

Oversettelse av denne romanen Ben allotransplantation i klinisk praksis bør beste innledes med videre studier av healing, mekaniske egenskaper og immunologi i en stor dyr modell. Svin modellen er ideell for slike VCA forskning14,15,16. Miniatyr svin er sammenlignbare i størrelse og anatomi mann, slik at skjelettlidelser rekonstruksjon bruker identisk kirurgisk implantater og teknikker. Svin immunologi er godt definert, inkludert svin leukocytter antigen (SLA) haplotypes og blod typer, nødvendig for hårtransplantasjon. Celle avstamning studier er mulig med sex-Feilkoblede transplantasjon, som er detaljerte analyser immunreaksjoner17,18,19,20,21.

Her beskriver vi en bein VCA allotransplantation modell i Yucatan miniatyr svin, egnet for studiet av Segmentinformasjon bentap og gjenoppbygging. Denne modellen kan brukes til å undersøke samspillet mellom kirurgisk angiogenese og kortsiktige er på bein VCA overlevelse og funksjon, inkludert osteocyte avstamning, bein blodstrøm, healing og remodeling kapasiteter, alloresponsiveness og biomekanikk også til teste andre innovative immun modulatory strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Mayo klinikken Rochester. Yucatan miniatyr svin var serverer både givere og mottakere under denne kirurgiske VCA-prosedyren. Sammenkoblingen av giver og mottaker var basert på DNA sekvensen svin leukocytter antigen (SLA) haplotyping å sikre en stor konflikt i SLAs 22,23. Dyrene var alder og vekt-samsvar og identiske blodtype. To kirurgisk lag samtidig høstet svin tibial bein segment med sine næringsrike fartøy fra donor og forberedt at mottakeren skal motta orthopically plassert allogene tibial bein segmentet. Samtidig med mikrovaskulær reparasjon av bein næringsstoffer fartøyet, ble en mottaker-avledet Arteriovenøs bunt plassert innen gjestfrihet angiogenese tibial segmentet.

1. presurgical forberedelser

  1. Rask Yucatan miniatyr svin dagen før prosedyren og veie dem kontrollert stoff administrasjon.
  2. Sedate dyr med Xylazine (2 mg/kg) og kombinasjonen av tiletamine HCL og zolazepam HCL (5 mg/kg), administrert subcutaneously.
  3. Plasser et perifere kateter i en øre stemning for intravenøs narkotika og saltvann levering og administrere buprenorfin (0,18 mg/kg) og forebyggende antibiotika (1 g cefazoline intravenøs og 5 mg/kg ceftiofur intramuskulær).
  4. Barbere den høyre hindlimb og venstre halsen som vil tjene som harvest for Stangeriaceae tibial bein segmentet og området for plassering av de Sentralt venekateter, henholdsvis.
  5. Sjekk vitale og nivået av sedasjon tester avslapning av munnen muskler.
  6. Intubate dyr med en passende størrelse endotracheal tube sternal recumbency24.
  7. Overføre miniatyr svin å operasjonsbordet og koble til en ventilator maskin for vedlikehold av anestesi ved administrasjon av isoflurane (1-3%).
  8. Bekreft bedøvende dybden ved testing palpebral, pupillary lys og hornhinnen reflekser.
  9. Overvåke oksygenmetning med en puls oksymeter overføring sonde knyttet til øret. Bruk en blodtrykk mansjett og temperatur sonde for overvåking av intraoperativ vitale tegn.
  10. Plass Yucatan miniatyr svin i supine posisjon på en oppvarming pad. I tillegg bruke en tvungen luft oppvarming teppe under operasjonen for å hindre nedkjøling.
  11. Bruk vet salve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi.

2. innhøstingen av et Stangeriaceae Tibial bein Segment

  1. Vask høyre benet for hver miniatyr svin povidon-jod løsning. Tørr hud med et sterilt håndkle og drapere enden i et sterilt mote. Innhylle og isolere lem med en jod impregnert selvklebende snitt drapere å minimere risikoen for forurensning.
  2. Utføre et snitt med en skalpell anterolaterally i hindlimb, begynner på kneleddet, utvider distally langs den fremre kanten av tibia tibiotalar leddet.
  3. Dissekere huden og underhud vev med saks og trekke fremre kammer musklene fra tibia sidelengs.
    Merk: Utgivelsen av tibialis fremre muskel opprinnelse forenkler eksponering. Interosseous membranen er nå utsatt.
  4. Identifisere skallen tibial arterien og vene (for senere bruk som Arteriovenøs bunt i kirurgiske angiogenese).
    Merk: Skallen tibial arterien og venen ligger på fremre overflaten av interosseous membranen.
  5. For å forbedre operativ synsfelt, slipp en del fra tibial fremre muskelen fra sin innsetting og fjerne en del av tibial ryggen ved hjelp av en oscillerende så.
  6. Beskytte skallen tibial fartøyene, incise interosseous membran begynnelsen på nivå med tibial tuber med en saks.
  7. Visualisere caudal tibial fartøyene, kjører distally under membranen.
    Merk: De gren fra skallen tibial fartøyene og gi opphav til den næringsstoffer pedicle av tibial diaphysis bare distale til tuber. Det er nå mulig å visualisere næringsstoff foramen og fartøy registrerer tibia på bakre lateral overflaten bare distale tibial tuber.
  8. Tag den næringsstoffer pedicle med en microclamp. Demonter ikke vaskulære pedicle.
  9. Identifisere en muskel gren i tibial fremre skuffen i nærheten av nærings foramen; Dette kan brukes for anastomose til Stangeriaceae Ben allotransplant næringsstoffer fartøyet. Merk den muskel delen med en microclamp.
  10. Innhøstingen av et 3,5 cm tibial bein segment inkludert vaskulær pedicle.
    1. Bruk en kutte gigg for å sikre en presis og reproduserbar bein resection. Posisjon og fastsette kutte jig på medial overflaten av tibia inkludere næringsstoff foramen og fartøy.
      1. Guidet av dekopaj, utføre parallelle bein kutt med en oscillerende så fjerne et 3,5 cm tibial segment. Bruk samme plassering og jig både giver og mottaker dyr for å maksimere størrelsen - og figur-Sammenlign.
  11. Når begge kutt er gjort med oscillerende så, rotere tibial bein segmentet for å visualisere den næringsstoffer pedicle på bakre overflate. Del av næringsstoffer pedicle på sin opprinnelse fra skallen tibial arterien med saks. Analysere og gratis tibial segmentet med saks, og en tynn mansjett av periosteum og muskler på overflaten.
  12. Trekke tibial bein segmentet og heve tibial bein segmentet med sin vaskulær pedicle med en skarp klemme, forlater skallen tibial arterien i stedet.
    Merk: Stangeriaceae bein segmentet er nå klar for mikrovaskulær overføring og en 3,5 cm tibial bein defekt er opprettet i hver Yucatan miniatyr svin.
  13. Ligate cranial tibial fartøyene på ankelen med absorberbare polyglactin 3-0 bildet, frigjøre dem med en mansjett av perivascular vev for å opprette en Arteriovenøs (AV)-pakke. La suturer minst 5 cm lang å lette implantation i tibial bein segmentet.

3. Orthotopic Tibial bein VCA gjenoppbygging i kombinasjon med kirurgisk angiogenese

  1. Utveksle høstet tibial bein segmentene med sin nærings pedicles mellom de to dyr å bruke dem som Ben VCAs.
    1. For å tillate passasje av skallen tibial Arteriovenøs (AV) bunt til tibial bein segmentet, kan du fjerne V-formet segmentet fra webområdet proksimale krysset bruke oscillerende så.
    2. Bore et hull med 0,5 cm diameter i den nedre del av tibial bein defekt siden og inn i medullær kanalen av tibial bein segmentet og introdusere mottaker AV bunt som har vært samskrevet distally, i intramedullary kanalen å fremme påfølgende gjestfrihet nytt blod forsyning.
  2. Plass Stangeriaceae tibial bein segmentet orthotopically i mottakerens feilen.
    1. Anastomose næringsstoffer pedicle i et tibial bein segment forberedt muskel grenen av tibial fremre kupé i en slutt-til slutt måte ved hjelp av enkel avbrutt Sutur teknikken og 9-0 suturer25.
  3. Bekrefte patency av mikrovaskulær anastomose bruker melking test26.
  4. Oppnå osteosynthesis ved hjelp av en 9-hulls 3,5 mm låsing plate.
    1. Sted 9-hulls plate tibia anteromedially. Fastsette platen med tre bicortical skruer over og under tibial bein segmentet. I tillegg setter unicortical skruer i tibial bein segmentet interne fiksering. For å bekrefte riktig plassering av benet VCA og plate, bruk anteroposterior og lateral radiographs.
  5. Utføre fascial og lagdelt huden nedleggelse bruker avbrutt 3-0 og 2-0 absorberbare suturer. Endelig forsegle såret med en occlusive gjennomsiktig dressing.

4. Sentralt venekateter plassering i jugulare eksterne vene

  1. For postoperativ Rusgiften Administrasjonen og suppressive (IS) stoffet overvåkning, plasserer du en venekateter i eksterne vena jugularis bruker en åpen teknikk. Utfør plasseringen ved avslutningen av allotransplantation prosedyren under anestesi (se avsnitt 1).
    1. Utføre et anterolaterale snitt i nakken med en skalpell. Dissekere subkutant vev med saks og utsette venstre vena jugularis.
    2. Plassere et Hickman kateter i vena jugularis gjennom et lite hull i eksterne vena jugularis og fest den med ikke-absorberbare suturer. Exteriorize kateter i ryggen av tunneling subcutaneously.
    3. Sikre kateter å huden og nær halsen i lag med avbrutt 3-0 og 2-0 absorberbare suturer.
    4. Plass occlusive bandasjer over innsnitt. Bruk en fishnet bandasje for å holde bandasjer og kateter på plass.

5. postoperativ behandling og oppfølging

  1. Behandle Yucatan miniatyr svin med en intramuskulær injeksjon av carprofen (4 mg/kg) for postoperativ analgesi umiddelbart etter operasjonen. Administrere buprenorfin (0,18 mg/kg) for å behandle smerter av høy intensitet etter behov.
  2. Tillate grisen å gjenopprette for 60 min og deretter returnere grisen til en spesiell intensivavdelingen panne og skjermen tett inntil fullstendig gjenoppretting.
  3. Flytte Yucatan miniatyr svin en normal bur og ad lib tilgang til vann og mat.
  4. Administrere takrolimus (0,8-1.5 mg/kg/dag) og mycophenolate mofetil (MMF) (50-70 mg/kg/dag) muntlig og metylprednisolon natrium succinate intravenøst (starter med 500 mg/dag) i to uker.
  5. Justere daglige doser av suppressive medikamenter ifølge gjennom blodet, satsing for 5.0-30,0 ng/mLfor takrolimus og 1.0-3,5 µg/mL for MMF, henholdsvis. Redusere dosen av metylprednisolon gradvis til vedlikehold dose av 50 mg per dag.
  6. Administrere forebyggende antibiotika gentamicin (3 mg/kg intravenøst) og ceftiofur (5 mg/kg intramuskulært) for to uker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beskrevet teknikken ble gjennomført i fire SLA store umake Yucatan miniatyr svin og Segmentinformasjon tibial feil rekonstruert bruke størrelse-matchet tibial VCA. Samtidige næringsstoffer fartøyet reparasjon av bein allotransplant og implantering av en AV pakke fra mottakeren dyret i allotransplant medullær kanalen tillatt både umiddelbare bein sirkulasjon og utviklingen av en ny gjestfrihet blodtilførsel over tid (figur 1). 16 uker hadde en neoangiogenic sirkulasjon blitt etablert i alle tibial VCAs, visualisert ved mikro-beregnet tomographic (mikro-CT) angiography etter injeksjon av en kan lett identifiseres angiographic polymer (125 ml) i femur båtene og få bort forkalkning tibial VCA (figur 2).

Figure 1
Figur 1 : Orthotopic tibial bein VCA prosedyren. Diagram som viser den kirurgiske prosedyren. (A) Donor prosedyre: av tibial bein segment med sine næringsrike pedicle. (B) utveksling av tibial bein segmentene mellom store SLA Feilkoblede griser. (C) mottaker prosedyre: Arteriovenøs bunt implantasjon: skallen tibial fartøy nøye inn medullær kanalen. (D) mikrovaskulær anastomose av det næringsstoffet pedicle muskel gren av den fremre tibial kupé og plate osteosynthesis av tibial diaphysis. Brukt med tillatelse fra Mayo Foundation for medisinsk utdanning og forskning. Alle rettigheter reservert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representativt 3D mikro-CT angiographic bilde av et decalcified tibial VCA segment. Neongiogenic sirkulasjon (gul pil) er avbildet etter perfusjon med en kan lett identifiseres silisium løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Miniatyr svin viste ingen tegn til nød eller selv-mutilation. Alle sår leget uten infeksjon og dyr ambulated normalt, til slutt kunne bære fulle vekten på styres høyre lem fra første postoperativ dag på. På studien endepunktet på 16th uker alle Yucatan miniatyr svin hadde vunnet over 150% av sin opprinnelige kroppsvekt (pretransplant: 56.0 ± 6.1 versus 16 uker posttransplant: 84.5 ± 6.0).

To uker av immunsuppresjon, bestående av takrolimus, ble mycophenolate mofetil (MMF) og metylprednisolon succinate brukt til å opprettholde blodstrømmen gjennom nærings pedicle før en ny gjestfrihet blodtilførsel hadde blitt etablert i den allogene Ben allotransplant. 2 på hverdager ble immunsuppresjon periodiske blodprøver tatt fra den jugulare kateter å vurdere narkotika blodet. Doser ble justert for å opprettholde gjennom blod nivåer av 5-30 ng/ml for takrolimus og 1-3,5 µg/ml for MMF (tabell 1). Ingen narkotika relaterte komplikasjoner oppstått og rettet gjennom nivåer for takrolimus og mycophenolate mofetil kunne oppnås (Figur 3 og Figur 4).

Immunsuppressive Innledende dose Gjennom nivåer Vedlikehold dose
Takrolimus 0,8-1.5 mg/kg/dag 5-30 ng/ml
Mycophenolate Mofetil 50-70 mg/kg/dag 1-3 µg/ml
Metylprednisolon natrium succinate 500 mg 50 mg

Tabell 1: kort sikt immunsuppresjon protokollen. Avbildet er suppressive protokollen de første to ukene post transplantasjon med startdosen for takrolimus, Mycophenolate mofetil og prednisolon. I tillegg rettet gjennom nivåer for takrolimus og Mycophenolate mofetil og opprettholdelsen dose av prednisolon vises.

Figure 3
Figur 3 : Gjennom blod nivåer for takrolimus. Median og interquartile rekke oppnås gjennom nivåene for takrolimus over de første 2 uker innlegg transplantasjon er avbildet. Feilfelt betegne den interquartile rekkevidden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Gjennom blod nivåer for Mycophenolate mofetil. Median og interquartile rekke gjennom blod nivåer av Mycophenolate mofetil i kortsiktige immunosupression periode 2 uker vises. Feilfelt betegne den interquartile rekkevidden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Til tross for opphør av immunsuppresjon etter to uker, periodiske radiologiske evaluering på ulike tidspunkt (2, 4, 6, 10 og 16 uker) av styres høyre hind lem røntgenstråler avslørt progressiv bein healing over studien perioden 16 uker når gradert etter to uavhengige og blendet observatører (figur 5)27,28. Mikro-CT analyse på 16th uker ble brukt om å kvantifisere både volumet og tettheten av callus, samt bygge bro bein formasjon på verten/bein VCA veikryss og bein VCA allotransplant utseende27. Vedlikehold av interne fiksering uten tap av reduksjon eller tapt, fremmet av nye gjestfrihet blod forsyning, kunne vist28. Osseous union ble oppnådd i alle tibias (figur 6).

Figure 5
Figur 5: Bein helbredende progresjon over 16 uker. Definere benet healing progresjon en ikke-lineær regresjonsmodell ble brukt. Verdien R2 ble brukt til å definere passformen til modellen til dataene. Ved hjelp av et poengsystem basert på anteroposterior og lateral røntgenbilder osseointegration av benet VCA i Segmentinformasjon bein feilen ble scoret med en maksimumsverdi på 25 poeng på ulike tidspunkt peker over studietiden (2, 4, 6, 10 og 16 uker) to uavhengige og blendet observatører30,31. Den ikke-lineære regresjonsmodellen viser median og interquartile rekkevidde for at benet healing verdier over studietiden (R2 = 0.931) viser en kontinuerlig bein healing progresjon noenlunde tilsvarende verdien av 25 for 16 ukens. Feilfelt betegne den interquartile rekkevidden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : 3-dimensjonal modell av svin tibial diaphysis etter mikro-beregnet tomographic evaluering. Representant tredimensjonale beregnet bilde av rekonstruert tibia med interne plate fiksering på 2 x faktisk størrelse. 16 uker å fullføre union etter tibial bein VCAs med kirurgisk angiogenese vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Histologiske analyse på hematoxylin-eosin undecalcified farget deler, med en tidligere beskrevet skala gradering avvisning (ingen, mild, moderat og alvorlig) viste ingen tegn til alvorlig avvisning, hvilke det kan tenkes mild og moderat tegn på avvisning demonstrert i tre griser (figur 7)29.

Figure 7
Figur 7: Representativt bilde av en vannrett hematoxylin-eosin farget delen fra en tibial VCA. Kan lett identifiseres silisium løsning-fylt fartøyene vises brown (stjerne). Mild endosteal infiltrasjon og reaksjon (tykk pil) er sett med to tredeler av Lakuner fylt med osteocytes (små pil) i samsvar med levedyktig bein. 10 X forstørrelse. Skala bar = 300 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transplantasjon av Stangeriaceae allogene bein (Ben VCA) kan representere et fremtidig rekonstruktiv alternativ for store Segmentinformasjon osseous mangler. Behov for lang-sikt-immunsuppresjon (IS) og sin betydelige bivirkninger nødvendig for bein VCA overlevelse er imidlertid vanskelig å rettferdiggjøre i disse nonlife kritiske applikasjoner6.

Selv om innavlet stammer av laboratoriet rotta har blitt brukt mye i allotransplantation forskning for å teste ulike tilnærminger for å unngå lang-sikt-immunsuppresjon, kan svin modeller gi betydelige fordeler8,9 . Yucatan mini grisen er ideell for studiet av den komplekse prosessen med bein VCA avvisning. Fysiologisk, den nye Ben formasjon hastigheten er sammenlignbare med mann (griser 1.2-1.5 µm per dag, mennesker 1.0-1.5 µm per dag henholdsvis)32. Anatomisk likheter aktivere bruken av orthotopic bein rekonstruksjon bruker identisk kirurgisk implantater og teknikker. Kanskje viktigst, veldefinerte svin alloresponse-gjorde det mulig etter fremgang i svin cytokin gjenkjenning og utvikling av anti-svin cluster for differensiering antistoffer-gjør dette og andre VCA studier strengere33.

Som alle lignende klinisk anvendelse, metoden for svin tibial bein defekt rekonstruksjon med bein VCA teknisk krevende, krever to team tilnærming med tilstrekkelig kirurgisk kompetanse i mikrovaskulær kirurgi og bein gjenoppbygging for å oppnå reproduserbar resultater. Strenge vedlikehold av sterile intraoperativ forhold og perioperative antibiotika prophylaxis er obligatorisk å redusere risikoen for smittsomme komplikasjoner.

I tidligere studier med rotter og kaniner opprettholdt kortsiktige er levedyktigheten til Stangeriaceae Ben allotransplants i de første to ukene gjennom perfusjon av benet VCA gjennom sin allogene næringsstoffer fartøy. Når immunsuppresjon uttak mottakeren avledet fartøy innen oppgitt medullær kanalen neovascularization slik at langsiktig bein VCA healing og levedyktighet10,11,12. På studien sluttpunktet kunne betydelig allotransplant chimerism oppdaget34,35,36. Vi har flyttet frem og anvendt vår rotte og kanin veletablerte metode på porcine modell. Denne modellen er mulig å teste en ny måte å opprettholde vev levedyktighet uten langsiktige er i bein VCA forskning, med kirurgisk angiogenese fra implantert gjestfrihet fartøy kombinert med kortsiktige er, effektivt bytte bein sirkulasjon fra allogene til gjestfrihet fartøy.

En stor fordel av denne modellen over andre eksisterende svin bein som inneholder VCA modeller er dens orthotopic design muliggjør funksjonelle evaluering av vekt bærende og vurdering av mekaniske egenskaper, data som er spesielt sparsom14, 37. kompleks mekanisme lokale og systemisk bein VCA avvisning kan lett overvåkes gjennom radiologiske og histologic vurdering av allotransplanted tibial bein segmentet samt molekylær biologiske analyse av perifert blod. Til slutt kan lav sykelighet av kirurgiske bein VCA prosedyren langsiktige bein VCA overlevelse og analyse.

Stabil interne fiksering, riktig allogene tibial bein segmentet apposition og lemmer justering er avgjørende for at ambulation av griser første postoperativ dag og krever nøye presurgical planlegging. Metoden har vi valgt å bruke en spesielt utformet kutte gigg for presis og reproduserbar bein resection kombinert med platen osteosynthesis er tilstrekkelig stabilt for å tillate stive fiksering i allotransplants, selv i de med minimal størrelse uoverensstemmelser.

En begrensning av presentert teknikken er at den ikke tillater vurdering av ulike vev komponenter som hud og muskel foruten komponenten Stangeriaceae bein. En sammensatt klaff inkludert ulike vev komponenter er mulig, er denne modellen utviklet for å studere eksklusive bein allotransplantation som immunogenisitet av ulike VCA vev compontents varierer38.

I konklusjonen, inneholder denne artikkelen informasjon for å etablere en reproduserbar store dyr modell med definerte genetikk for bein VCA forskning. Denne modellen kan tjene som grunnlag for fremtidig studier undersøke påvirkning av kirurgiske angiogenese på bein blodstrøm og ubalanse og kan eliminere behovet for langsiktig immunsuppresjon. Videre kan det brukes til å avgrense den komplekse prosessen med bein VCA avvisning og teste andre innovative immun modulatory strategier. SLA-haplotypes og kvantifisering av SRY-gener i sex-Feilkoblede griser kan bestemme omfanget av chimerism av allotransplant og perifert blod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker divisjon av Media støttetjenestene, Mayo Clinic Rochester, MN for videoproduksjon og Georgios Kotsougianis for redigering av video. Utmerket kunstverket ble utført av Jim Postier, Rochester, MN. I tillegg forfatterne ønsker å takke tyske research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft) for å gi lønn støtte for Dr. Dimitra Kotsougiani (DFG grant: KO 4903/1-1). Dette arbeidet ble støttet av en sjenerøs gave fra Tarek E. Obaid. Dette arbeidet ble utført i mikrovaskulær forskningslaboratoriet, avdeling Ortopedisk kirurgi Mayo Clinic Rochester, MN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine VetTek, Bluesprings, MO N/A 2mg/kg
Telazol Pfizer Inc., NY, NY 2103 5mg/kg
Buprenorphine Zoo Pharm, Windsor, CO N/A 0.18mg/kg
Cefazoline Hospira, Lake Forest, IL RL-4539 1g
Ethilon sutures Ethicon, Sommerville, NJ BV 130-5 9-0
Locking plate DePuy Synthes Vet, West Chester, PA VP4041.09 9-hole 3.5mm locking plate
Vicryl sutures Ethicon, Sommerville, NJ J808T 2-0, 3-0
Tegaderm 3M Health Care, St. Paul, MN  16006 15x10cm
Hickman catheter Bard Access System Inc., Salt Lake City, UT 600560 9.6 French
Carprofen Zoetis Inc., Kalamazoo, MI 1760R-60-06-759 4mg/kg
Tacrolimus Sandoz Inc., Princeton, NJ  973975 (0.8-1.5mg/kg/day)
Mycophenolate Mofetil  Sandoz Inc., Princeton, NJ  772212 (50-70mg/kg/day) 
Methylprednisolone sodium succinate Pfizer Inc., NY, NY 2375-03-0 500 mg
Gentamicin Sparhawk Laboratories, Lenexa, KS 1405-41-0 3mg/kg 
Dermabond Prineo Ethicon, San Lorenzo, Puerto Rico 6510-01-6140050
Isoflurane 99.9% 250 ml Abbott Animal  Health  05260-5
Lactated Ringer's 1L Baxter Corporation JB1064
Saline 0.9%, 1 L Baxter Corporation 60208
Ceftiofur Pfizer Canada Inc. 11103 5mg/kg
Microfil Flow Tech Inc, Carver, MA MV-122 125 ml
Decalcifying Solution Thermo Fisher Scientific, Chesire, WA, UK 8340-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ham, S. J., et al. Limb salvage surgery for primary bone sarcoma of the lower extremities: long-term consequences of endoprosthetic reconstructions. Ann Surg Oncol. 5, 423-436 (1998).
  2. Niimi, R., et al. Usefulness of limb salvage surgery for bone and soft tissue sarcomas of the distal lower leg. J Cancer Res Clin Oncol. 134, 1087-1095 (2008).
  3. Tukiainen, E., Asko-Seljavaara, S. Use of the Ilizarov technique after a free microvascular muscle flap transplantation in massive trauma of the lower leg. Clin Orthop Relat Res. , 129-134 (1993).
  4. Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24, 1347-1353 (2009).
  5. Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plast Reconstr Surg. 47, 425-431 (1971).
  6. Ravindra, K. V., Wu, S., McKinney, M., Xu, H., Ildstad, S. T. Composite tissue allotransplantation: current challenges. Transplant Proc. 41, 3519-3528 (2009).
  7. Lantieri, L., et al. Face transplant: long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388, 1398-1407 (2016).
  8. Brent, L. B. Tolerance and its clinical significance. World J Surg. 24, 787-792 (2000).
  9. Utsugi, R., et al. Induction of transplantation tolerance with a short course of tacrolimus (FK506): I. Rapid and stable tolerance to two-haplotype fully mhc-mismatched kidney allografts in miniature swine. Transplantation. 71, 1368-1379 (2001).
  10. Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived neoangiogenesis with short-term immunosuppression allows incorporation and remodeling of vascularized diaphyseal allogeneic rabbit femur transplants. J Orthopaedic Res. 27, 763-770 (2009).
  11. Kremer, T., et al. Surgical angiogenesis with short-term immunosuppression maintains bone viability in rabbit allogenic knee joint transplantation. Plast Reconstr Surg. 131, 148e-157e (2013).
  12. Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. A modified vascularized whole knee joint allotransplantation model in the rat. Microsurgery. 30, 557-564 (2010).
  13. Ohno, T., Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Host-derived angiogenesis maintains bone blood flow after withdrawal of immunosuppression. Microsurgery. 27, 657-663 (2007).
  14. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
  15. Solla, F., et al. Composite tissue allotransplantation in newborns: a swine model. J Surg Res. 179, e235-e243 (2013).
  16. Ustuner, E. T., et al. Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies. Microsurgery. 20, 400-406 (2000).
  17. Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Anim Genet. 41, 428-432 (2010).
  18. Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Anim Genet. 40, 468-478 (2009).
  19. Morin, N., Metrakos, P., Berman, K., Shen, Y., Lipman, M. L. Quantification of donor microchimerism in sex-mismatched porcine allotransplantation by competitive PCR. BioTechniques. 37, 74-76 (2004).
  20. van Dekken, H., Hagenbeek, A., Bauman, J. G. Detection of host cells following sex-mismatched bone marrow transplantation by fluorescent in situ hybridization with a Y-chromosome specific probe. Leukemia. 3, 724-728 (1989).
  21. Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. Am J Transplant. 14, 343-355 (2014).
  22. Smith, D. M., Martens, G. W., Ho, C. S., Asbury, J. M. DNA sequence based typing of swine leukocyte antigens in Yucatan miniature pigs. Xenotransplantation. 12, 481-488 (2005).
  23. Ho, C. S., et al. Nomenclature for factors of the SLA system, update 2008. Tissue Antigens. 73, 307-315 (2009).
  24. Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Fruhauf, N. R., Kuhne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. J Surg Res. 130, 73-79 (2006).
  25. Alghoul, M. S., et al. From simple interrupted to complex spiral: a systematic review of various suture techniques for microvascular anastomoses. Microsurgery. 31, 72-80 (2011).
  26. Acland, R. Signs of patency in small vessel anastomosis. Surgery. 72, 744-748 (1972).
  27. Kotsougiani, D., et al. Recipient-derived angiogenesis with short term immunosuppression increases bone remodeling in bone vascularized composite allotransplantation: A pilot study in a swine tibial defect model. J Orthopaedic Res. , (2016).
  28. Riegger, C., et al. Quantitative assessment of bone defect healing by multidetector CT in a pig model. Skeletal Radiol. 41, 531-537 (2012).
  29. Buttemeyer, R., Jones, N. F., Min, Z., Rao, U. Rejection of the component tissues of limb allografts in rats immunosuppressed with FK-506 and cyclosporine. Plast Reconstr Surg. 97, 149-151 (1996).
  30. Taira, H., Moreno, J., Ripalda, P., Forriol, F. Radiological and histological analysis of cortical allografts: an experimental study in sheep femora. Arch Orthop Trauma Surg. 124, 320-325 (2004).
  31. Giessler, G. A., Zobitz, M., Friedrich, P. F., Bishop, A. T. Transplantation of a vascularized rabbit femoral diaphyseal segment: mechanical and histologic properties of a new living bone transplantation model. Microsurgery. 28, 291-299 (2008).
  32. Laiblin, C., Jaeschke, G. Clinical chemistry examinations of bone and muscle metabolism under stress in the Gottingen miniature pig--an experimental study. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift. 92, 124-128 (1979).
  33. Saalmuller, A. Characterization of swine leukocyte differentiation antigens. Immunol Today. 17, 352-354 (1996).
  34. Pelzer, M., Larsen, M., Friedrich, P. F., Aleff, R. A., Bishop, A. T. Repopulation of vascularized bone allotransplants with recipient-derived cells: detection by laser capture microdissection and real-time PCR. J Orthopaedic Res. 27, 1514-1520 (2009).
  35. Muramatsu, K., Kurokawa, Y., Kuriyama, R., Taguchi, T., Bishop, A. T. Gradual graft-cell repopulation with recipient cells following vascularized bone and limb allotransplantation. Microsurgery. 25, 599-605 (2005).
  36. Muramatsu, K., Bishop, A. T., Sunagawa, T., Valenzuela, R. G. Fate of donor cells in vascularized bone grafts: identification of systemic chimerism by the polymerase chain reaction. Plastic and reconstructive surgery. 111, 763-777 (2003).
  37. Vossen, M., et al. Bone quality and healing in a swine vascularized bone allotransplantation model using cyclosporine-based immunosuppression therapy. Plast Reconstr Surg. 115, 529-538 (2005).
  38. Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast Reconstr Surg. 87, 401-411 (1991).

Tags

Medisin problemet 126 gris translasjonsforskning Segmentinformasjon bein defekter VCA kirurgisk angiogenese svin
Kirurgisk angiogenese i svin Tibial Allotransplantation: en ny stor dyr bein Stangeriaceae sammensatte Allotransplantation modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kotsougiani, D., Hundepool, C. A.,… More

Kotsougiani, D., Hundepool, C. A., Willems, J. I., Friedrich, P., Shin, A. Y., Bishop, A. T. Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model. J. Vis. Exp. (126), e55238, doi:10.3791/55238 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter