Introduction
Mitochondriale bioenergetica en respiratoire capaciteit kan worden onderzocht niet alleen gepermeabiliseerde cellen of vezels, maar ook in geïsoleerde mitochondriën. In de huidige studie beschrijven we een protocol om intact skeletspieren mitochondriën met behulp van differentiële centrifugatie voor hoge-resolutie respirometrie metingen te isoleren.
Intact mitochondria isoleren respirometrie, het weefsel gehomogeniseerd en mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie gebruikelijke methode. De differentiële centrifugatie methode waarbij in de centrifugaties (in een reeks van toenemende snelheid) weefsel homogenaten werd eerst geïntroduceerd door Pallade en medewerkers bijna 70 jaar geleden 1. Het weefsel wordt eerst fijngehakt met een schaar en mechanisch gehomogeniseerd in een glazen homogenisator met een loszittende stamper. Daarna het homogenaat wordt gecentrifugeerd bij lage snelheid en de resulterende pellet die ononderbroken weefsel bevat, cellulairepuin en kernen wordt weggegooid. Vervolgens wordt de bovenstaande vloeistof meerdere malen gecentrifugeerd bij hoge snelheid en de mitochondriale verrijkte fractie wordt verzameld. De voordelen van de differentiële centrifugatie methode voor het isoleren mitochondria dat: i) de werkwijze is snel en mitochondria kunnen worden geïsoleerd binnen 1-1,5 uur (respiratoire experimenten worden uitgevoerd zo snel mogelijk); ii) het is goedkoop; en iii) het is zeer efficiënt en verkregen door differentiële centrifugatie mitochondria zuiver genoeg voor respirometrie assays. De nadelen van differentiële centrifugatie methode voor het isoleren mitochondria zijn dat i) mitochondriën kunnen beschadigd raken en ontkoppeld tijdens homogenisering; ii) de verontreiniging van mitochondriën met andere cellulaire componenten (kan worden opgelost door verder wassen van het mitochondriale pellet extra centrifugatiestappen); iii) de mogelijkheid tot het selecteren van verschillende mitochondriale subpopulaties, bijvoorbeeld tijdens differentiële centrifugering stappen, mitochondria met lagere dichtheid kan worden uitgesloten 7; en iv) de cellulaire mitochondriale omringende ontbreekt en alleen de theoretische maximale ademhaling kan worden gemeten. Een andere werkwijze voor mitochondria isoleren respirometrie assays is de dichtheidsgradiënt centrifugatie 2. In deze techniek wordt het weefsel extract gelaagd over een oplossing van sucrose of een Percoll gradiënt (met hogere dichtheid op de bodem van de centrifugebuis) en gecentrifugeerd bij een bepaalde snelheid, waardoor de mitochondriën te isoleren uit andere cellulaire componenten op basis van hun dichtheden. Deze werkwijze wordt vaak gebruikt om de hersenen mitochondriën geïsoleerd met zeer lage verontreiniging uit synaptosomen. Echter, de rattenlever mitochondriën geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie sterk verontreinigd met andere cellulaire organellen 3. Een van de beperkingen van deze methode is dat de sucrosegradiënt in de centrifugebuis zo kan scheurenme mitochondria (osmotische shock).
Afhankelijk van het type weefsel; er enkele belangrijke factoren te overwegen voor de isolatie van intacte mitochondriën door differentiële centrifugatie. Allereerst moet weefsels homogeniseren op een zachte manier. Zachte weefsels zoals de nieren, de hersenen en lever nodig zachte mechanische krachten die tijdens homogenisering. Dit in tegenstelling tot harde weefsels zoals hart en skeletspier sterker mechanische krachten vereisen. Gehakt weefsel wordt gewoonlijk behandeld met proteinase vóór de homogenisatie om het weefsel te verzachten. Alle buffers tijdens homogenisatie en centrifugatie moet ijskoud zijn en een fysiologisch relevante pH met een ionische sterkte en osmotische geschikt cytosol 4, 5.
Een van de voordelen van het bestuderen geïsoleerd mitochondriale bioenergetica dat cellulaire plasmamembranen hoeft te zijn permeabiseerd met detergentia zoals digitonine en saponine 4, 6, waarbij de buitenste mitochondriale membraan integriteit in gevaar kan brengen. Een ander voordeel van de geïsoleerde mitochondria is de afwezigheid van andere cytosolische factoren, die kunnen interfereren met de analyse van de mitochondriële functies zoals zuurstofconsumptie. De nadelen van het gebruik van de geïsoleerde mitochondriën de mogelijke selectie van bepaalde mitochondriale populatie tijdens de centrifugatiestappen, schade aan de mitochondriën tijdens homogenisatie, en het vereiste van grote hoeveelheden biologische monsters om een goede opbrengst van geïsoleerde mitochondria 7, 8 te verkrijgen.
Na de isolatie procedure, de luchtwegen tarieven van de mitochondriale complexen I, II en IV-afhankelijke (staten 2, 3 en 4) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie. Voor complexe innovatie aangestuurde ademhaling, glutamaaten malaat worden toegevoegd, gevolgd door adenosine difosfaat (ADP). Voor complexe II aangedreven ademhaling, succinaat wordt toegevoegd gevolgd door ADP. Voor complexe IV aangedreven ademhaling, ascorbaat en tetramethylphenylendiamine (TMPD) worden toegevoegd gevolgd door ADP 9, 10, 11, 12. State 2 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van alleen substraten. State 3 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van substraten en ADP. Staat 4 verwijst naar het zuurstofverbruik na ADP uitputting. De respiratoire controle ratio (RCR) is een index van koppeling van zuurstofverbruik ATP productie wordt berekend als de verhouding tussen toestand 3 en 4 staat 13, 15.
Samengevat beschrijven we een protocol om functionele en intacte skeletspier mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie en gebruikt deze geïsoleerde mitochonDria voor functionele en bio-energetische studies zoals hoge-resolutie respirometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De quadriceps spieren biopsie wordt genomen uit een verdoofd varken, waarvan mitochondria geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Het varken wordt daarna gebruikt voor een ander experiment. Het onderzoek wordt uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en met de goedkeuring van de Animal Care Committee van het kanton Bern, Zwitserland.
1. Skeletal Muscle homogenisering en Mitochondriale Isolation
- Accijnzen 5-10 g quadriceps specimen van een verdoofde varkens. In deze assay gebruikt varkens skeletspieren. Dit protocol kan ook gebruikt worden om mitochondriën uit andere soorten te isoleren (bijvoorbeeld rat, muis, mens, enz.).
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd door een medisch specialist met expertise in de chirurgie.- Sedate varkens intramusculair ketamine (20 mg / kg) en xylazine (2 mg / kg), voor anesthesie geïnduceerd met intraveneuze midazolam (0,5 mg / kg, plus atropine 0,02 mg / kg). Onderhouden anesthesie met continue intraveneuze infusie van propofol (4-8 mg / kg per h) en fentanyl (30 ug / kg per h) gedurende de operatie.
- Onmiddellijk Dompel het weefselmonster in een bekerglas met 20 ml ijskoude mitochondriale isolatie buffer (Tabel 1).
OPMERKING: Buffers die tijdens homogeniseren en centrifugeren moet ijskoud zijn en een fysiologisch relevante pH met een ionische sterkte en osmotische geschikt cytosol. - Weeg het weefselmonster in de beker op een analytische weegschaal getarreerd. Tarreer de balans met het bekerglas met 20 ml isolatiebuffer.
- Plaats het bekerglas op een ijsemmer.
LET OP: Voer alle van de volgende stappen voor de homogenisering procedure bij de ijsemmer temperatuur en houden alle buffers op het ijs emmer. - Hak de skeletspier in de beker (te houden op het ijs) in 1-2 mm kleine stukjes voor 3-4 min met behulp van fijne scissors.
- Spoel het gehakt weefsel in het bekerglas tweemaal met ijskoude isolatiebuffer (20 ml per wasstap).
- Suspendeer het weefsel in 10 volumina van de isolatiebuffer weefsel per gewicht (g) die 5 mg protease / g weefsel.
- Plaats het bekerglas in een ijsbad op de magneetroerder en roer gedurende 10 min.
- Verdun de suspensie in het bekerglas met extra 10 volumes isolatiebuffer het weefsel per gewicht (g) aangevuld met 0,2% (w / v) ontvette runderserumalbumine (BSA).
- Decanteren alle isolatie buffer aangevuld met 0,2% BSA en spoel het weefsel in het bekerglas tweemaal met ijskoude isolatiebuffer aangevuld met 0,2% BSA (20 ml per wasstap).
- Resuspendeer het weefsel in 10 volumes isolatiebuffer weefsel per gewicht (g) aangevuld met 0,2% BSA met ontvette.
- Homogeniseren het weefsel met een semi-automatische glazen homogenisator (bewaard op ijs) met een wijde stamper (10 slagen).
LET OP: Homogenize het weefsel altijd op dezelfde manier (evenveel slagen, bijvoorbeeld 10 slagen). Een hoger aantal slagen kunnen beschadigen en ontkoppelen van de mitochondriën. Voorkeur Homogeniseer het weefsel met behulp van een geautomatiseerde homogenisator. Handmatig (en subjectief) gehomogeniseerd weefselmonsters in glazen homogenisatoren kunnen verschillende kwaliteiten van geïsoleerde mitochondria te produceren. - Centrifugeer het gehomogeniseerde weefsel bij 4 ° C gedurende 10 min bij 10.000 x g.
OPMERKING: Alle centrifugeren stappen worden uitgevoerd in centrifuges met vaste hoek rotors. - Verwijder het supernatant met behulp van een serologische pipet en resuspendeer de pellet in BSA-gesupplementeerd ijskoude isolatiemedium (10 ml / g weefsel).
- Centrifugeer de suspensie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 350 x g.
- Reserveer de bovenstaande vloeistof met behulp van een serologische pipet en gooi de pellet (cellulaire afval).
- Filtreer de bovenstaande vloeistof in een bekerglas (op ijs gehouden) via twee lagen gaas (17 draden / cm 2) naar cel DEBR verwijderenis.
- Centrifugeer de gefilterde suspensie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ruwe mitochondriale isolatie buffer (5 ml / g weefsel) aangevuld met 0,2% (w / v) BSA en centrifugeer de suspensie bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ruwe mitochondriale wasbuffer (tabel 1). Centrifugeer de suspensie opnieuw bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ruwe mitochondriale wasbuffer en centrifugeer de suspensie opnieuw bij 4 ° C gedurende 10 min bij 7000 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de ruwe mitochondriale pellet in 1,0 ml wasbuffer.
- Bepaal de eiwitconcentratie van de mitochondriale schorsing en houden de geconcentreerde mitochondriale schorsing op ijs.
OPMERKING: Eiwit-concentratie kan worden gemeten met behulp van een standaardmethode. - net voorte testen respirometrie, resuspendeer de mitochondriale ademhaling suspensie in de buffer tot een eindconcentratie van 0,4 mg / ml mitochondriaal eiwit.
2. Hoge-resolutie respirometrietest
- Pipetteer 2,1 ml ademhaling buffer (Tabel 1) 16 in een hoge-resolutie oxygraph kamer en roer de buffer continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C gedurende 1 uur totdat een stabiele zuurstofflux signaal polarografische de zuurstofsensor wordt verkregen.
LET OP: Polarografische zuurstof elektroden binnen elke oxygraph kamer meet de zuurstofconcentratie en bereken zuurstofverbruik (flux) in elke kamer. De zuurstofconcentratie en zuurstofverbruik (flux) worden real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyse. Bovendien, om nauwkeurige en betrouwbare resultaten, moeten instrumentele zuurstof achtergrondcorrectie wordenuitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Nauwkeurig 2,1 ml ademhaling buffer wordt toegevoegd aan de kamer voor kalibratie van een definitieve kamervolume van 2,0 ml na het sluiten van de stoppers. - Voer een lucht kalibratie van het polarografische zuurstofsensor volgens de protocollen van de fabrikant 17.
OPMERKING: Bij lucht kalibratie met een gasfase aanwezig is, zal de media zuurstofconcentratie equilibreren in de orde van 15-20 minuten. Afhankelijk van de temperatuur, luchtdruk en oplosbaarheid van concentratie media -oxygen kan worden berekend. - Na de lucht kalibratie, zuigen de ademhaling medium uit de oxygraph kamer en voeg 2,1 ml van geïsoleerde mitochondriale suspensie (0,4 mg / ml mitochondriaal eiwit) uit stap 1,24 tot een kamer van het oxygraph.
LET OP: Het volume van de ademhaling buffer is afhankelijk van de set-up instrument en fabrikant. Voor hoge resolutie respirometrie, de 2,1 ml van de ademhaling buffer wordt toegevoegd aan de kamer voor kalibratie van een definitieve kamervolume van 2,0 ml na het sluiten van de stoppers. - Sluit de oxygraph kamer door het inbrengen van de stop.
- Roer de mitochondriale suspensie continu met een magnetische roerstaaf in de kamer (700 rpm) bij 37 ° C en opnemen cellulaire ademhaling bij basislijn gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
LET OP: De zuurstofconcentratie en zuurstof flux signaal worden weergegeven in real-time online in een computer met behulp van software voor data-acquisitie en analyse 17. - Daarna injecteren substraten en remmers voor mitochondriële ademhaling via titanium injectieopeningen van de stoppen met behulp van de volgende standaard protocollen.
3. Complex I-afhankelijke Ademhaling
- Bereid een oxygraph cupje met de geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2.1-2.5 en procedurewachten op een stabiele signaal.
- Injecteer 12,5 gl 0,8 M malaat (5 mM eindconcentratie) en 10 pl 2 M glutamaat (10 mM eindconcentratie) in de oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) door de titanium injectiepoort van de kamer stop en opnemen cellulaire ademhaling gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
Opmerking: Alle injecties in de volgende stappen worden uitgevoerd door het titanium injectieopeningen van stoppers via spuiten. - Injecteer 10 pi van 0,05 M ADP (0,25 mM) in de kamer door de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop en mitochondriale respiratie opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt, neemt dan af en stabiliseert (3-5 min).
LET OP: Het plateau van de ademhaling na ADP Daarnaast geeft aan dat ADP concentratie was hoog en verzadigende. Afhankelijk van de hoeveelheid mitochondriën tijdens ademhaling dient ADP concentratie getitreerdvoor een stabiele toestand 3 zuurstofverbruik (maximale ademhaling). Toevoeging van ADP aan het mitochondriale suspensie tot een toename van het zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal induceren stijgen (toestand 3 ademhaling). Nadat de ADP wordt verbruikt, zal de zuurstof flux signaal te verlagen (toestand 4 ademhaling).
4. Complex II-afhankelijke Ademhaling
- Bereid een oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2,1-2,5 beschreven en wachten op een stabiele signaal procedure.
- Injecteer 2 pl van 0,2 mM rotenon (0,2 uM) "PAS" in de kamer via de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop met een injectiespuit en de cellulaire ademhaling gedurende 3-5 min opnemen tot een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
LET OP: Rotenon is een gevaarlijk gif en kunnen een aanzienlijke impact hebben op de menselijke gezondheid. - Injecteer 20 pi van 1 M succinaat (10 mM) in de oxygraph chamber en opnemen mitochondriale ademhaling gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Injecteer 10 pi van 0,05 M ADP (0,25 mM) in de kamer door de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop en cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal toeneemt, stabiliseert, neemt dan af en stabiliseert (3-5 min).
OPMERKING: Toevoeging van ADP aan het mitochondriale suspensie tot een toename van het zuurstofverbruik en de zuurstofstroom signaal induceren stijgen (toestand 3 ademhaling). Nadat de ADP wordt verbruikt, zal de zuurstof flux signaal te verlagen (toestand 4 ademhaling).
5. Complex IV-afhankelijke Ademhaling
- Bereid een oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2,1-2,5 van het protocol en wacht op een stabiele signaal beschreven procedure.
- Injecteer dan 2,5 ui 0,8 mM ascorbaat (1 mM). Onmiddellijk daarna injecteren 2,5 ui 0,2M TMPD (0,25 mM) en 10 ui 0,05 M ADP (0,25 mM) in de kamer en opnemen oxygraph cellulaire ademhaling totdat de zuurstofstroom signaal toeneemt en stabiliseert (3-5 min).
- Tenslotte Injecteer 10 pi van 1 M natrium azide (5 mM) PAS "in de oxygraph kamer en cellulaire ademhaling opnemen tot zuurstofstroom signaal af en stabiliseert.
OPMERKING: Natriumazide is een gevaarlijk gif en kunnen een aanzienlijke impact hebben op de menselijke gezondheid.
6. cytochroom C Test
- Bereid een oxygraph kamer die geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) volgens de in stappen 2,1-2,5 van het protocol en wacht op een stabiele signaal beschreven procedure.
- Injecteer 12,5 gl 0,8 M malaat (5 mM eindconcentratie) en 10 pl 2 M glutamaat (10 mM eindconcentratie) in de kamer die oxygraph geïsoleerde mitochondriële suspensie (0,4 mg / ml) via de injectiepoort titanium van de kamer stopperen opnemen cellulaire ademhaling gedurende 3-5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
- Injecteer 10 uL 0,5 M ADP (2,5 mM) in de kamer door de oxygraph titanium injectiepoort van de kamer stop en opnemen mitochondriale ademhaling totdat de zuurstofstroom signaal toeneemt, neemt dan af en stabiliseert (3-5 min).
- Tenslotte Injecteer 5 ul van 4 mM cytochroom c (10 uM) in de kamer en oxygraph opnemen cellulaire ademhaling gedurende 5 minuten totdat een stabiele zuurstofflux signaal wordt bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Complex I-afhankelijke ademhaling
Geïsoleerde mitochondriële complex I-afhankelijke ademfrequentie (staten 2, 3 en 4) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie (figuur 1, een representatief diagram). Mitochondriale complex I substraten glutamaat en malaat, worden toegevoegd gevolgd door de toevoeging van ADP. State 2 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van de substraten alleen. State 3 verwijst naar zuurstofverbruik in aanwezigheid van de substraten en ADP. Staat 4 verwijst naar het zuurstofverbruik na ADP uitputting. RCR is een index van de koppeling van zuurstofverbruik ATP productie wordt berekend als de verhouding tussen toestand 3 en toestand 4. Zoals getoond in figuur 1, na toevoeging van ADP, de mitochondriale ademhaling toeneemt onmiddellijk (state 3 ademhaling) en dan daalt (toestand 4 ademhaling) tot een niveau zeer similar aan die van de staat 2. Dit wijst op een hoog RCR en dat mitochondriale integriteit is goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. Figuur 2 is een representatief diagram van meting van een lage toestand 3 ademhalingssnelheid en RCR, met een hoge toestand 4 ademhalingsfrequentie te geven ongepaste en mislukte mitochondriale isolatie. Een hoge ademhaling snelheid toestand 4 is een indicator van mitochondriale proton leakiness 15.
Figuur 1: Succesvolle mitochondriale isolatie: mitochondriale integriteit is goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp van glutamaat en malaat als substraten (complex I-afhankelijke ademhaling). De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). de oxygen concentratie neemt af in de tijd als geïsoleerde mitochondria van de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mislukte mitochondriale isolatie: mitochondriale integriteit is niet goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure aangeeft ongepast mitochondriale isolement. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp van glutamaat en malaat als substraten (complex I-afhankelijke ademhaling). De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstofconcentratie neemt na verloop van tijd als geïsoleerde mitochondriën gebruik maken van de available zuurstof. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Complex II-afhankelijke ademhaling
Geïsoleerde mitochondriële complex II-afhankelijke ademfrequentie (staten 2, 3 en 4) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie (Figuur 3 een representatief diagram). Voor deze test wordt de mitochondriale complex I geremd door de toevoeging van rotenon, en succinaat (complex II substraat) wordt toegevoegd gevolgd door ADP. Figuur 3 blijkt dat bij toevoeging van ADP, de mitochondriale ademhaling onmiddellijk optreedt, en vervolgens daalt tot sterk op die van toestand 2, wat aangeeft goed gekoppelde mitochondriën en datmitochondriale integriteit is goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. De berekende waarde RCR hiervoor typisch experiment is 4,23, wat goed overeen met de in de literatuur 10, 11, 23) waarden. Figuur 4 is een representatief diagram van meting van een lage toestand 3 ademhalingssnelheid en RCR, met een hoge toestand 4 ademhalingsfrequentie aangeeft ongeschikt isolatie.
Figuur 3: Succesvolle mitochondriale isolatie: mitochondriale integriteit is goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp succinaat als substraat (complex II-afhankelijke ademhaling). De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling vanzuurstofconcentratie). De zuurstofconcentratie neemt na verloop van tijd als geïsoleerde mitochondria van de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Mislukte mitochondriale isolatie: mitochondriale integriteit is niet goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure aangeeft ongepast isolement. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp succinaat als substraat (complex II-afhankelijke ademhaling). De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstofconcentratie neemt na verloop van tijd als geïsoleerde Mitochondria gebruik maken van de beschikbare zuurstof. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Complex IV-afhankelijke ademhaling
Geïsoleerde mitochondriële complex IV-afhankelijke ademfrequentie (staten 2, 3) worden bepaald met behulp van hoge-resolutie respirometrie (figuur 5 een representatief diagram). Voor deze test ascorbaat / TMPD en ADP toegevoegd, gevolgd door natriumazide complexe IV remmen.
Het verschil tussen zuurstofconsumptie vóór en na toevoeging van natriumazide wordt geïnterpreteerd als de echte complex IV ademhaling. Figuur 5 is een representatief diagram van MEASURement van een hoog complex IV-afhankelijke toestand 3 ademhalingsfrequentie aangeeft dat mitochondriale integriteit goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. Daarentegen figuur 6 is een representatief diagram van meting van een lage toestand 3 aangeeft ongeschikt isolatie.
Figuur 5: Succesvol mitochondriale isolatie: mitochondriale integriteit is goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp ascorbaat / TMPD als substraat (complex IV-afhankelijke ademhaling). Complex IV ademhaling (toestand 3) wordt geïnterpreteerd door het aftrekken van het zuurstofverbruik vóór en na de toevoeging van natriumazide. De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstofconcentratie neemt na verloop van tijd als geïsoleerde mitochondria de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Mislukte mitochondriale isolatie: mitochondriale integriteit is niet goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure aangeeft ongepast isolement. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp ascorbaat / TMPD als substraat (complex IV-afhankelijke ademhaling). Complex IV ademhaling (toestand 3) wordt geïnterpreteerd door het aftrekken van het zuurstofverbruik vóór en na de toevoeging van natriumazide. De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstof concentration neemt af in de tijd als geïsoleerde mitochondria van de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Evaluatie van de buitenste mitochondriale membraan integriteit via cytochroom c
Om de kwaliteit van mitochondriale preparaat evalueren, wordt cytochroom c-test uitgevoerd op mitochondriale buitenste membraan integriteit, door meting van mitochondriale respiratie bepalen na daaropvolgende toevoeging van glutamaat en malaat, ADP en cytochroom c (ADP gestimuleerd complex II-afhankelijke state 3 respiratie in de aanwezigheid van cytochroom c). Zoals getoond in figuur 7, heeft cytochroom c geen verbetering complex I-afhankelijke state 3 re inspiratie van de geïsoleerde mitochondria, wat aangeeft dat er geen verlies van cytochroom c van het mitochondriale membraan en buitenste mitochondriale integriteit behouden.
Figuur 7: Cytochroom c niet verbeteren ademhaling van de geïsoleerde mitochondriële: mitochondriale integriteit is goed bewaard gebleven tijdens de isolatie procedure. Traces van de hoge-resolutie respirometrie behulp van glutamaat / malaat als substraat (complex I-afhankelijke ademhaling). De blauwe lijn geeft zuurstofconcentratie. De rode lijn geeft de zuurstoftoevoer (helling van de zuurstofconcentratie). De zuurstofconcentratie neemt na verloop van tijd als geïsoleerde mitochondria van de beschikbare zuurstof te gebruiken. Zuurstofverbruik wordt uitgedrukt als pmol / (sx mg mitochondriaal eiwit).m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Mitochondriale isolatiebuffer | |
| Chemisch | Concentratie |
| KCl | 100 mM |
| MgSO4 | 10 mM |
| morpholinopropane sulfonzuur (MOPS) | 50 mM |
| ethyleendinitrilotetra zuur (EGTA) | 1,0 mM |
| ATP | 1,1 mM |
| pH 7,4 | |
| Mitochondriale wasbuffer | |
| Chemisch | Concentratie |
| KCl | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| pH 7,4 | |
| Mitochondriale ademhaling buffer 16 | |
| Chemisch | Concentratie |
| sucrose | 110 mm |
| EGTA | 0,5 mM |
| MgCl2 | 3,0 mM |
| KCl | 80 mM |
| K-lactobionaat | 60 mM |
| KH 2 PO 4 | 10 mM |
| taurine | 20 mM |
| Hepes 20 mM | |
| BSA | 1,0 g / l |
| pH 7,1 | |
Tabel 1: Samenstelling van buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie beschrijven we een protocol van hoge kwaliteit, intact en nauw verbonden skeletspier mitochondria door differentieel centrifugeren kan worden gebruikt voor functionele studies zoals hoge-resolutie respirometrie isoleren.
Om intact en nauw verbonden mitochondria isoleren, zijn er enkele kritische punten in het onderhavige protocol te worden beschouwd. Na het oogsten van het skelet weefsel moet meteen ondergedompeld in ijskoude mitochondriale isolatiebuffer. Alle centrifugatie stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C en mitochondriale suspensie moet altijd op ijs gedurende geïsoleerd gehouden. De isolatieprocedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Het homogenaat Centrifugeer in schone detergentvrij centrifugebuizen. Aan het einde van de procedure, moet de mitochondriale suspensie geconcentreerde gehouden en verdund juist voor respirometrie. Sinds respirometrie gegevens worden uitgedrukt als pmol per seconde per milligram mitochondriale eiwitten, is het belangrijk om een goede techniek een nauwkeurige meting van mitochondriale eiwitconcentratie na de isolatie.
In sommige mitochondriale isolatieprocedures, kan het gebeuren dat de mitochondriën ontkoppeld of geen zuurstof verbruikt goed met behulp van hoge-resolutie respirometrie. Om deze problemen te overwinnen, moet het weefsel gehomogeniseerd altijd op dezelfde manier (evenveel slagen) met de homogenisator met wijde stamper (stap 1.12). Hier hebben we het skelet spierweefsel homogeniseren altijd een geautomatiseerd homogenisator met 10 slagen. Een hoger aantal slagen kunnen beschadigen en ontkoppelen van de mitochondriën. Handmatig (en subjectief) gehomogeniseerd weefselmonsters in glazen homogenisatoren kunnen verschillende kwaliteiten van geïsoleerde mitochondria te produceren. Het bevriezen van de mitochondriën kunnen opleveren ongekoppelde mitochondriën en men moet ervoor zorgen dat centrifugeringen worden uitgevoerd bij 4 ° C en niet onder deze temperature. De mitochondriale integriteit kunnen ook worden aangetast indien de pH van de bufferoplossingen onjuist of centrifugeren buizen niet schoon. Men moet ervoor zorgen dat het centrifugeren buizen detergent-vrij en op de juiste gewassen.
Een eerste belangrijke factoren gedurende isolatie moet worden onderzocht weefsels homogeniseren op een zachte manier. Zachte weefsels vereisen zachte mechanische krachten die tijdens homogenisering, terwijl harde weefsels vereisen veel sterker mechanische krachten. Buffers die tijdens homogeniseren en centrifugeren moet ijskoud zijn en een fysiologisch relevante pH met een ionische sterkte en osmotische geschikt cytosol. Voor harde weefsels zoals skeletspier, na mechanische homogenisering, proteasen zoals trypsine kunnen worden toegevoegd aan het weefsel 4, 5 verder splitsen.
Enkele beperkingen van geïsoleerde mitochondria, gebaseerd op differential centrifugeren zijn i) de eventueel beschadigde mitochondriën tijdens de homogenisering en isolatiewerkwijze 19, ii) de grote hoeveelheden van de weefselmonsters die voor de mitochondriale isolatie, iii) het mogelijke verlies en veranderingen in bepaalde mitochondriale elektronentransportketen complexen subeenheden tijdens homogenisatie en centrifugatie stap 18, en iv) de toegenomen productie van reactieve zuurstofsoorten tijdens homogenisatie en centrifugatie stappen, die kunnen interfereren met mitochondriale functie 18. De voordelen van de dounce homogenisering en differentiële centrifugatie methode ruwe mitochondria respiratoire experimenten isoleren ten opzichte van bestaande methoden zoals dichtheid gradiënt centrifugatie 20 zijn dat de werkwijze snel en mitochondriën geïsoleerd binnen een korte tijd. Daarom luchtwegen experimenten kan worden uitgevoerd binnen 1h. Daarnaast is de procedure is goedkoop, zeer efficiënt en verkregen door differentiële centrifugatie mitochondriën kan worden gebruikt voor respirometrie assays. Het onderzoek naar de mitochondriale zuurstofverbruik met behulp van geïsoleerde mitochondria biedt een aantal voordelen ten opzichte van gepermeabiliseerde vezels of cellen: geen significante interferentie met cytosolische eiwitten die kunnen interfereren met de mitochondriale functie en bio-energetica; overbodig cellulaire permeabilisatie; en substraten van de mitochondriale ademhalingsketen complexen kunnen direct naar geïsoleerde mitochondria worden toegevoegd.
Een van de alternatieven voor skeletspieren mitochondriale respiratie te meten is het gebruik gepermeabiliseerde spiervezels 9. Enkele voordelen van de gepermeabiliseerde spiervezels over geïsoleerde mitochondria i) geen mechanische homogenisering stap nodig is en, ii) zeer kleine hoeveelheden weefsel (enkele mg) nodig voor respirometrie assays. Het nadeel van permeabilized spiervezels is de onderste zuurstofdiffusie naar de mitochondriën in de vezelbundel. Deze diffusie beperking vergt grotere hoeveelheden ADP tijdens respirometrie assays. Een andere alternatieve methode is het gebruik van hele weefsel homogenaten 22, dat een zeer snelle manier en niet differentiële centrifugatie stappen mitochondria isoleren vereisen. Gebruik van hele weefsel homogenaat kunnen tijdens de isolatie, waardoor ongeveer mitochondria voorkomen, maar er kunnen andere cytosolische factoren aanwezig, die kunnen interfereren met de analyse van de mitochondriële functies zoals zuurstofconsumptie.
Na het beheersen van het differentieel centrifugeren ruwe mitochondria isoleren voor respiratoire assays, een toekomstige toepassing is om de luchtwegen capaciteiten van mitochondriën geïsoleerd via opkomende technieken te onderzoeken zoals het gebruik van mitochondriale buitenste membraan anti-TOM22 (translocase van de buitenste mitochondriale membraan 22 homoloog) antilichaam-coupled magnetische korrels 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
