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Developmental Biology

नियमित Immunocytochemical विशेषता के लिए सीरम मुक्त परिस्थितियों में मानव IPSCs के छोटे पैमाने पर प्रचार

Published: February 18, 2017 doi: 10.3791/55260
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurology, The University of Arizona

Introduction

प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में मानव वयस्क दैहिक कोशिकाओं प्रोग्रामिंग (IPSCs) रोग 1, 2 अध्ययन करने के लिए रोगी विशेष कोशिकाओं का एक संभावित असीमित आपूर्ति प्राप्त करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। इन विट्रो में एक बीमारी के लक्षण प्रारूप recapitulating यह प्रशंसनीय रोग के साथ जुड़े सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच के लिए करना होगा, और दवाओं की खोज को बढ़ाने और व्यक्तिगत दवा 3। इसके अलावा, मानव IPSCs (hiPSCs) विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं जो मृत या बेकार कोशिकाओं की जगह है और कई बीमारियों 4 के संदर्भ में, 5 में समारोह बहाल करने के लिए एक अनूठा संसाधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता पाने की संभावना प्रदान करते हैं।

ऊपर अनुप्रयोगों में IPSCs उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त यह सुनिश्चित करना है कि उनके pluripotent और undifferentiated राज्य संस्कृति में विस्तार के दौरान बनाए रखा है। आमतौर पर, techniqइस तरह से फ्लो, पश्चिमी सोख्ता, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और कार्यात्मक assays के रूप में ues, जो कोशिकाओं और विशेष उपकरणों की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है, IPSC pluripotency 6, 7, 8, 9, 10 के विस्तृत विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, IPSCs 'undifferentiated राज्य की दिनचर्या आकलन प्रभावी रूप से विशेष रूप से immunocytochemistry (आईसीसी) के लिए इन कोशिकाओं की सीमित प्रचार के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार कम समय और संसाधनों को शामिल।

हाल के अग्रिमों परिभाषित सीरम मुक्त परिस्थितियों में IPSCs का विकास है, जो पारंपरिक संस्कृति प्रणाली है कि murine fibroblast फीडर परतों और सीरम युक्त मीडिया की आवश्यकता होती है पर एक महत्वपूर्ण सुधार है के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, वर्तमान साहित्य स्पष्ट stepwise प्रोटोकॉल का वर्णन है कि फीडर से IPSCs संक्रमण के लिए कैसे शामिल नहीं हैफीडर मुक्त करने के लिए सिस्टम परत।

इस संदर्भ में, वर्तमान प्रोटोकॉल व्यवस्थित विवरण कैसे विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast पर हो hiPSCs (iMEF) फीडर परतों (1) हो सकता है सीरम मुक्त माध्यम में प्रचार करने के लिए अनुकूल है, और (2) एक छोटे पैमाने पर संवर्धित विशेष रूप से मजबूत समर्थन करने के लिए immunocytochemical विश्लेषण। कुल मिलाकर, इस पद्धति एक नियमित आधार immunocytochemistry का उपयोग करने पर उनकी pluripotency की पुष्टि के लिए सीरम मुक्त परिस्थितियों में मानव IPSCs के प्रचार के लिए एक समय और लागत प्रभावी प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है।

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Protocol

hiPSCs 4 मिमी त्वचा पंच बायोप्सी से अलग और सेंडाइ वायरस की मध्यस्थता reprogramming 11 के माध्यम से घर में reprogrammed मानव त्वचीय fibroblasts से प्राप्त किए गए। एरिजोना संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय के अधीन भर्ती और बायोप्सी संग्रह के लिए सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी।

1. IPSC संस्कृति के लिए बाह्य मैट्रिक्स लेपित सतह की तैयारी

  1. एक दिन पर iMEFs बढ़ रही hiPSC संस्कृतियों के संगम से पहले, बाह्य मैट्रिक्स (Matrigel) लेपित प्लेट तैयार करते हैं।
  2. धीरे गल बाह्य मैट्रिक्स के एक विभाज्य 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में बर्फ पर (बहुत कुछ निर्भर करता है, विवरण पत्र पर दिए गए निर्देशों का पालन करें)।
  3. एक जैव सुरक्षा हुड में, ठंड pipet सुझावों का उपयोग कर (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत), ठंड Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण F-12 के लिए बाह्य मैट्रिक्स के 1 विभाज्य जोड़ने (DMEM / F12 / HEPES) बहुत विशिष्ट कमजोर पड़ने कारक के अनुसार ।
  4. बांटना ~ 60081, प्रत्येक नया सेल संस्कृति के प्रति अच्छी तरह से बाह्य मैट्रिक्स के एल इलाज किया 12 अच्छी तरह से थाली की जरूरत है।
  5. कई घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं। इधर, एक 3 घंटे ऊष्मायन समय का उपयोग करें।
    नोट: प्लेट्स तुरंत इस्तेमाल किया या अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

प्रचार के लिए बाह्य मैट्रिक्स पर iMEF फीडर कोशिकाओं पर हो hiPSCs 2. स्थानांतरण

  1. passaging के दिन, 4 डिग्री सेल्सियस से मैट्रिक्स लेपित प्लेट हटाने और प्लेट टिशू कल्चर हुड में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान को acclimate करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. iMEFs पर बढ़ती hiPSC संस्कृति का एक 6 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से मध्यम Aspirate और 500 μL कोलैजिनेज़ हदबंदी अभिकर्मक के साथ की जगह (1 मिलीग्राम / बेसल संस्कृति के माध्यम में एमएल)।
  3. 30 मिनट तक IPSC कालोनियों के किनारों से थोड़ा उठाने के लिए दिखाई देते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस ~ 10 के लिए सेते हैं।
    नोट: ऊष्मायन समय रेखा निर्भर है और अलग अलग होंगे। एक खुर्दबीन के नीचे हदबंदी मॉनिटर।
  4. गाड़ीefully हदबंदी अभिकर्मक aspirate और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) के साथ धीरे 2 बार धो लें।
  5. 10 एनजी / एमएल रो जुड़े प्रोटीन kinase अवरोध (वाई 27,632 रॉक अवरोध) अच्छी तरह से करने के साथ कमरे के तापमान mTeSR1 पूरा मध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    नोट: इस प्रारंभिक पारित होने के दौरान iMEF वातानुकूलित मध्यम और mTeSR1 के 50:50 मिश्रण इस्तेमाल का सुझाव दिया जाता है और इस मीडिया संक्रमण के दौरान hiPSCs के अस्तित्व के लिए फायदेमंद हो सकता है।
  6. एक छोटे से चरण विपरीत माइक्रोस्कोप हुड के अंदर आंशिक रूप से रखा का उपयोग कर मैन्युअल स्कोर और 1 लेने - 2 hiPSC कालोनियों (~ 700 - 1,000 मीटर व्यास में) एक सिरिंज और सुई (25 जी, 1 आधा में) का उपयोग। एक P200 pipet टिप के साथ मध्यम में कॉलोनी के टुकड़े रन बनाए बंद पुश।
  7. महाप्राण और नए थाली से मैट्रिक्स के निपटान, कोटिंग परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है।
  8. स्थानांतरण 1 वर्ष अच्छी तरह से नए मैट्रिक्स अच्छी तरह से लेपित में रन बनाए IPSCs युक्त से सेल निलंबन के एमएल।
  9. पीएलए37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट सीई, 5% सीओ 2। कई त्वरित, पीछे और आगे में थाली रॉक, और पक्ष की ओर आंदोलनों में समान रूप से कोशिकाओं के प्रसार। 24 घंटे के लिए प्लेट को परेशान मत करो।
  10. mTeSR1 पूरा मध्यम (वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला के अलावा 2.5 कदम में प्रारंभिक चढ़ाना के बाद की जरूरत नहीं है) के साथ दैनिक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करना।

मैट्रिक्स में लिपटे प्लेटों पर hiPSCs 3. छोटे पैमाने पर Passaging

नोट: आम तौर पर, hiPSCs की प्रारंभिक हस्तांतरण लेपित प्लेटों मैट्रिक्स करने के बाद, कोशिकाओं को एक बार फिर एक समान तरीके से सुनिश्चित करने के लिए सभी iMEFs का सफाया कर दिया है और कोशिकाओं फीडर मुक्त करने की स्थिति ढाल लिया है passaged किया जाना चाहिए।

  1. IPSC confluency करने से पहले एक दिन हौसले मैट्रिक्स प्लेटों लेपित तैयार के रूप में 1 अनुभाग में चर्चा की।
  2. पारित होने के दिन, 4 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन से मैट्रिक्स लेपित प्लेट हटाने और प्लेट ऊतक संस्कृति में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान को acclimate करने की अनुमतिसंरचना हुड।
  3. hiPSCs की एक 6 अच्छी तरह से थाली (मूल मैट्रिक्स के लिए फीडर से संक्रमित कर) के 1 अच्छी तरह से मध्यम Aspirate और 500 μL सेल हदबंदी बफर के साथ बदलें।
    नोट: वाणिज्यिक सेल हदबंदी बफर यहां इस्तेमाल किया (देखें सामग्री तालिका) mTeSR1 मध्यम कोलैजिनेज़ की तुलना के साथ प्रयोग के लिए अधिक उपयुक्त है।
  4. 3 के लिए कमरे के तापमान पर सेते - 7 मिनट तक IPSC कालोनियों के किनारों से थोड़ा उठाने के लिए दिखाई देते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, ऊष्मायन समय लाइन पर निर्भर है और चर रहा है। इसलिए, एक खुर्दबीन के नीचे सेलुलर हदबंदी पर नजर रखने के इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए।
  5. ध्यान से हदबंदी बफर aspirate और पीबीएस के साथ धीरे धोने 2 बार।
  6. 10 एनजी अच्छी तरह से करने के लिए / एमएल वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला के साथ कमरे के तापमान mTeSR1 पूरा मध्यम के 500 μL जोड़ें।
  7. इसके बजाय 2.6 चरण में के रूप में स्कोरिंग कालोनियों के, एक P200 टिप का उपयोग कर मीडिया में कालोनियों की वांछित संख्या धक्का और धीरे सेल निलंबन 2 बार एजी triturateआकार में 200 माइक्रोन - ainst अच्छी तरह के एक कोने ~ 50 के झुरमुटों में hiPSC कालोनियों को तोड़ने। प्रत्येक 1 नया अच्छी तरह से में स्थानांतरित करने के लिए 2 कालोनियों - उदाहरण के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए, 1 उठाओ। अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली का एक भी नया अच्छी तरह से पुराने से सेल निलंबन स्थानांतरण।
  8. कई त्वरित, पीछे और आगे में थाली रॉक, और पक्ष की ओर आंदोलनों में समान रूप से कोशिकाओं को बाहर का प्रसार करने के लिए, और एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए प्लेट आराम करते हैं।
  9. mTeSR1 पूरा मध्यम के साथ दैनिक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करना। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, यह प्रारंभिक चढ़ाना के बाद वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है।
    नोट: 3.7 चरण से अप्रयुक्त IPSC कालोनियों इस बिंदु पर आसानी से cryopreserved हो सकता है।

Immunocytochemistry के लिए hiPSCs के बोने के लिए कक्ष स्लाइड और coverslips की तैयारी 4.

नोट: निम्न प्रोटोकॉल 4 अच्छी तरह से प्लास्टिक चैम्बर स्लाइड और appropriat के साथ 12 मिमी कांच coverslips का इस्तेमालबहु-कुओं में मीडिया की ई की मात्रा लागत प्रभावी immunocytochemistry का समर्थन है। हालांकि, मीडिया की मात्रा है, तो बड़े अच्छी तरह से और coverslip आकार के उपयोग वांछित है बढ़ाया जा सकता है।

  1. एक दिन hiPSC संगम से पहले, कक्ष स्लाइड हौसले बाह्य मैट्रिक्स के साथ लेपित के रूप में खंड 1 में चर्चा की तैयार जोड़े पर्याप्त मैट्रिक्स समाधान (~ 300 - 4 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड के प्रति अच्छी तरह से 500 μL) पूरी तरह से कोट प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से किसी भी चिंता के बिना वाष्पीकरण। वैकल्पिक रूप से, बाह्य मैट्रिक्स 500 μL के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से, कोट में 1 से साफ किया और निष्फल coverslip रखने और सुनिश्चित करें कि coverslip समाधान के शीर्ष पर चल नहीं रहा है बनाने के बाद।
  2. पारित होने के दिन, 4 डिग्री सेल्सियस से लेपित कक्ष स्लाइड / coverslips निकालें और टिशू कल्चर हुड में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान को दशानुकूलन अनुमति देते हैं।
  3. hiPSCs की एक 12 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से मध्यम Aspirate और 500 μL हदबंदी बफर के साथ बदलें।
  4. कमरे न्यू यॉर्क में सेते~ 3 के लिए rature - 7 मिनट तक IPSC कालोनियों के किनारों से थोड़ा उठाने के लिए दिखाई देते हैं।
  5. ध्यान से हदबंदी बफर aspirate और अच्छी तरह से करने के लिए 10 एनजी / एमएल वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला के साथ कमरे के तापमान mTeSR1 पूरा मध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  6. एक छोटे से चरण विपरीत माइक्रोस्कोप टिशू कल्चर हुड के अंदर रखा का उपयोग कर मैन्युअल 4 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड या 1 नया coverslip के 1 कॉलोनी / नई अच्छी तरह से लेने चढ़ाया जा करने के लिए (~ 1000 - व्यास में 1,500 माइक्रोन) धक्का द्वारा एक P200 pipet टिप का उपयोग यह बंद माध्यम में थाली की सतह।
  7. नए चैम्बर स्लाइड / coverslip से मैट्रिक्स Aspirate, कोटिंग परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है।
  8. आकार में 200 माइक्रोन - धीरे ~ 50 के झुरमुटों में सेल निलंबन अच्छी तरह hiPSC कालोनियों को तोड़ने के लिए के एक कोने के खिलाफ 2 बार triturate। अच्छी तरह से एक 4 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड / coverslip के प्रत्येक नए कुएं में पुराने से सेल निलंबन के 250 μL स्थानांतरण।
  9. अच्छी तरह से mTeSR1 शेष भाग के साथ 500 μL अप करने के लिए प्रत्येक नए की मात्रा लाओ10 एनजी / एमएल वाई 27,632 रॉक एफडीए aining।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में चैम्बर स्लाइड / coverslips रखें।
  11. 24 घंटे के बाद, mTeSR1 पूरा मध्यम के साथ दैनिक पूर्ण मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं। फिर जैसा कि पहले उल्लेख, वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला के अलावा आवश्यक नहीं प्रारंभिक चढ़ाना के बाद है।

5. immunocytochemistry के लिए IPSCs की तैयारी

  1. एक बार मिला हुआ, कुओं से मीडिया को दूर करने और पूर्व गर्म चेतावनी 4% paraformaldehyde जोड़कर निर्धारण के माध्यम से hiPSC कालोनियों की रक्षा (~ 300 μL / अच्छी तरह से एक 4 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड / coverslip)। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  2. उचित रूप से संस्थागत biohazard और रासायनिक सुरक्षा के दिशा निर्देशों के अनुसार paraformaldehyde त्यागें।
  3. कोशिकाओं पीबीएस के साथ एक बेंच टॉप प्रकार के बरतन पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं।
    नोट: चैम्बर स्लाइड पर कोशिकाओं / coverslips पर्याप्त पीबीएस के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए इस स्तर पर संग्रहित किया जा सकता है।वैकल्पिक रूप से, वे तुरंत आईसीसी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

6. pluripotency मार्कर के साथ hiPSCs के Immunostaining

नोट: मानक pluripotency एंटीबॉडी के साथ immunostain hiPSCs। एक उदाहरण के रूप में, यहाँ कोशिकाओं डबल दाग एंटीबॉडी एक 1 सतह और एक अनुक्रमिक तरीके से 1 intracellular प्रतिजन को लक्षित रूप में इस प्रकार से हैं: विरोधी स्टेज विशिष्ट भ्रूण एंटीजन-4 के साथ (SSEA4) विरोधी Octamer बाध्यकारी प्रोटीन 4 (OCT- 4) और विरोधी ट्रा-1-60 विरोधी sry संबंधित एचएमजी बॉक्स जीन 2 (Sox2 के साथ) (कृपया एंटीबॉडी जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें)।

  1. कुओं से पीबीएस Aspirate और ट्राइटन X-100 के बिना 500 μL / अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान में जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता तैयार (यहाँ, 1 का उपयोग करें: 200) सतह एंटीबॉडी के लिए, या तो SSEA4 या टीआरए-1-60, ट्राइटन X-100 के बिना समाधान को रोकने में गिराए।
    1. कक्ष स्लाइड के लिए, एक 4 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड के 300 μL / अच्छी तरह से तैयारऊपर समाधान और विरोधी SSEA4 या टीआरए-1-60 प्राथमिक एंटीबॉडी के 1.5 μL अवरूध्द के 298.5 μL मिश्रण से।
    2. coverslips के लिए, समाधान और विरोधी SSEA4 या टीआरए-1-60 प्राथमिक एंटीबॉडी के 1 μL अवरूध्द के 199 μL के मिश्रण से 40 μL / coverslip तैयार करते हैं।
  3. चैम्बर स्लाइड से अवरुद्ध समाधान Aspirate और उचित कुओं में प्राथमिक एंटीबॉडी बांटना। coverslips के लिए, मजबूती से एक पेट्री डिश के अंदर parafilm का एक टुकड़ा डाल दिया है और एक छोटी बूंद के रूप में शीर्ष पर प्राथमिक एंटीबॉडी के 40 μL बांटना। एक तुला सिरिंज सुई और संदंश का प्रयोग, ध्यान से अच्छी तरह से संस्कृति से बाहर coverslip उठा और parafilm पर एंटीबॉडी के ड्रॉप पर यह सेल की ओर नीचे जगह है। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  4. चैम्बर स्लाइड से एंटीबॉडी को दूर करने और पीबीएस में जोड़कर 10 मिनट प्रत्येक, - अगली सुबह, कोशिकाओं 3 बार, 5 धो लें। coverslips के लिए, parafilm बंद हर एक को उठाने और इसे वापस जगह एक 24 अच्छी तरह से थाली, सेल तरफ ऊपर के एक कुएं में। ध्यान से पी जोड़नेबी एस।
  5. अवरुद्ध समाधान में 500: 1 पर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करें।
    1. चैम्बर स्लाइड्स के लिए, तैयार 300 μL / अच्छी तरह से एक 4 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड के बकरे के अवरुद्ध समाधान के 499 μL मिश्रण और 1 μL विरोधी माउस IgG3 एलेक्सा स्त्राव 488 (SSEA4 के लिए) या 1 μL बकरी के विरोधी माउस आईजीएम एलेक्सा स्त्राव से 488 (टीआरए-1-60 के लिए)।
    2. coverslips के लिए, अवरुद्ध समाधान के 499 μL के मिश्रण से 40 μL / coverslip तैयार करने और बकरी के 1 μL विरोधी माउस IgG3 एलेक्सा स्त्राव (SSEA4 के लिए) या 1 बकरी की μL विरोधी माउस आईजीएम एलेक्सा स्त्राव 488 (के लिए 488 ट्रा-1-60 )।
  6. चैम्बर स्लाइड से पीबीएस Aspirate और उचित कुओं में माध्यमिक एंटीबॉडी बांटना। coverslips के लिए, 6.2 कदम के बाद, एंटीबॉडी समाधान 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर parafilm पर रखा पर coverslips पलटना।
    नोट: फ्लोरोसेंट का उपयोग कर टैग किया है माध्यमिक एंटीबॉडी, कोशिकाओं को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए। चैम्बर स्लाइड और coverslips एक अंधेरे वातावरण में रखेंincubations और washes के दौरान ironment।
  7. चैम्बर स्लाइड से एंटीबॉडी को दूर करने और पीबीएस में जोड़कर 10 मिनट प्रत्येक - कोशिकाओं के लिए 5 3 बार धोएं। coverslips के लिए, parafilm से ध्यान से हर एक को उठा और एक 24 अच्छी तरह से थाली, सेल तरफ ऊपर के एक कुएं में वापस जगह है। धीरे washes के दौरान पीबीएस जोड़ें।
  8. दूसरी प्रतिजन के लिए जांच करने से पहले, intracellular Oct-4 या इस मामले में Sox2, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए permeabilization अभिकर्मक (ट्राइटन X-100) के साथ किए गए समाधान को रोकने में फिर से सेते हैं।
  9. Oct-4 या Sox2 के लिए immunostain के लिए, बस कार्यप्रणाली प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी को लागू करने के लिए कदम 6.1-6.6 में वर्णित का पालन करें। 1 में 200 और माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एलेक्सा स्त्राव 594: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, 1 की एकाग्रता में Oct-4 और Sox2 का उपयोग 500।
  10. 10 मिनट प्रत्येक पीबीएस के साथ, और 4 के साथ counterstain '6'-diamidino-2 - उपरोक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी उपचार के बाद, कोशिकाओं 3 बार 5 के लिए धोने-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) मानक प्रोटोकॉल का पालन करता है, तो परमाणु दृश्य वांछित है।

7. देखने के लिए तैयारी

  1. चैम्बर स्लाइड्स के लिए, ध्यान से स्लाइड से ऊपरी सदन को हटाने, निर्माता के निर्देशों का पालन। फिर, आसुत पानी में कुल्ला, और बढ़ते मध्यम और एक coverglass माइक्रोस्कोपी सक्षम करने के लिए जोड़ें।
  2. coverslips के लिए, मध्यम एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर रखा बढ़ते एक बूंद के लिए पर coverslips पलटना।
  3. एक मानक या confocal प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे छवि।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल कैसे मानव IPSCs फीडर परत से फीडर मुक्त करने के लिए शर्तों का तबादला किया जा सकता है, और बाद में प्रचारित एक सीमित ढंग से विशेष pluripotency रखरखाव की पुष्टि के लिए लागत प्रभावी immunocytochemistry सक्षम करने के लिए एक कदम वार विवरण प्रदान करता है। चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है। चित्रा 2A 6 अच्छी तरह प्लेटों में iMEFs पर बढ़ती hiPSC कालोनियों से पता चलता है। इन कालोनियों में परिभाषित सीमाओं और घने चरण उज्ज्वल केन्द्रों के साथ विशिष्ट आकृति विज्ञान दिखा रहे हैं। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2 बी, 12 अच्छी तरह प्लेटों में IPSCs के हस्तांतरण के बाद फीडर मुफ्त की स्थिति, कॉलोनी आकृति विज्ञान कम अलग किनारों के साथ कुछ अराजक प्रकट होता है। इसके अलावा, कुछ iMEFs इस स्तर पर संस्कृति में रह सकती है। चित्रा -2 से पता चलता है कि फीडर से मुक्त प्रणाली में एक अतिरिक्त पारित होने के बाद, IPSC कालोनियों एक उच्च नाभिक के साथ एक क्लासिक monolayer आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने के लिए सीवाईtoplasm अनुपात। इस स्तर पर, यह देखा गया है कि iMEFs लगभग संस्कृति से समाप्त कर दिया गया है।

फीडर मुक्त परिस्थितियों में बढ़ रही कालोनियों यंत्रवत् उठाया जाता है और छोटी बहु अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड या कांच coverslips पर चढ़ाया, और immunocytochemistry के माध्यम से विशिष्ट pluripotency एंटीजन के लिए जांच की। चित्रा 3 प्रतिनिधि कालोनियों कि SSEA4 या टीआरए-1-60 (3 बी, 3F, सतह pluripotency एंटीजन) और Oct, 4 या Sox2 (3 ए, 3E, intracellular pluripotency एंटीजन) के लिए immunopositive हैं दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। iMEF फीडरों से मानव IPSCs संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया वर्णित विधि के कुल मिलाकर स्कीमा फीडर मुक्त करने के लिए संस्कृति और बाद में pluripotency मार्कर के साथ कोशिकाओं की जांच कर रही। iMEF: irradia टेड माउस भ्रूण fibroblast; IPSC: प्रेरित pluripotent स्टेम सेल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. iMEF भक्षण से संक्रमण फीडर मुक्त करने के लिए संस्कृति की स्थिति IPSC कालोनियों के प्रतिनिधि छवियाँ। ए) घने IPSC कॉलोनी (सफेद तीर) iMEF फीडर कोशिकाओं (काला तीर) पर हो। बी) सीरम मुक्त माध्यम में एक मैट्रिक्स लेपित 12 अच्छी तरह से थाली करने पर प्रारंभिक पारित होने के बाद, कुछ अभी भी iMEFs संस्कृति (काला तीर में मनाया जा सकता है)। सी) एक monolayer की विशिष्ट आकृति विज्ञान IPSC कॉलोनी फीडर से मुक्त हो गई। कोई iMEFs इस स्तर पर संस्कृति में रहते हैं। स्केल बार (एसी) = 100 माइक्रोन।> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. छोटे अच्छी तरह प्लेटें में मानव IPSCs मढ़वाया के Immunocytochemical विशेषता। IPSCs के प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों, एक confocal खुर्दबीन के माध्यम से प्राप्त की, सी के साथ pluripotency मार्कर ए) Oct-4 (लाल) और बी) SSEA4 (हरा)) परमाणु दाग DAPI (नीला) के सकारात्मक अभिव्यक्ति दिखा रहा है, और ई) Sox2 ( लाल) और एफ) ट्रा-1-60 (जी के साथ हरी)) DAPI (नीला)। डी और एच एसी और ईजी से संबंधित ओवरले छवियों को दिखाने के। स्केल पट्टी (एएच) = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फीडरों पर रखरखाव के लिए hiPSC मीडिया
अंग शेयर एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
DMEM-F12 / HEPES 100% 80%
नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट 100% 20%
एल Glutamine 200 मिमी 1 मिमी
सदस्य NEAA 10 मिमी 0.1 मिमी
2-मर्केप्टोइथेनाल 55 मिमी 0.1 मिमी
संयोजक मानव FGF-बेसिक 10 माइक्रोग्राम / एमएल 10 एनजी / एमएल
वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला 10 माइक्रोन
फीडर मुफ्त संस्कृतियों के लिए Matrigel कोटिंग
अंग
Matrigel hESC योग्य मैट्रिक्स कमजोर पड़ने कारक 269 μL
DMEM-F12 / HEPES 25 एमएल
नोट: कमजोर पड़ने कारक बहुत कुछ निर्भर है और विश्लेषण के प्रमाण पत्र से पता लगाया जाना चाहिए
फीडर मुफ्त संस्कृतियों के लिए mTeSR1 पूरा मीडिया
अंग रकम
mTeSR1 बेसल मध्यम 400 एमएल
mTeSR1 5x अनुपूरक 100 एमएल
ध्यान दें: एक बार मिला, mTeSR1 पूरा मीडिया aliquots में जमे हुए हैं और जब तक घटक समाप्ति की तारीख में इस्तेमाल किया जा सकता है
नोट: mTeSR1 पूरा मीडिया कमरे के तापमान पर ही गरम किया जाना चाहिए। नहाने के पानी में न रखें

तालिका 1: IPSC संस्कृति मीडिया व्यंजनों और प्लेट कोटिंग्स।

4% paraformaldehyde लगानेवाला
अंग रकम
0.1 एम पीओ 4 बफर 2 एल
Paraformaldehyde, बानगी 80 ग्राम
ट्राइटन X-100 के बिना आईसीसी अवरुद्ध समाधान
अंग रकम
1x फॉस्फेट खारा बफर 49 एमएल
सामान्य बकरी सीरम 1 एमएल
पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार 0.5 ग्राम
ट्राइटन X-100 के साथ आईसीसी अवरुद्ध समाधान
अंग रकम
1x फॉस्फेट खारा बफर 49 एमएल
सामान्य बकरी सीरम 1 एमएल
पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार 0.5 ग्राम
ट्राइटन X-100 200 μL

तालिका 2: लगानेवाला और Immunocytochemistry व्यंजनों।

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Discussion

व्यवस्थित यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक timesaving और लागत प्रभावी तरीका है, एक स्केल नीचे संस्कृति तकनीक के रूप में, विशेष रूप से immunocytochemistry के माध्यम से प्रभावी pluripotency विश्लेषण का समर्थन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

वर्णित कार्यप्रणाली का मुख्य लाभ इस प्रकार हैं। परंपरागत रूप से अधिक से अधिक 3 से 4 अंश फीडर परतों से IPSCs संक्रमण के लिए आदेश अवशिष्ट थोक हदबंदी तकनीक के इस्तेमाल के बाद शेष iMEFs को खत्म करने में और ठेठ monolayer आकृति विज्ञान के लिए फीडर मुक्त करने के लिए संस्कृति की स्थिति 12, 13 प्रकट करने के लिए आवश्यक हैं। इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तुत विधि एक छोटा समय है, जो अपेक्षाकृत जल्दी IPSC कालोनियों के मैनुअल उठा के माध्यम से सीरम मुक्त शर्तों के IPSCs के हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है शामिल है। IPSCs छोटे से कक्ष स्लाइड या immunocytochemistry के लिए अनुकूल coverslips में सीमित मात्रा में उगाया जाता है। वास्तव में, voluअच्छी तरह से प्रति की जरूरत संस्कृति के माध्यम से मुझे सिर्फ 0.5 एमएल है और पतला एंटीबॉडी समाधान के लिए एक एकल coverslip के लिए आवश्यक की मात्रा जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग, साथ ही नाममात्र के रूप में 40 μL या चैम्बर प्रति 300 μL है।

हम पाते हैं कि बराबर भागों iMEF प्रारंभिक पारित होने के दौरान वातानुकूलित mTeSR1 करने के लिए मीडिया (2.5 कदम) के अलावा एक महत्वपूर्ण कदम है कि अस्तित्व और IPSC के pluripotent आकृति विज्ञान के रखरखाव में एड्स। इसके अलावा, अगर सेल पालन passaging के बाद इष्टतम (कदम 2.2, 3.3 और 4.3) नहीं है, समस्या निवारण आगे इस्तेमाल किया हदबंदी बार अनुकूलन के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है।

अंत में, प्रस्तुत छोटे पैमाने पर विधि की एक सीमा है, जब इस तरह से फ्लो के रूप में अन्य तकनीकों की तुलना में भी pluripotency सत्यापित करने के लिए, प्रयोग किया जाता है कि यह बहाव के अनुप्रयोगों के लिए विश्लेषण कोशिकाओं का निरंतर प्रचार के लिए अनुमति नहीं है। हमारे विधि की उपयोगिता अपनी विशिष्ट डिजाइन जो क्योंकि समर्थन से उत्पन्न होती हैटी प्रभावी और नियमित immunocytochemistry के माध्यम से pluripotency की पुष्टि के लिए hiPSCs के कुशल संस्कृति।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-F12/HEPES Life Technologies 11330032
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828028
L-Glutamine Life Technologies 25030081
MEM-NEAA Life Technologies 11140050
2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
Recombinant Human FGF-Basic Cell Sciences CRF001B
Y-27632 ROCK Inhibitor R&D 1254
Collagenase Type IV Life Technologies 17104019
Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277
mTeSR1 Basal Medium StemCell Technologies 05850
mTeSR1 5x Supplement StemCell Technologies 05850
Gentle Cell Dissociation Buffer StemCell Technologies 07174
0.1 M PO4 Buffer In-House n/a
Paraformaldehyde, prill Electron Microscopy Sciences 19202
1x Phosphate Buffered Saline n/a n/a
Normal Goat Serum Life Technologies 16210072
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153
Triton-X-100 Sigma-Aldrich X100
Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb,
Sox2 (D6D9) Rabbit mAb,
SSEA4 (MC813) Mouse mAb,
TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb		 Cell Signaling
Cell Signaling
Cell Signaling
Cell Signaling		 2840
3579
4755
4746		 Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656
Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 Life Technologies A21042
Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 Life Technologies A21151
Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11037
Multiwell Cell Culture Plates Fisher Scientific  0720080/0720081 Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes
Chamber Slides Fisher Scientific  12 565 21 Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes
Coverglass for growth Fisher Scientific  12 545 82 Available in 12, 15, 18, 22 and 25 mm sizes

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 120 IPSC immunocytochemistry pluripotency चैम्बर स्लाइड फीडर से मुक्त coverslip
नियमित Immunocytochemical विशेषता के लिए सीरम मुक्त परिस्थितियों में मानव IPSCs के छोटे पैमाने पर प्रचार
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Corenblum, M. J., Madhavan, L.… More

Corenblum, M. J., Madhavan, L. Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization. J. Vis. Exp. (120), e55260, doi:10.3791/55260 (2017).

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